の収集と分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;師部はEDTA-促進法を用いた滲出

要約

師部樹液の成分だけでなく、そのロードと長距離輸送のメカニズムの知識は、植物の開発とストレス/病原体応答と輸送を同化の長距離シグナルの理解に不可欠である。本稿では、EDTA-促進法を用いて師部滲出液のコレクションを記述します。

要約

植物の篩部は、長距離輸送（写真）だけでなく、生物的または非生物的ストレスを伝えるシグナルのように同化するために不可欠である。これは、糖、アミノ酸、タンパク質、RNA、脂質および他の代謝物が含まれている。師部の構成と機能を理解する上で大きな関心、従って、これらの分子の多くとの役割がありますが、植物の開発やストレス応答におけるその重要性は、まだ決定されていない。師部分析の一つの障壁は時師シール自体が負傷という事実にある。結果として、師部樹液が得られるから植物の数が限られている。追加機器なしで、いくつかの植物種から師部滲出液の収集を可能にする一つの方法は、ここで説明EDTA-促進師滲出コレクションされています。使いやすいであるが、それは細胞の負傷につながる行い、ケア、損傷したセルの内容を削除するために取らなければならない。さらに、いくつかのコントロールが滲出​​液の純度を証明する必要です。それはむしろその内容の唯一の相対定量が発生する可能性が師部樹液（多くの種では不可能）のダイレクト·コレクションより滲出ですので。他のものよりもこの方法の利点は、それが多くの草本又は木本植物種（ シソ 、 シロイヌナズナ 、 ポプラ 、 等 ）で使用され、最小限の機器と訓練を必要とすることができることである。それは、タンパク質、糖、脂質、RNA、ウイルスおよび代謝物のその後の分析に使用することができる浸出液の合理的に大量につながる。それは、両方の研究と同様に教示実験室で使用できることを十分に単純である。

概要

植物は悪条件を逃れるために移動することはできません。従って、それらは、環境ストレスを検出するためのメカニズムを開発誘発し、植物全体に関連する信号を送信し、それに応じて開発を調整しなければならなかった。 2つのトランスポートシステムは、水、栄養素および他の（シグナリング）の化合物の分布が存在する。最初は、木部であり、一般的に工場全体の根に取り込まれた水やミネラルを輸送した。二つ目は師部です。師のビューはシンプル同化輸送システムからのRNA、タンパク質、ウイルス、脂質や他の小分子ための導管に変更されました。それは同化において重要な役割を果たしており、栄養素輸送、生物と非生物的ストレスへの応答、ならびに植物の成長と発展した。それは、今では植物¹⁸の"情報スーパーハイウェイ"と呼ばれています。

師部柔組織、​​並びに特殊なコンパニオンセリウム：師は、いくつかの細胞型から構成されているLLSおよびふるい要素。篩要素は、長距離移動の部位である。遮るもののない縦の流れを可能にするために、ふるい要素は最も小器官と同様、核が欠けているとせいぜい限られた翻訳機構^21、33が含まれていると考えられている。なお、コンパニオン細胞は、タンパク質および師部·ストリームに走行他の化合物を合成すると考えられる。これらの化合物は、次いで、原形質連絡を介して篩要素に搬送され、長距離信号^4,16として機能することができる。

化合物のいくつかのグループは、師の滲出で見つけることができます：

• 糖は、多くの場合、光合成の産物であるとストレージのための植物の他の部分への "エネルギーを運ぶ"分子としてまたはビルディングブロックとして輸送される。しかし、彼らはまた、不凍液として、または化合物のシグナルとして機能することができます。
• タンパク質はまた、師部滲出で見つけることができます。彼らは、代謝酵素を含むが、シグナル伝達機能も持っている。 One examp発達シグナルとして働くタンパク質のLEは、開花の誘導だけでなく、植物の季節的な落葉を通知開花軌跡T蛋白質、です^。6
• 核酸は、mRNA、小さなマイクロRNAを、およびウイルスRNAの形で篩滲出物中に存在する。彼らは主にシグナル^27、28、39に関与するように見える。同時に、ほぼすべてのアミノ酸についてのrRNA及びtRNAをウリ科植物は^、42の篩樹液で観察されている。それらは選択的に篩管システムに転送するように見える。のtRNAは、翻訳装置にアミノ酸を転送する機能のために必要な修正を示しています。しかし、むしろ翻訳に関与するよりも、彼らはこのプロセスを阻害するように見える。代わりに、彼らは、サイトカイニンの源として役立つ、または植物⁴²の代謝状態を通知することができます。
• 脂肪酸、オキシリピン、および他の脂質も篩滲出^{3、13、14、23}で発見されている。 JasmoNIC酸、病原体感染^{22、29、31、32}への応答の一部として、師を通してオキシリピン移動します。最も師脂質の役割はまだ不明であるが、そのうちのいくつかは、おそらく機能^4をシグナリングしている。

