التعبير عن المؤتلف وظيفية راصة دموية والبروتينات النورامينيداز من الفيروسات الأنفلونزا H7N9 رواية باستخدام نظام التعبير الفيروسة العصوية

Summary

نحن هنا تصف طريقة للتعبير عن مستضدات سطح فيروس الانفلونزا مطوية بشكل صحيح وظيفية المستمدة من فيروس H7N9 الصينية الرواية في خلايا الحشرات. تقنية يمكن تكييفها للتعبير عن ectodomains من أي البروتينات السطحية الفيروسية أو الخلوية.

Abstract

نظام التعبير الفيروسة العصوية هو أداة قوية للتعبير عن البروتينات المؤتلف. نحن هنا استخدامه لإنتاج نسخ مطوية بشكل صحيح والغليكوزيلاتي من الأنفلونزا فيروس بروتين السطح - على راصة دموية (HA) والنورامينيداز (NA). كمثال على ذلك، اخترنا HA و NA البروتينات التي أعرب عنها فيروس H7N9 الرواية التي ظهرت مؤخرا في الصين. ومع ذلك البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لHA و NA البروتينات التي أعربت عنها أي الأنفلونزا الأخرى وسلالات الفيروس (ب). المؤتلف HA (رحه) وNA (RNA) والبروتينات هي الكواشف هامة لفحوصات المناعية مثل ELISA ELISPOT و، وأيضا في استخدام واسع لتوحيد اللقاح، واكتشاف الأجسام المضادة، والعزلة وتوصيف. علاوة على ذلك، جزيئات NA المؤتلف يمكن استخدامها للكشف عن مثبطات جزيء صغير ومفيدة لتوصيف وظيفة الأنزيمية للNA، وكذلك حساسيتها للمضادات الفيروسات. البروتينات HA المؤتلف أيضا باياختبار لقاحات تجريبية نانوغرام في النماذج الحيوانية، وتم الترخيص لقاح استنادا المؤتلف HA مؤخرا من قبل ادارة الاغذية والعقاقير للاستخدام في البشر. طريقة وصفنا هنا لإنتاج هذه الجزيئات هو مستقيم إلى الأمام، ويمكن أن تسهل البحث في مختبرات الأنفلونزا، نظرا لأنه يسمح لإنتاج كميات كبيرة من البروتينات بسرعة وبتكلفة منخفضة. على الرغم من هنا ونحن نركز على بروتينات سكرية سطح فيروس الانفلونزا، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم أيضا لإنتاج غيرها من البروتينات السطحية الفيروسية والخلوية.

Introduction

كرد فعل أول من ظهور الأخيرة من إنفلونزا H7N9 سلالة الفيروس رواية في الصين، ونحن اكتسبت البلازميدات تحمل تسلسل الجيني لراصة دموية (HA) والنورامينيداز (NA) جينات العزلات الأولين. باستخدام هذه البلازميدات كنا قادرين على بناء ناقلات التعبير baculoviral بسرعة لإنتاج المؤتلف HA و NA في خلايا الحشرات. تم تأسيس هذا النظام التعبير بشكل جيد في مختبرنا وأثبتت محوريا في العديد من مشاريعنا البحثية الجارية ^1-8. خلايا الحشرات قادرون على أضعاف بشكل صحيح وبعد translationally تعديل البروتينات المعقدة. وتشمل هذه التعديلات ارتباط بالغليكوزيل N-مرتبط، وهو أمر مهم بالنسبة للعديد من البروتينات السكرية الفيروسية. على هذا النحو، فإنه ليس من المستغرب أن نظام الفيروسة العصوية يتم تأسيس جدا للتعبير عن مستضدات سطح فيروس الأنفلونزا. في الواقع، فإن العديد من هياكل الكريستال HA و NA تم حلها باستخدام الخلايا أعرب بروتينات الحشرات ^9-11. ميزة أخرى للالنظام تكمن في موثوق عوائد عالية من البروتين تصل إلى 30 ملغ من خلية ثقافة HA / L (بناء على خبرتنا مع أكثر من 50 البروتينات HA مختلفة) - نتيجة لفيروس العدوى التعبير طردوا من المروج polyhedrin قوية.

