Espressione dei funzionali ricombinante emoagglutinina e neuraminidasi proteine ​​del virus Novel H7N9 Influenza utilizzando l'espressione sistema Baculovirus

Riepilogo

Qui si descrive un modo per esprimere antigeni di superficie del virus dell'influenza piegati correttamente e funzionali derivati ​​dal romanzo virus H7N9 cinese in cellule di insetto. La tecnica può essere adattata per esprimere ectodomains di eventuali proteine ​​di superficie virali o cellulari.

Abstract

Il sistema di espressione baculovirus è un potente strumento per l'espressione di proteine ​​ricombinanti. Qui usiamo per produrre versioni piegati correttamente e glicosilata del virus dell'influenza A glicoproteine ​​di superficie del virus - l'emoagglutinina (HA) e neuraminidasi (NA). Come esempio, abbiamo scelto le proteine ​​HA e NA espresse dal virus H7N9 romanzo che recentemente emersa in Cina. Tuttavia il protocollo può essere facilmente adattato per HA e NA proteine ​​espresse da qualsiasi altra influenza A e B ceppi virali. Proteine ​​ricombinanti HA (umana ricombinante) e NA (RNA) sono reagenti importanti per saggi immunologici quali ELISPOT e ELISA, e sono in largo uso per il vaccino contro la standardizzazione, la scoperta di anticorpi, isolamento e caratterizzazione. Inoltre, molecole NA ricombinanti possono essere utilizzate per lo screening di piccole molecole inibitrici e sono utili per la caratterizzazione della funzione enzimatica della NA, così come la sua sensibilità ai farmaci antivirali. Proteine ​​HA ricombinanti sono anche being testato come vaccini sperimentali in modelli animali, e un vaccino ricombinante basato su HA è stato recentemente autorizzato dalla FDA per l'uso nell'uomo. Il metodo che descriviamo qui di produrre queste molecole è semplice e può facilitare la ricerca in laboratori influenza, in quanto consente la produzione di grandi quantità di proteine ​​veloci ea basso costo. Anche qui ci concentriamo su glicoproteine ​​di superficie del virus dell'influenza, questo metodo può anche essere usato per produrre altre proteine ​​di superficie virali e cellulari.

Introduzione

Come prima risposta alla recente nascita del romanzo H7N9 dell'influenza ceppo del virus in Cina, abbiamo acquisito plasmidi che trasportano le sequenze genomiche per l'emoagglutinina (HA) e neuraminidasi (NA) geni dei primi due isolati. L'utilizzo di questi plasmidi siamo stati in grado di costruire rapidamente vettori di espressione baculovirali per la produzione di ricombinanti HA e NA in cellule di insetto. Questo sistema di espressione è ben consolidata nel nostro laboratorio e si è dimostrato fondamentale per molti dei nostri progetti di ricerca in corso ^1-8. Cellule di insetto sono in grado di piegare correttamente e post-traduzionale modificare proteine ​​complesse. Queste modifiche comprendono glicosilazione N-linked, che è importante per molte glicoproteine ​​virali. Come tale, non è sorprendente che il sistema baculovirus è abbastanza stabilito per esprimere antigeni di superficie del virus dell'influenza. In realtà, molte delle strutture cristalline HA e NA sono stati risolti utilizzando cellule espresso proteine ​​insetti ^9-11. Un altro vantaggio delsistema risiede nella sua affidabilità rendimenti ad alto contenuto proteico fino a 30 mg di coltura cellulare HA / L (sulla base della nostra esperienza con oltre 50 diverse proteine ​​HA) - una conseguenza del virus-infezione espressione guidato dal promotore forte poliedrina.

La rimozione del transmembrana e endodomain delle proteine ​​HA e NA permette a manifestare versioni secretable, solubili delle proteine ​​e quindi facilita notevolmente il processo di purificazione. Inoltre, questi ectodomains sono hexahistidine marchiato e possono quindi essere purificati mediante cromatografia per affinità utilizzando Ni ^{2 +-resina.} I domini transmembrana di proteine ​​HA e NA contribuiscono omotrimero e formazione omotetramero rispettivamente. Per preservare questi oligomerizations, si aggiunge un dominio trimerizzazione C-terminale al HA-, e un dominio di tetramerizzazione N-terminale al NA costrutti (Figura 1). Abbiamo dimostrato in modo conclusivo che tale dominio trimerizzazione stabilizza funzionale, conserved epitopi conformazionali sul gambo dominio di HA ^1. La corretta tetramerizzazione della NA potrebbe anche contribuire a correggere la piegatura e la funzione NA ^10. Sequenze e vettori Baculo trasferimento ospitano domini trimerizzazione o tetramerizzazione possono essere richiesti da parte degli autori o da altri laboratori del ^{settore, 9,10,12.}