植物の師部での作業での課題は、負傷により自体を封印するために、その能力にある。そこに師部滲出液を収集するために使用される4つの主要な方法は、まだ彼らは選択種でのみ動作します：

1）ウリ科植物では、葉柄のカットを介して篩滲出物の合理的な量を得ることができる。損傷菌の汚染との初期液滴が除去されると、それは純粋な師部樹液^1、15合理的に大量に得ることができる。しかし、増加収集時間を、液体クロマトグラフィーアプローチ（未発表）のために、それはますます不向きこの滲出液が厚くなっています。最近の出版物は、種に応じて、この師部樹液がeitheから派生されていることを、示唆しているrは束状（FP）またはextrafascicular師（EP）と、それはふるい素子（FP）から"移動"師部樹液を含まないが、それはまた、木部⁴⁰を含む他の細胞型からの汚染を受けやすい^、41 。

2）第2のアプローチは、茎や葉柄に浅い切り傷や刺し傷を通して師部樹液を得ることである。この方法は、ルピナス^17、25、36ウリ科植物、及びセイヨウアブラナ ¹²に首尾よく使用されている。ここで負傷した細胞からの汚染は最小限であり、非常に純粋な滲出。しかし、植物はそれを非常に選択的に穿刺だけふるい要素に挑戦しているので、健康でよく骨抜きにする必要があります。木部血管がニックしている場合は、すべての滲出液が木部流に引き込まれる。これは非常に壊れやすい、または非常に木質化葉柄や茎の植物には不向きの方法になります。

3）アブラムシstylectomyはアブラムシがふるい要素に自分のスタイレットを挿入することができますnは、レーザーでアブラムシを取り除く。師部樹液は、残りのスタイレット^{2、9、10、35、38}を通って染み出している。理論的には、アブラムシによって感染することができる任意の植物が、このアプローチを用いることができる。しかし、ほとんどの温室または成長室マネジャーは、病原体の使用をサポートしていません。また、アブラムシは、彼らの唾液^19、33と師部にいくつかのタンパク質を導入する。これは^、30を再プログラム限定転写につながると師部構成^26を変更する可能性を秘めている。

4）ここに記載されている方法は、師部樹液のEDTA-促進滲出です。この方法は、師部²⁰の封止を防止するためにEDTAを用いている。 EDTAは、Ca ^{2 +}さもなければ師部をシールするプロセスに参加するイオンをキレート。 EDTAは、細胞傷害³⁰に導くことができるが、いくつかのグループは、セルの微細構造またはphloeは20 mMまでこの方法を使用し、10mMのEDTAから濃度の有害な影響は観察されなかったMロードと輸送^5、24。任意の損傷効果並びにクロマトグラフィー及びゲル電気泳動によるEDTAの干渉を低減するため、植物は1時間後に水中に移動され、滲出液のみを保存部¹⁴は、 ^使用される。したがって、むしろEDTAに滲出より、師部、水（EDTA-促進滲出）にexudatedされています。それは師部滲出液の収集のためのストレートフォワード、低コスト、ローテクな方法である。篩樹液この方法は、タンパク質、小分子、脂質、およびRNAを分析するために使用して得られる多くの植物において成功裏に使用されている。実験の限られた量の単子葉植物¹¹で実行されているが、この方法は、双子葉植物（ シソ ^17、20、 シロイヌナズナ ^{8、13、14、} ポプラ ^7）に対してより適切であると思われる。滲出液の収集が蒸散を介して排出物の損失を避けるために湿度の高い環境で発生する必要がある。植物に応じて、1〜2時間のためにEDTAでインキュベーションです師部/ふるい素子の封止を防止するのに十分。コレクションは、その後水に発生することがあります。これは、EDTAは、セル構造および安定性に及ぼす負の影響を防ぐ利点を有する。また、HPLCまたはSDS-PAGEのような方法でEDTAの干渉を排除。それがシロイヌナズナに適用されることが示されている。大きい植物のため、EDTAおよび滲出コレクション内のインキュベーションがスケールアップするとビーカーではなく1.7ミリリットル反応チューブで実行されています。