إزالة الغشاء وendodomain من HA و NA البروتينات يسمح للتعبير عن الإصدارات secretable قابلة للذوبان من البروتينات، وبالتالي يسهل كثيرا من عملية تنقية. بالإضافة إلى ذلك، هذه ectodomains يتم hexahistidine الموسومة، وبالتالي يمكن تنقيتها باستخدام تقارب اللوني باستخدام ني ^{2 +} الراتنج. المجالات عبر الغشاء من HA و NA البروتينات تسهم في homotrimer وتشكيل homotetramer، على التوالي. من أجل الحفاظ على هذه oligomerizations، ونحن إضافة trimerization المجال C محطة لHA-، وtetramerization المجال-N محطة ليبني NA (الشكل 1). أظهرنا بشكل قاطع أن هذا المجال trimerization استقرار وظيفي، العواقبrved الحواتم بتكوين على ساق المجال من HA ^1. وtetramerization الصحيح للNA قد تسهم أيضا في تصحيح للطي وظيفة NA ^10. يمكن طلب متواليات وناقلات baculo نقل إيواء trimerization أو tetramerization المجالات من المؤلفين أو من غيرها من المختبرات في هذا ^{المجال، 9،10،12.}

مسألة هامة أخرى للتعبير عن البروتينات في الخلايا تفرز الحشرة هو اختيار خط الخلية اليمنى. بينما تستمد ورق القطن frugiperda خلايا Sf9 الفيروسة العصوية دعم النسخ المتماثل بشكل جيد للغاية، وتستخدم عموما لإنقاذ الفيروس وانتشار، فقد القدرة على إفراز كميات كبيرة من البروتين محدودة. المستمدة Trichoplusia ني BTI-TN-5B1-4 خلايا (المعروف باسم ارتفاع خمسة) لديها قدرة أعلى وإفراز هي خط خلية من خيار للتعبير في هذا البروتوكول ^13،14. وعلاوة على ذلك، فإنه من المفيد لخفض أو حتى إزالة مصل بقري جنيني (الفيس بوكS) من ثقافات التعبير. لذا فإننا استخدام وسائل الإعلام مع انخفاض (3٪) المحتويات FBS لنمو مخزونات فيروس العمل، ونحن أداء التعبير البروتين في وسائل الإعلام الحرة في المصل.

وتستخدم المؤتلف HA و NA البروتينات المناعية لكثير من التقنيات. ربما كان أكثرها شيوعا هو في فحوصات ELISA لقياس تحويل مصل التطعيم على في البشر أو الحيوانات ^4،6،7،15. وقد وتستخدم أيضا الوافدين الجدد في المقايسات ELISPOT على حد سواء جزيئات تنشيطية والكواشف كشف عن الأجسام المضادة إفراز الخلايا ^16. استخدامهم الطعوم الجزيئية تسمح لفرز خصيصا لplasmablasts أو أنواع أخرى من الخلايا البائية التي يمكن استخدامها لعزل (العلاجية) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (MABS). وكذلك تستخدم المؤتلف HA و NA الجزيئات في توصيف هذه MABS ^8. ومن الأمثلة الأخرى دراسة استقرار درجة الحموضة أو مستقبلات خصوصية قد أعربت عنها عزلات فيروس مختلفة، أو تقييم كمي NA الأنزيمية محددةالنشاط أو مقاومة للمثبطات. علاوة على ذلك، المؤتلف، HA تنقيته يمكن استخدامها لتوحيد المحتوى HA لقاحات فيروس الأنفلونزا المعطل.

الأهم من ذلك، رحه (وإلى درجة معينة NA) ويجري حاليا اختبار اللقاحات المرشحة في النماذج الحيوانية وتجارب اكلينيكية على البشر مع المرشح لقاح واحد يجري ومرخصة من قبل ادارة الاغذية والعقاقير في عام 2013 ^2،17-19. في الاستفادة من هذه اللقاحات الرواية هو أنه، نظرا لطبيعة المؤتلف من هذه البروتينات، يمكن تجنب عملية كثيفة العمالة من توليد النمو المرتفع الفيروسات المتفارز. ربما أكثر أهمية هو حقيقة أن العائد HA لاعبيها عالية واستنساخه من سلالة إلى سلالة. أيضا، منذ ويتم إنتاج هذه اللقاحات في نظام خالية من البيض، وأنها لا تحتوي على الملوثات البروتين التي هي مشكلة بالنسبة للأشخاص الذين يعانون من الحساسية البيض.