Un altro aspetto importante per l'espressione di proteine ​​secrete in cellule di insetto è la scelta della linea cellulare di destra. Mentre Spodoptera frugiperda derivato cellule Sf9 supportano la replica baculovirus molto bene e sono generalmente utilizzati per il salvataggio e la propagazione del virus, hanno limitato la capacità di secernere grandi quantità di proteine. Trichoplusia ni derivato BTI-TN-5B1-4 celle (comunemente noto come High Five) avere una maggiore capacità di secrezione e sono la linea cellulare di scelta per l'espressione in questo protocollo ^13,14. Inoltre, è utile per ridurre o addirittura eliminare siero fetale bovino (FBS) dalle culture di espressione. Usiamo quindi media con ridotta (3%) Contenuto FBS per la crescita degli stock di lavoro di virus, e noi eseguiamo l'espressione della proteina nel siero media liberi.

Proteine ​​HA e NA ricombinanti sono utilizzati per vari tecniche immunologiche. Forse il più comune è in saggi ELISA per misurare la conversione del siero su di vaccinazione in esseri umani o animali ^4,6,7,15. Ha e AN sono utilizzati anche in saggi ELISPOT come entrambe le molecole stimolatorie e reagenti di rilevamento per anticorpi cellule che secernono ^16. Il loro impiego come esche molecolari permette di ordinare specificamente per plasmablasts o altri tipi di cellule B che possono poi essere utilizzati per isolare (terapeutici) anticorpi monoclonali (mAb). Molecole di HA e NA ricombinanti sono ulteriormente utilizzati nella caratterizzazione di questi anticorpi monoclonali ^8. Altri esempi includono lo studio della stabilità del pH o della specificità del recettore di ha espresso da diversi isolati di virus, o quantitativamente valutazione specifica enzimatica NAattività o resistenza agli inibitori. Inoltre, ricombinante, HA purificato può essere utilizzato per standardizzare il contenuto di HA di vaccini a virus influenzali inattivati.

Importante, umana ricombinante (e in una certa misura NA) candidati vaccini sono attualmente in fase di sperimentazione in modelli animali e studi clinici con un vaccino candidato di essere autorizzato dalla FDA nel 2013 ^2,17-19. Il vantaggio di questi nuovi vaccini è che, a causa della natura ricombinante di queste proteine, il processo laborioso di generazione di virus reassortant alta crescita potrebbe essere evitato. Forse ancora più rilevante è il fatto che il loro rendimento HA è elevata e riproducibile da ceppo a ceppo. Inoltre, poiché questi vaccini sono prodotti in un sistema privo di uovo, non contengono contaminanti proteici che sono problematici per le persone con allergie uovo.

Qui abbiamo scelto di esprimere le proteine ​​HA e NA da due isolati del virus dell'influenza romanzo cinese H7N9, A / Anhui/1/13 e A/Shanghai/1/13 ^20,21. Questi sono esempi tempestivi, ma il protocollo descritto può essere utilizzato per l'espressione di qualsiasi influenza A e B proteine ​​HA o NA e possono essere adattati per esprimere eventuali altre proteine ​​virali o cellulari secrete. Proteine ​​transmembrana trimeric o tetramerici possono essere clonati in cassette di espressione utilizzati per HA e NA, rispettivamente. Tuttavia, proteine ​​cellulari secrete più solubili, come interferoni per esempio, non hanno bisogno di un dominio aggiuntivo per la stabilizzazione e possono essere espressi solo con un tag hexahistidine C-terminale.