プロトコル

1。植物の作製

1. シロイヌナズナの種子を直接土の上またはMSプレート上で発芽することができます。 12時間日長（22℃の日、15℃夜^14）とグロースチャンバーで4〜6週間のために植物を育てる。週に二度に一度水草。水やりのために下部トレイを使用してください。上から水植物をしない、トレイは再散水前に乾燥することができます。収穫時の植物は十分な水分補給であることを確認してください。

2。ソリューションおよび料理の準備

1. K _2-EDTA溶液：冷蔵庫に保管することができます100 mMのK _2-EDTA溶液の原液を作る。コレクション当日は、1〜5人が（一部EDTA溶液で4部の水）の20mM K _2-EDTA溶液を得るために解決策を希釈。
2. 途中の20mM K _2-EDTA溶液を用いてガラスやペトリ皿（直径7〜15センチメートル）を記入してください。 EXのためにさまざまな治療法（からサンプルを収集した場合十分な制御および塩ストレス植物や異なる遺伝子型）が、それぞれの治療のために別々の料理を準備。
3. 20mMのK _2-EDTA溶液1.4 mlの1.7ミリリットルの反応管の所望の数を埋める。脱イオン水またはミリポア水をオートクレーブ1.4ミリリットルとの反応管の等しい数を記入してください。
4. 上の植物を設定するベンチにペーパータオルを入れて、一つの新しいカミソリの刃を取得し、手袋を着用。

3。師部滲出液のコレクション（ 図1のフローチャートに示すように）

1. 収穫ロゼットはロゼットの中心葉柄近くの根元にカミソリの刃でそれらを切断することによって四から六週齢の植物から離れる。
2. 直ちに20 mMのK _2-EDTAを含む皿に葉を配置。葉柄の切り口が（ 図2）を溶液中に浸漬されていることを確認します。
3. かつて15葉が優しくお互い例えば、tの上に葉を積み重ね、（約三から四植物）収集されている帽子切断葉柄は、互いに整列される。葉柄の基部（約1mm）で再編集し、直ちに20mMのK _2-EDTA溶液で反応管の一つにリーフを移す。彼らは少しロールアップされた場合の葉は最も簡単にフィットします。これは、細胞の損傷を引き起こす可能性があるために葉を絞る避ける、したがって、葉の細胞のコンテンツのコレクションにつながる。
4. より多くの材料が必要な場合は、緩やかに湿紙タオルでサンプルを覆う。もし別の治療や遺伝子型からのサンプルの収集のために料理の新しいセットを使用してください。
5. 一度にすべてのサンプルを反応管に配置され、暗闇の中で、光のいずれかで滲出液を収集します。
6. 暗い、ライン湿紙タオルを持つ大規模な浅い皿の床で収集のため。湿ったペーパータオルで皿どちらカバーに葉を充填した反応管でラックを置いたり通気用スリットを黒いプラスチックバックに入れた。キャビネットや暗い部屋で全体のセットアップを置き。
7. 光でコレクションのために、湿ったペーパータオルで明確なプレキシガラス容器の底を並べる。コンテナ内の葉に満ちた反応チューブでラックを配置し、それを閉じます。
8. 1時間後、削除は、コンテナと反応管からそっと出て、すべてのEDTAを除去するために、蒸留脱イオン水またはミリポア水で十分に洗い流してください。このステップは、次の3つの目的があります（1）（2）それはSDS-PAGEおよびクロマトグラフィーEDTAの干渉を排除し、細胞への最小限に被害にEDTAを除去し、（3）カット/損傷から蓄積された任意の化合物を除去し細胞。直ちにオートクレーブ水を含有する調製した反応管に移し、滲出液の収集のための加湿コレクション容器に戻す。滲出液のRNAの抽出のために使用する必要がある場合、この時点で、RNase阻害を追加します。オプション：タンパク質分析が所望される場合プロテイナーゼ阻害剤を添加することができる。
9. 意図された収集時間の後、引き出し、discaRD葉とさらに使用するための液体N ₂で師部滲出液を凍結。拡張ストレージが必要な場合は、-80サンプルと店舗℃で凍結乾燥
10. シロイヌナズナの場合には、代謝産物は既に1時間、排泄物の収集後に検出することができる。少ない豊か成分の分析が計画されれば、5-8時間、コレクションがお勧めです。 シソのような大規模な工場では、より長い収集時間（8時間）が推奨されています。
    15葉から収集された滲出液は、mRNA抽出のためのSDS-PAGEゲル（タンパク質）、GC-MS（糖及び代謝物）で1車線のため、通常は十分です。脂質分析のために2-3のサンプルのプーリングは（30-45葉から滲出液）が推奨されており、明確な結果につながる。