نحن هنا اختار للتعبير عن HA و NA البروتينات من العزلات اثنين من الصينيين فيروس الانفلونزا H7N9 الرواية، A / آنهui/1/13 وA/Shanghai/1/13 ^20،21. هذه أمثلة في الوقت المناسب، ولكن وصفها بروتوكول يمكن استخدامها للتعبير عن أي وباء الأنفلونزا A HA NA أو البروتينات ويمكن تكييفها للتعبير عن أي البروتينات الفيروسية أو الخلوية يفرز الأخرى. يمكن استنساخ البروتينات عبر الغشاء مثلوثي أو رباعي القسيمات في أشرطة التعبير المستخدم لHA و NA، على التوالي. ومع ذلك، يفرز معظم البروتينات الخلوية القابلة للذوبان، مثل إنترفيرون على سبيل المثال، لا تحتاج إلى مجال إضافية لتحقيق الاستقرار ويمكن التعبير عنها فقط مع علامة hexahistidine-C المحطة.

Protocol

1. توليد المؤتلف الفيروسة العصوية

1. الاستنساخ في نقل الفيروسة العصوية-البلازميدات
   1. استنساخ H7 HA NA وN9 ectodomain (أو أي HA NA أو الجينات الأخرى) إلى تعديل البلازميدات نقل pFastBac (انظر المقدمة). ناقلات لHA يحتوي على نطاق trimerization-C محطة وعلامة hexahistidine، فضلا عن NA تحتوي على مجال tetramerization N-محطة وعلامة hexahistidine، وقد وصفت ^{1،10،11،22} (الشكل 1)، ويمكن أن يطلب من المؤلفين.
      مذكرة تفسيرية: سيتم طيها ectodomains HA أعرب بدون مجال trimerization بشكل غير صحيح، مما يؤدي إلى فقدان الحواتم تحييد متعلق بتكوين جزئي، وخاصة في المجال ساق. وبالمثل، تعتمد وظيفة الأنزيمية NA على tetramerization المناسبة.
   2. جيل من bacmids
      تحويل نقل-البلازميدات تحتوي على الفيروسة العصوية HA و NA الجينات في البكتيريا وفقا DH10Bac باستخدام التعبير الفيروسة العصويةنظام فقا لتعليمات الشركة الصانعة. عزل وتنقية bacmids استخدام عدة Midiprep وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (الشكل 2).
2. إنقاذ الفيروسة العصوية المؤتلف والتحقق من البروتين التعبير
   مذكرة تفسيرية: الخطوات التالية يجب أن تؤديها في جو معقم و مطهر غطاء تدفق الصفحي. تنفيذ هذا الإجراء بشكل مستقل عن HA و NA (أو أي الجينات الأخرى ذات الاهتمام). عادة ما تزرع خلايا الحشرات عند 28 درجة مئوية دون CO _2. تزرع الخلايا Sf9 لهذا البروتوكول بالكامل تنم-FH سائل الإعلام خلية الحشرات تستكمل مع FBS 10٪، 1٪ القلم بكتيريا ^* و0.1٪ محلول F68 بلورونيك، إذا لم يذكر خلاف ذلك، وpassaged 1:04 مرتين في الأسبوع. وتزرع خمسة خلايا عالية في المصل وسائل الإعلام الحرة وSFX passaged 1:15 مرتين في الأسبوع.
   ^* ينبغي النظر في إضافة المضادات الحيوية في جميع أنحاء بروتوكول اختياري وتعديلها وفقا للممارسات المستخدمة في كل مختبر.
   1. لوحة خلايا الحشرات Sf9 في 6 لوحات جيدة في كثافة 2 × 10 ⁵ خلية / سم ² وترك الجلوس لمدة 20 دقيقة في حاضنة 28 درجة مئوية (دون CO _2).
   2. خلط 2 ميكروغرام (conc. 0.5-2 ميكروغرام / شباط) من bacmid المؤتلف مع 100 ميكرولتر من تنم-FH المتوسطة (المصل مجانا، 1٪ القلم بكتيريا). مزيج 6 ميكرولتر من وكيل ترنسفكأيشن مع 100 ميكرولتر من تنم-FH المتوسطة (المصل الحرة، القلم بكتيريا). الجمع بين مجلدين، مزيج بلطف وترك الجلوس لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (خليط ترنسفكأيشن). وتشمل همية ترنسفكأيشن واحد عن السيطرة (الشكل 3).