Protocollo

1. Generazione di ricombinante Baculovirus

1. Clonazione in baculovirus trasferimento-plasmidi
   1. Clone H7 HA e NA ectodomain N9 (o qualsiasi altro gene HA o NA) nella modificate trasferimento plasmidi pFastBac (vedi introduzione). Vettori per HA contenente un dominio trimerizzazione C-terminale e un tag hexahistidine, nonché per NA contenente un dominio di tetramerizzazione N-terminale e tag hexahistidine, sono stati descritti ^1,10,11,22 (Figura 1) e possono essere richieste gli autori.
      Nota esplicativa: ectodomains HA espresse senza un dominio trimerizzazione saranno piegate in modo errato, con conseguente perdita di epitopi neutralizzanti conformazionali, soprattutto nel settore gambo. Analogamente, la funzione enzimatica NA basa su una corretta tetramerization.
   2. Generazione di bacmids
      Trasforma il trasferimento-plasmidi baculovirus contenenti HA e NA geni nei batteri DH10Bac secondo utilizzando un'espressione baculovirusil sistema secondo le istruzioni del produttore. Isolare e purificare bacmids utilizzando un kit Midiprep secondo le istruzioni del produttore (Figura 2).
2. Salvataggio di baculovirus ricombinante e verifica dell'espressione della proteina
   Nota esplicativa: Le seguenti operazioni devono essere eseguite in modo asettico in una cappa a flusso laminare. Eseguire questa procedura indipendente per HA e NA (o qualsiasi altro gene di interesse). Cellule di insetto di solito sono coltivate a 28 ° C senza CO _2. Cellule Sf9 di questo protocollo sono coltivate in mezzi cellule di insetto pieno TNM-FH supplementato con 10% FBS, 1% Pen-Strep ^* e 0,1% soluzione F68 Pluronic, se non diversamente indicato, e diversi passaggi 01:04 due volte a settimana. High Five cellule sono coltivate in mezzi siero libero SFX e diversi passaggi 01:15 due volte a settimana.
   ^* Aggiunta di antibiotici dovrebbe essere considerato facoltativo per tutto il protocollo e regolata secondo le pratiche utilizzate in ogni laboratorio.
   1. Piatto cellule di insetto Sf9 in piastre da 6 pozzetti ad una densità di 2 x 10 ⁵ cellule / cm ² e lasciate riposare per 20 minuti in un incubatore a 28 ° C (senza CO _2).
   2. Mescolare 2 mg (conc. 0,5-2 mg / ul) di bacmid ricombinante con 100 ml di TNM-FH medio (siero gratuito, 1% Pen-Strep). Mescolare 6 ml di agente di trasfezione con 100 ml di TNM-FH medio (siero libero, Pen-Strep). Unire i due volumi, mescolare delicatamente e lasciate riposare per 20 minuti a temperatura ambiente (miscela di trasfezione). Includere un mock-trasfezione il controllo (Figura 3).
   3. Rimuovere il surnatante dalle cellule Sf9 placcato (cellule verranno ora aderire alla piastra) e sostituirli con 2 ml di siero libero medio TNM-FH contenenti Pen-Strep (1%). Aggiungere il volume totale della miscela di trasfezione (dal punto 1.2.2) e rock del 6 pozzetti accuratamente per 5 sec. Incubare in un incubatore a 28 ° C senza CO ₂ per 6 ore (Figura 3).
   4. Sostituire il supporto with mezzi freschi TNM-FH completi (contenente 10% FBS, 1% Pen-Strep e 0,1% Pluronic F68). Incubare in un incubatore a 28 ° C senza CO ₂ per 6 giorni. Controllare di tanto in tanto le cellule al microscopio. Cellule infette di solito appaiono più grande, rotondo, hanno ampliato nuclei, e iniziano a staccare (Figura 4).
   5. Raccolta di cellule e conferma di espressione proteica
      1. Celle di raccolta 6 giorni dopo la trasfezione mediante centrifugazione a 2000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Il supernatante contiene il baculovirus ricombinante - questo sarà usato per generare scorte lavoro subito, o può essere conservato a 4 ° C per anni.
      2. Per controllare l'espressione della proteina raccogliere pellet e risospendere in 500 ml di PBS. Mescolare 50 ml di sospensione con 50 microlitri di tampone SDS-PAGE carico (contenente un agente riducente). Eseguire SDS-PAGE ed eseguire una analisi Western blot con un anticorpo anti-hexahistidine per confermare l'espressione genica. Includere cellule dal fintotrasfezione come controlli negativi (Figura 3).
   6. Preparazione delle scorte di lavoro
      1. Tavola 5 x 10 ⁵ Sf9 cellule / cm ² in un pallone T175 cm ² e lasciate riposare per 20 minuti permettono loro di attaccarsi al piatto. Sostituire multimediale completo TNM-FH con i media TNM-FH contenente 3% FBS (e 1% Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68).
      2. Infettare le cellule con 100 ml di surnatante salvataggio. Incubare in un incubatore a 28 ° C senza CO ₂ per 6 giorni e controllare ogni tanto se le cellule vengono infettati (come descritto al punto 1.2.5.).
      3. Spin a 2.000 xg a temperatura ambiente per 5 minuti e raccogliere il surnatante. Questo è ora il tuo P2 magazzino. Questo archivio può essere conservato a tempo indeterminato a 4 ° C. Ripetere la procedura di infezione con 100 ml di stock P2 di infettare le cellule. L'azione risultante è chiamato P3 o brodo di lavoro, che può essere conservato a 4 ° C o utilizzato direttamente per l'espressione della proteina. La P3 magazzino di solito contiene 10 ^{7 -10 9 unità formanti placca / ml.}