4。その後の分析では、（ビデオのために我々は4.4のみを表示）

1. タンパク質解析のために、15μlの水と30μlのLämmliバッファ内の再懸濁したサンプルは、95〜熱が℃で5分間、すぐに任意の電話をスピンダウンrecipitatesとSDS-PAGEゲル（45μlのローディングポケット）に試料全体をロードします。タンパク質量が非常に低いので、サンプルはコロイドクマシーや他の敏感な汚れで染色されるべきである。
2. 文献¹⁴に記載されているように砂糖と小さな代謝産物解析のために、乾燥した試料を誘導体化エージェントを追加。
3. mRNAをRT-PCR、マイクロアレイ又はRNA-配列分析を用いて分析することができる。
4. 次のようにドラフトでメタノール（1:1）：各サンプルにメタノール、数秒間ボルテックスし、4分間遠心：クロロホルムの等量を追加直ちに脂質分析クロロホルムに対するプール二から三のサンプルとパーティションを用400 x gで。テフロンキャップと上相と繰り返しパーティション3倍以上とガラス管の下側（有機相）を収集します。 N ₂気流下で合わせた有機相を乾燥し（薄層クロマトグラフィー、さらなる分析に提出：TLC ^14、37、液体クロマトグラフィー-質量分析：LC-MS ^14）。

結果

それは師部樹液の複雑さが植物が最適な応答を発達やストレス信号を変化させ送信方法の質問への答えであることが過去数年にわたって明らかになってきた。 EDTA-促進師部滲出を使用すると、他のアプローチに適していない、経済的又は生理学的興味のある植物から篩滲出物を分析する機会を提供することができる。

この方法は、 師部に局在するタンパク質を同定、開発やストレス（ 図3）に応答してレベルの変化を検出するのに十分な篩滲出物の収穫を可能にする。図に示すように、タンパク質は、まだ、非常に低濃度であるのレベルはLC-MS/MSを用いて後続のプロテオミクス実験のためにまたはウェスタンブロット分析のために十分に高い。ウリ科植物における知見は、茎の切削水ポテンシャルバランスの崩壊とそれに続く水の流入につながることを示唆しているとアポプラスト⁴¹から可能な汚染物質。まだ一から八時間に至るまでの時間は、 シロイヌナズナにおける師部タンパク質プロフィール/組成（唯一絶対量がGuelette ら異なります ）には影響しませんのために収集、タンパク質の量が収集され、見つかったタンパク質のパターンは、種（ シロイヌナズナの間で異なります。 シソ 、レーンIおよびNI）とトリートメント（別の日の長さで成長シソ 、レーンIおよびNI）で。結果タンパク質性信号を可視化することができるように、同定し、続いた。

mRNAおよびマイクロRNAは 、この方法によって篩滲出物において同定することができる。しかし、RNアーゼ阻害剤による治療は、拡張滲出時にmRNAの分解を防止する必要がある。師部を公知の間に篩要素は、機能葉、ルビスコ小または大サブユニットを含んでいないので（赤血球又はRBCL、それぞれ）mRNAは、ネガティブコントロールとして使用することができるローカライズされたユビキチン結合酵素等のmRNAは陽性対照（ 図4）として用いることができる。