   3. إزالة طاف من خلايا Sf9 مطلي (الخلايا سوف الآن التمسك لوحة) واستبدالها مع 2 مل من المصل خالية المتوسطة تنم-FH تحتوي على بكتيريا القلم (1٪). إضافة مجلد كامل من خليط ترنسفكأيشن (من الخطوة 1.2.2) والصخور لوحة 6 جيدا لمدة 5 ثوانى بعناية. احتضان في حاضنة 28 درجة مئوية دون CO ₂ لمدة 6 ساعة (الشكل 3).
   4. استبدال واي وسائل الإعلامعشر وسائل الاعلام تنم-FH كامل الطازجة (تحتوي على 10٪ FBS، 1٪ القلم بكتيريا و 0.1٪ F68 بلورونيك). احتضان في حاضنة 28 درجة مئوية دون CO ₂ لمدة 6 أيام. تحقق الخلايا أحيانا تحت المجهر. وعادة ما تظهر الخلايا المصابة أكبر، مستدير، وتوسيع النوى، والبدء في فصل (الشكل 4).
   5. حصاد الخلايا والتأكد من البروتين التعبير
      1. خلايا الحصاد 6 أيام آخر ترنسفكأيشن بواسطة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يحتوي طاف على الفيروسة العصوية المؤتلف - وسوف تستخدم لتوليد هذه الأسهم تعمل على الفور، أو يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة سنة.
      2. للتحقق من بروتين تعبير جمع الكريات و resuspend في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. مزيج 50 ميكرولتر من تعليق مع 50 ميكرولتر من العازلة SDS-PAGE التحميل (التي تحتوي على عامل مختزل). تشغيل SDS-PAGE وإجراء تحليل لطخة غربية مع الأجسام المضادة لمكافحة hexahistidine لتأكيد التعبير الجيني. وتشمل الخلايا من وهميةترنسفكأيشن كما الضوابط السلبية (الشكل 3).
   6. إعداد مخزونات العمل
      1. لوحة 5 × 10 ⁵ خلايا Sf9 / سم ² في T175 سم ² قارورة وترك الجلوس لمدة 20 دقيقة يسمح لهم نعلق على طبق. استبدال وسائل الإعلام كاملة تنم-FH مع وسائل الاعلام تنم-FH تحتوي على 3٪ FBS (و 1٪ القلم بكتيريا، 0.1٪ F68 بلورونيك).
      2. تصيب الخلايا مع 100 ميكرولتر من طاف الانقاذ. احتضان في حاضنة 28 درجة مئوية دون CO ₂ لمدة 6 أيام وأحيانا إذا تحقق الحصول على الخلايا المصابة (كما هو موضح في الخطوة 1.2.5).
      3. تدور في 2،000 XG في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، وجمع طاف. هذا هو الآن P2 الأسهم الخاصة بك. ويمكن تخزين هذه الأسهم إلى أجل غير مسمى في 4 درجات مئوية. كرر الإجراء العدوى باستخدام 100 ميكرولتر من الأسهم P2 لتصيب الخلايا. يسمى الأسهم الناتجة P3 أو الأسهم العاملة، والتي يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية أو استخدامها مباشرة للتعبير البروتين. الأسهم P3 عادة ما تحتوي على 10 <سوب> 7 -10 ⁹ البلاك تشكيل وحدة / مل.

2. التعبير البروتين وتنقية

مذكرة تفسيرية: خلايا Sf9 دعم نمو الفيروسة العصوية بشكل جيد للغاية. ومع ذلك، قدرتها على إفراز كميات كبيرة من البروتين المؤتلف محدودة. لذا نستخدم خط آخر الحشرة الخلية، خمسة خلايا ثانوية، للتعبير عن البروتينات المؤتلف يفرز. هذه الخلايا لا تدعم النسخ المتماثل الفيروسة العصوية إلى التتر عالية جدا ¹³ ولكن لديها قدرة عالية إفرازية.