2. Proteine ​​Espressione e purificazione

Nota esplicativa: le cellule Sf9 sostenere la crescita di baculovirus molto bene. Tuttavia, la loro capacità di secernere grandi quantità di proteina ricombinante è limitato. Pertanto usiamo un'altra linea cellulare di insetto, cellule High Five, per l'espressione di proteine ​​ricombinanti secrete. Queste cellule non supportare la replica baculovirus a titoli molto alte ¹³ ma hanno elevata capacità secretoria.

1. Crescendo High Five cellule
   Crescere High Five cellule in cellule di insetto SFX terreno di coltura in T175 cm ² palloni. Passaggio a giorni 1:3. Per una cultura espressione 200 ml avrete bisogno di crescere cinque palloni confluenti.
2. Raccolta e infettare le cellule High Five
   1. Staccare High Five celle da 5 T175 cm ² palloni toccando i palloni con la mano. Raccogliere il Sosp cellularension e trasferire in 50 provette ml di centrifugazione.
   2. Spin a 1.200 xg per 7 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante per decantazione e unire le palline da loro risospensione in 15 ml di P3 magazzino.
   3. Lasciare riposare per 15 min in cappa a flusso (figura 5).
   4. Trasferire 200 ml di Hyclone SFX terreno di coltura in una sterile 1.000 ml matraccio agitatore pulito (senza Buffles, sigillato con un foglio di alluminio prima della sterilizzazione in autoclave, non avrebbero dovuto essere utilizzati per colture batteriche prima).
   5. Trasferire la sospensione P3/cell nel pallone shaker. Sigillare con un foglio di alluminio sterile e pallone trasferimento in uno shaker. Agitare a 70 giri al minuto a 28 ° C per 72-96 ore.
3. Raccolta proteina ricombinante da High Five surnatanti di espressione delle cellule
   1. 72-96 h dopo l'infezione di trasferimento cultura surnatanti in 500 ml secchi centrifugazione. Spin a 5.500 xg per 20 min a 4 ° C. Nel frattempo lavare le fiasche shaker 3x con acqua bidistillata(DDH ₂ O).
   2. Trasferimento 3 ml Ni-resina fanghiglia in un tubo da 50 ml con 45 ml di PBS (occorreva per 200 ml cultura). Agitare bene e centrifugare a 3000 xg a temperatura ambiente per 10 min. Decantare il PBS e mantenere il pellet. Mescolare il surnatante delle cellule di insetto con il pellet Ni-resina e trasferire nelle beute shaker già risciacquati. Incubare a 4 ° C per 2-4 ore, agitando (Figura 6).
   3. Supporto 10 ml colonna polipropilene su una pinza su un cavalletto di sostegno. Rimuovere entrambi i tappi e mettere un bicchiere sotto la colonna di raccogliere il flusso attraverso (rifiuti). Prendere il matraccio shaker su shaker e inizia a trasferire la miscela sovranatante / slurry sulla colonna; manterrà le Ni-resina e solo il supernatante fluirà attraverso. Passare l'intero volume sopra la colonna (Figura 7).
   4. Lavare i 4x in resina con 15 ml di tampone di lavaggio (50 mM Na ₂ HCO _3, NaCl 300 mM, imidazolo 20 mM, pH 8). Che tutti lo scarico tampone di lavaggiodalla colonna e chiudere con il coperchio (lato inferiore).
   5. Aggiungere 2 ml di tampone di eluizione (50 mM Na ₂ HCO _3, NaCl 300 mM, imidazolo 300 mM, pH 8) e lasciate riposare per 5 minuti. Aprire colonna e raccogliere l'eluato. Ripeti 3 volte (per un totale di 8 ml di tampone di eluizione). Eluato contenente alte concentrazioni di proteina mostra tipicamente schiuma se agitato (Figura 7). Tenere eluato su ghiaccio bagnato quando possibile.
4. Scambio Buffer e concentrazione
   1. Prespin 15 ml ultrafiltrazione unità di centrifugazione (30 kDa cut-off per HA / NA ma possono variare a seconda delle dimensioni proteina purificata) con PBS (pH 7.4-7.6) a 3000 xga 4 ° C per 20 min. Scartare il flusso attraverso e carico eluato sulla colonna di spin. Riempire con 5 ml di sterile, freddo ghiaccio PBS e centrifugare per 60 min a 3000 xg a 4 ° C.
   2. Flusso di scarico attraverso di nuovo, riempire con 15 ml di ghiaccio freddo PBS e centrifugare per 60 min a 3000 xg a 4 ° C. Ripetere questa proceduraDure ancora una volta.
   3. Prendere la colonna di spin fuori dalla centrifuga e raccogliere il buffer scambiato concentrato (in genere 200 ml). Questo è molto concentrata proteina ricombinante. Lavare la colonna con 400 ml di sterile freddo ghiaccio PBS e aggiungere questo al concentrato. Conservare il concentrato su ghiaccio in ogni momento.