同様に、 糖または小代謝産物は GC-MS又はLC-MSのいずれかを使用して分析することができる。ここでは、篩滲出物がほぼ全解糖経路¹²を含む機能性酵素を大量に含んでいることに言及すべきである。したがって、いくつかの時点を使用すると、滲出液収集時代謝過程を明らかにすることができる。例を図5に示されている：全滲出物において、スクロースが最も豊富な代謝産物であるが、これは1時間回収した後に最も明らかである。しかし、5時間後に比率をフルクトースへのショ糖はわずかに減少している。同じ滲出液が一時間のために収集し、次の4時間ベンチに放置すると、比をフルクトースへスクロース師に積極的に酵素は部屋の温度でのショ糖の分解につながる滲出ことを示唆し、はるかに大きい程度に低減され温度（もっとピークの解釈のために^14を参照）。これは、システムがその活力^34を失うまで師のロードとふるい要素に伴細胞から分子の輸送が滲出中に続けることが調査結果と一致している。

師部滲出液中の脂質とは、拡張子によって、長距離脂質シグナリングは、植物科学への関心のかなり最近のフィールドである。その疎水性の性質に起因する脂質低濃度でしか存在しており、可溶化のための他の分子に結合することができる。まだ十分な材料の収集は視覚化するために、EDTA-促進滲出により（TLC; 図6）と（LC-MS、 図7）を識別する、いくつかの植物種から師部脂質を。同図が示すように、それはいくつかの脂質種を識別し、分離することが可能である。 LC-MSは、異なる脂質種を識別し、differeに脂質プロファイル内の変更を監視することができNT遺伝子型や治療。これは植物の開発やストレス応答時の脂質の役割の研究を可能にします。

シロイヌナズナやシソの師部滲出のコレクションの1。フローチャート図 。異なる経路は青色で示されている異なる最終製品につながる。 RNA、RNA分解酵素阻害剤（100 U / mlの、ロシュ）を調製するための篩部滲出液を収集するに水に添加される。
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図2。収集師部滲出液のための材料のセットアップイオン。セットアップは、プロトコル手順3.1から3.4に必要なすべての資料が表示されます。
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図3師の二つの異なる植物種の滲出、 シロイヌナズナ （AT）とシソ （IおよびNI、別の日の長さ）で見つかったタンパク質MW：分子量マーカー（レーン2）。タンパク質は、10〜20％勾配SDS-PAGEを用いて分離した。
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図4。分析ルビスコ小と大サブユニット（それぞれ赤血球とRBCL、）とユビキチン結合酵素（UBC）のmRNAの存在。 mRNAはシロイヌナズナの葉（L）、葉柄（P）、および師部の滲出液（PH）から収集された、PCRを用いて可視化した転写および特定の転写産物を逆転。図はGuelette らから変更されました^。14。
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師部の図5。GC-MSプロファイルは倍の量が異なるために収集滲出。収集時間の5時間（B）〜1時間コレクション（）から蔗糖変更の方法相対量に注意してください。室温で "インキュベーション"に続いて1時間採取後のプロファイルを滲出 4時間温度（RT）（C）。葉の代謝物プロファイル（D）。
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図6。 シソ （左）とシロイヌナズナ （右）の葉と師部の滲出液から脂質を比較薄層クロマトグラム。アスタリスクは、師部滲出液のための特定の脂質を示す。 DGDG：digalactosyldiacylglycerol; PG：ホスファチジル; MGDG：monogalactosyldiacyglycerol; シロイヌナズナ脂質を表示する数字の一部がGuelette らから変更されている^14。
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図7 LC-MS /陰イオンモードを用いたシロイヌナズナの師部の滲出液（クロロホルム相）の脂質プロファイル。上部のグラフ（変異体）、および底部（野生型、B）は、2つの異なる遺伝子（矢印で示す）との間の脂質プロフィールの違いを示す。
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ディスカッション

師滲出物のEDTA-促進コレクションは、非常に単純で最小限の装備を必要とし、ほとんどの植物に適用することができる。全体的に、この方法はより種から篩排出物を分析する能力を拡張する。滲出液が希釈されているが、それは多くの異なるサンプルを収集したり、多くの植物から材料を多量にスケールアップすることは容易である。そして、これは非常に低濃度であり、見過ごされる新規な化合物の検出を可能にする。