1. يشبون خمس خلايا عالية
   تنمو الخلايا عالية في خمسة SFX خلية الحشرات مستنبت في T175 سم ² القوارير. مرور كل يوم 01:03. للثقافة 200 مل التعبير سوف تحتاج لزراعة 5 قوارير متموجة.
2. حصاد واصابة خمسة خلايا عالية
   1. فصل خمسة خلايا عالية من 5 T175 سم ² قوارير من خلال الاستفادة من القوارير مع يدك. جمع suspe الخليةnsion ونقل إلى 50 مل أنابيب الطرد المركزي.
   2. تدور في 1،200 x ج لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف بواسطة الصب وتوحيد الكريات عن طريق إعادة التعليق عليها في 15 مل من الأسهم P3.
   3. اسمحوا الجلوس لمدة 15 دقيقة في غطاء تدفق (الشكل 5).
   4. نقل 200 مل من Hyclone SFX مستنبت في نظيفة، معقمة 1،000 مل شاكر قارورة (بدون اقصائيات، مختومة مع رقائق الألومنيوم قبل التعقيم، لم يكن ينبغي استخدامها لالثقافات البكتيرية من قبل).
   5. نقل تعليق P3/cell في قارورة شاكر. ختم مع رقائق الألومنيوم العقيمة ونقل إلى قارورة شاكر. يهز في 70 دورة في الدقيقة عند 28 درجة مئوية لمدة 72-96 ساعة.
3. حصاد البروتين المؤتلف من ارتفاع خمسة supernatants التعبير الخلية
   1. 72-96 ساعة العدوى آخر نقل supernatants الثقافة في 500 مل الدلاء الطرد المركزي. تدور في 5،500 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. في هذه الأثناء شطف قوارير شاكر 3x أخرى مع الماء المقطر مزدوجة([ده ₂ O).
   2. نقل 3 مل ني الراتنج الطين في أنبوب 50 مل مع 45 مل من برنامج تلفزيوني (احد في حاجة لكل 200 مل الثقافة). يهز جيدا وتدور في 3،000 XG في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. صب PBS والحفاظ على بيليه. مزيج طاف الخلية الحشرات مع بيليه ني الراتنج ونقل إلى قوارير شاكر تشطف بالفعل. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعة، في حين تهز (الشكل 6).
   3. جبل 10 مل العمود البولي بروبلين على المشبك على موقف الدعم. إزالة كل القبعات ووضع كوب أسفل عمود لجمع التدفق من خلال (النفايات). أخذ قارورة شاكر من شاكر والبدء في نقل الخليط طاف / الطين على العمود، وسوف تحتفظ ني الراتنج وسوف فقط طاف تتدفق من خلال. تمرير وحدة التخزين بالكامل على العمود (الشكل 7).
   4. غسل 4x والراتنج مع 15 مل من غسل العازلة (50 ملي نا ₂ HCO _3، 300 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 20 ملي إيميدازول، ودرجة الحموضة 8). السماح لجميع استنزاف غسل العازلةمن العمود وإغلاقه مع غطاء (الجانب السفلي).
   5. إضافة 2 مل من شطف العازلة (50 ملي نا ₂ HCO _3، 300 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 300 ملي إيميدازول، ودرجة الحموضة 8) وترك الجلوس لمدة 5 دقائق. فتح العمود وجمع شطافة. كرر هذا 3 مرات أكثر (مع ما مجموعه 8 مل من شطف العازلة). شطافة الذي يحتوي على تركيزات عالية من البروتين يظهر عادة عندما اهتزت رغوة (الشكل 7). إبقاء شطافة على الجليد الرطب كلما أمكن ذلك.
4. تبادل العازلة وتركيز
   1. (قد تتباين 30 كيلو دالتون وقف انتاج المواد الانشطارية للHA / لا أعرف ولكن اعتمادا على حجم البروتين النقي) Prespin 15 مل وحدات الطرد المركزي الفائق مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7،4-7،6) في 3000 XG في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تتدفق من خلال تجاهل وتحميل شطافة على عمود الدوران. ملء مع 5 مل من العقيمة، الجليد الباردة PBS وتدور لمدة 60 دقيقة في 3،000 XG في 4 درجات مئوية.
   2. تدفق من خلال التفريغ مرة أخرى، وإعادة ملء مع 15 مل من برنامج تلفزيوني الباردة الجليد وتدور لمدة 60 دقيقة في 3،000 XG في 4 درجات مئوية. كرر هذه اإلجراءاتملعرفة واحد مزيد من الوقت.
   3. اتخاذ عمود الدوران من أجهزة الطرد المركزي وجمع العازلة تبادل التركيز (عادة 200 ميكرولتر). ويتركز هذا البروتين المؤتلف للغاية. شطف عمود الدوران مع 400 ميكرولتر من العقيمة الجليد الباردة برنامج تلفزيوني وإضافة إلى هذا التركيز. إبقاء التركيز على الجليد في جميع الأوقات.