3. Caratterizzazione e Controllo Qualità

1. Misurare la concentrazione di proteine
   Prelevare un 'aliquota del concentrato e misurare utilizzando il metodo di quantificazione delle proteine ​​di scelta. Impostare concentrazione proteica di 1 mg / ml aggiungendo PBS e congelare piccole aliquote a -80 ° C. Disgelo congelamento danneggiano la struttura delle proteine ​​e può portare all'aggregazione.
2. SDS-PAGE e colorazione con Coomassie
   Eseguire 500 ng della proteina su una SDS-PAGE ed eseguire una colorazione Coomassie. Per la colorazione veloce e conveniente usare Coomassie reagente in combinazione con un protocollo microonde. Proteine ​​HA compaiono tipicamente a 64kDa mentre le proteine ​​NA devono funzionare ad una dimensione di circa 56 kDa (figure 8A e B). Utilizzando il protocollo descritto non si dovrebbe vedere tutti i prodotti di degradazione. Se si verifica la degradazione di solito è un segno di contaminazione da lieviti / funghi durante espressione. In questo caso, ripetere la procedura e assicurarsi di tenere tutto sterile.
3. Western Blot / ELISA
   Al fine di verificare l'identità della proteina si consiglia di fare un Western Blot o test ELISA con un anticorpo specifico. Idealmente, saggi ELISA vengono eseguite con un anticorpo che si lega ad epitopi conformazionali (ad esempio anticorpi anti-HA gambo ^1). L'utilizzo di un tale anticorpo il corretto ripiegamento della proteina può essere confermata (Figura 8C).
4. Misurare NA attività
   Corretto ripiegamento della NA virale può anche essere determinata misurando l'attività NA. Si consiglia di eseguire questo test utilizzando il saggio NA * STAR disponibile in commercio (basta seguire le linee guida dell'utente).

Risultati

Molecole di HA da A/Shanghai/1/13 e A/Anhui/1/13 espressi bene con rese di circa 20 mg / L cultura. NA molecole di entrambi i ceppi hanno mostrato livelli di espressione moderati da 0,2 mg / L di coltura per A/Shanghai/1/13 a 0,7 mg / L per A/Anhui/1/13. Tutti e quattro i preparati proteici avevano ben poco a che nessuna impurità (Figure 8A e B) con ha l'essere di purezza superiore AN che può essere spiegato con il livello di espressione. A/Shanghai/1/13 HA è stato ulteriormente ...

Discussione

Anche se l'espressione del virus dell'influenza HA e NA proteine ​​in cellule di insetto che utilizzano il sistema di espressione baculovirus è generalmente semplice, ci sono diversi punti importanti da considerare. E 'importante, come ricordato in premessa, che i ectodomains di HA e NA sono espressi in fusione con domini trimerizzazione o tetramerization rispettivamente. Questi domini garantiscono corretto ripiegamento delle molecole solitamente assistiti dal dominio transmembrana, che non è presente ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bac-to-Bac Baculovirus expression system	Invitrogen	10359-016	Follow manufacturer's instructions
TNM-FH insect medium	Gemini Bioproducts	600-311
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher	SH30278.02
Cellfectin II Reagent	Invitrogen	P/N58760
Pluronic F68	Sigma	1000702664
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018240
Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K	Millipore	UFC902024
Pen Strep	Gibco	15140-122
Polypropylene Columns (5 ml)	Qiagen	34964
Max efficiency DH10Bac bacteria	Invitrogen	10361-012
PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit	Invitrogen	K210015
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399-100G	for elution and wash buffers
Sf9 cells	ATCC	CRL-1711
High Five cells	Invitrogen	B85502