この方法は、複数の植物種に使用され、この原稿に記載されているものについて説明したように動作することができる。新しい種が模索されている場合は、変更を必要とするかもしれない二つの側面は、使用される葉や滲出の時間数です。ほとんどの場合、七時五十五時間滲出は適していなければならない。プロトコル部分で説明したように新たな植物種で、この方法の使用を確認するために、滲出液を収集する必要があり、その後の分析の一つ以上のnは4実行されるeeds。観測された信号の強度に応じて、回収量がスケールアップする必要があるかもしれない。前者は師部滲出液の少ない豊富であるため、一般的には、脂質やタンパク質分析は、砂糖及び代謝物の分析よりも、より多くの材料が必要になります。

EDTA-促進滲出コレクションは切断面と同様に、EDTAの潜在的に有害な効果を伴うため、いくつかの点を考慮する必要があります：（1）EDTA、1時間インキュベートした後、葉柄は、十分に洗浄しなければならない。これは、細胞を損傷または抽出を妨げる可能性が傷ついた細胞から得られた任意の化合物と同様にEDTA自体を削除します。 （2）正と負のコントロールが得られたデータは、師部樹液からではなく怪我細胞（以下の重要なステップを参照）に由来していることを確認するために含まれる必要があります。 （3）師部樹液が滲出液収集時にアクティブにすることができるいくつかの酵素が含まれていません。したがって、いくつかのケースでは、foのを収集するために有用であり得る時間のrは異なる量。 （4）水に滲出を関与方法なので、化合物の絶対的な定量化はできません。

重要なステップ：任意のセルを傷つけるだけでなく、適切なコントロールの使用など（。リファレンスを参照^14）ではないために、サンプルの処理中に、このメソッドが正常に使用するための鍵は、注意を使用することである。一つの適切なコントロールは、EDTAとの事前処理なし師部滲出液のコレクションです。このケースでは師部自体を封印され、全く滲出液を採取することはできません。傷ついた細胞に由来する任意の汚染物は、ここで検出されます。第二の制御は、滲出液中の糖の分析であろう。 シロイヌナズナでは、ショ糖は1:4 1：08（REF ^8、14）の間でのショ糖比は果糖で、師部樹液内で優勢な代謝物であるべきである。

RNA抽出のためにRNアーゼ阻害剤の使用が必要である。加えて、以前にdescribとの陽性対照ED師部局在するmRNA（UBC9：ユビキチン結合酵素^{9、At4g27960、8、14）}と例えばの負の制御葉緑体mRNA（ルビスコLSU）がお勧めです。

滲出液は、活性酵素が含まれているため、時間の経過は、師部プロファイルに必ず変更を行うことをお勧めします単に収集時間の変動によるものではない。いくつかのケースでは、プロテイナーゼインヒビターを使用することが有益であり得る。しかし、研究者は、収集した滲出液を濃縮し、任意の追加された化合物は、主に集中されることされることを、心に留めておく必要があります。プロトコル内の第2の重要なステップは、EDTA下葉柄のrecuttingです。このステップでは、二重の目的を果たす：こうして師部樹液の自由な流れを可能にする新しいプラグの形成を防止しながら、まず、任意の密封されたふるいプレートを除去します。第二に、カットしながら生成された木部にキャビテーション気泡を除去し、これにより木部輸送を可能にします。第二の切り込みのサイズが決まる使用植物のS。大きな葉柄 ​​と植物では、それが最初のカット、上記の数ミリ（最大1 cmまで）でなければなりません、 シロイヌナズナなどの植物では,1-2 mmと十分です。

この方法の使用は、発達や医学の影響をシグナリングしている可能性が師部滲出液における新規化合物の発見につながることができます。それは師部へのアクセスの欠如に起因する植物科学内で少し研究された分野であった長距離脂質シグナリング、でより綿密な外観を求めている。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2-EDTA	Sigma-Aldrich	ED2P-500G
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15cm)	PYREX or Corning		Any clean, shallow dish will work
Chloroform	EMD	CX1054-1	Only open containers in fume hood
Methanol	J.T.Baker	9070-03
Screw cap tubes	VWR International	53283-800
Screw cap tubes	Sun Sri	13-425
Eppendorf tubes	Denville	C2170