3. توصيف ومراقبة الجودة

1. قياس تركيز البروتين
   اتخاذ قسامة من التركيز وقياسه باستخدام الأسلوب الكمي البروتين الخاص في الاختيار. تعيين تركيز البروتين إلى 1 ملغ / مل بإضافة برنامج تلفزيوني وتجميد مأخوذة الصغيرة إلى -80 درجة مئوية. دورات ذوبان الجليد تجميد تضر بنية البروتين ويمكن أن يؤدي إلى التجميع.
2. SDS-PAGE وتلطيخ Coomassie
   تشغيل 500 نانوغرام من البروتين الخاص بك على SDS-PAGE وإجراء تلطيخ Coomassie. لتلطيخ سريعة ومريحة استخدام Coomassie كاشف بالاشتراك مع بروتوكول الميكروويف. وعادة ما تظهر البروتينات HA في 64كيلو دالتون في حين أن البروتينات NA تشغيلها في حجم حوالي 56 كيلو دالتون (الأرقام 8A وباء). باستخدام بروتوكول صفها يجب أن لا نرى أي تدهور المنتجات. في حالة حدوث تدهور فإنه عادة ما يكون علامة على تلوث الخميرة / فطرية أثناء التعبير. في هذه الحالة كرر الإجراء وتأكد من أن تبقي كل شيء العقيمة.
3. لطخة غربية / ELISA
   من أجل التحقق من هوية البروتين نوصي القيام به لطخة غربية أو ELISA مقايسة مع الأجسام المضادة المحددة. من الناحية المثالية، يتم تنفيذ المقايسات ELISA مع الأجسام المضادة التي تربط لالحواتم متعلق بتكوين جزئي (مثل الأجسام المضادة لمكافحة HA ساق ^1). استخدام مثل هذه الأجسام المضادة للطي الصحيح من البروتين يمكن تأكيد (الشكل 8C).
4. قياس النشاط NA
   ويمكن أيضا للطي الصحيح للNA الفيروسية يتحدد من خلال قياس النشاط NA. نوصي لأداء هذا الاختبار باستخدام المتاحة تجاريا فحص NA * STAR (فقط اتبع المبادئ التوجيهية المستخدم).

النتائج

أعرب جزيئات HA من A/Shanghai/1/13 وA/Anhui/1/13 بشكل جيد مع غلة حوالي 20 ثقافة ملغم / لتر. أظهرت جزيئات NA كل سلالات مستويات التعبير معتدلة تتراوح بين 0.2 ملغم / لتر للثقافة A/Shanghai/1/13 إلى 0.7 ملغ / لتر بالنسبة للA/Anhui/1/13. كان كل الاستعدادات البروتين أربعة القليل جدا من دون شوائب (الأرقام 8...

Discussion

على الرغم من أن التعبير عن فيروس الأنفلونزا HA و NA البروتينات في خلايا الحشرات باستخدام نظام التعبير الفيروسة العصوية عموما على التوالي إلى الأمام، وهناك العديد من النقاط الهامة للنظر فيها. من المهم، كما أشار في المقدمة، أن يتم التعبير عن ectodomains من HA و NA في الانصهار مع...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bac-to-Bac Baculovirus expression system	Invitrogen	10359-016	Follow manufacturer's instructions
TNM-FH insect medium	Gemini Bioproducts	600-311
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher	SH30278.02
Cellfectin II Reagent	Invitrogen	P/N58760
Pluronic F68	Sigma	1000702664
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018240
Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K	Millipore	UFC902024
Pen Strep	Gibco	15140-122
Polypropylene Columns (5 ml)	Qiagen	34964
Max efficiency DH10Bac bacteria	Invitrogen	10361-012
PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit	Invitrogen	K210015
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399-100G	for elution and wash buffers
Sf9 cells	ATCC	CRL-1711
High Five cells	Invitrogen	B85502