L'expression de l'hémagglutinine recombinante fonctionnelle et la neuraminidase du virus de la nouvelle grippe H7N9 à l'aide du système d'expression baculovirus

Résumé

Nous décrivons ici un moyen pour exprimer des antigènes de surface du virus de l'influenza correctement repliés et fonctionnels dérivés du nouveau virus H7N9 chinois dans des cellules d'insectes. La technique peut être adaptée pour exprimer ectodomaines de toutes les protéines virales ou cellulaires superficiels.

Résumé

Le système d'expression de baculovirus est un outil puissant pour l'expression de protéines recombinantes. Ici, nous l'utilisons pour produire des versions correctement repliées et glycosylés de la grippe A virus glycoprotéines de surface - l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA). A titre d'exemple, nous avons choisi les protéines HA et NA exprimées par le nouveau virus H7N9 qui a récemment émergé en Chine. Cependant le protocole peut être facilement adapté pour HA et NA protéines exprimées par tout autre virus grippal A et les souches de virus B. Recombinant HA (RRS) et NA (ARN) des protéines sont des réactifs importants pour les dosages immunologiques tels que ELISPOT et ELISA, et sont également largement utilisés pour la normalisation des vaccins, découverte d'anticorps, l'isolement et la caractérisation. En outre, les molécules de NA recombinantes peuvent être utilisées pour cribler des inhibiteurs de petites molécules et sont utiles pour la caractérisation de la fonction enzymatique de la Na, ainsi que de sa sensibilité aux antiviraux. Protéines HA recombinées sont également being testés en tant que vaccins expérimentaux dans des modèles animaux, et un vaccin recombinant basé sur HA a récemment été autorisé par la FDA pour une utilisation chez l'homme. La méthode que nous décrivons ici la production de ces molécules est simple et peut faciliter la recherche dans les laboratoires de la grippe, car il permet la production de grandes quantités de protéines rapide et à faible coût. Bien que nous nous concentrons ici sur le virus de la grippe glycoprotéines de surface, cette méthode peut également être utilisé pour produire d'autres protéines virales et cellulaires de surface.

Introduction

Comme une première réponse à la récente émergence du roman H7N9 grippe souche du virus en Chine, nous avons acquis des plasmides portant les séquences génomiques de l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA) des gènes des deux premiers isolats. L'utilisation de ces plasmides, nous avons pu construire rapidement des vecteurs d'expression de baculovirus recombinant pour la production de HA et NA dans des cellules d'insectes. Ce système d'expression est bien établi dans notre laboratoire et a prouvé crucial pour bon nombre de nos projets de recherche en cours ^1-8. Les cellules d'insectes sont capables de plier correctement et modifier des protéines complexes post-traductionnelle. Ces modifications comprennent la glycosylation N-liée, ce qui est important pour de nombreuses glycoprotéines virales. En tant que tel, il n'est pas surprenant que le système de baculovirus est bien établie pour les virus de la grippe exprimant les antigènes de surface. En fait, la plupart des structures cristallines HA et NA ont été résolus en utilisant cellulaires exprimé protéines d'insectes ^9-11. Un autre avantage de l'système réside dans ses fiables des rendements élevés de protéines allant jusqu'à 30 mg de culture de cellules HA / L (sur la base de notre expérience de plus de 50 protéines différentes HA) - une conséquence de virus infection expression entraînée par le promoteur de la polyhédrine forte.

L'élimination de l'endodomaine transmembranaire et des protéines HA et NA permet l'expression de versions solubles sécrétées, des protéines et donc facilite grandement le processus de purification. En outre, ces ectodomaines hexahistidine sont marqués et peuvent donc être purifiés en utilisant une Chromatographie d'affinité en utilisant ^{Ni2 +-résine.} Les domaines transmembranaires des protéines HA et NA, et contribuent à la formation de homotrimère homotétramère, respectivement. Afin de préserver ces oligomérisations, nous ajoutons un domaine de trimérisation C-terminale de la HA, et un tétramérisation domaine N-terminal de la NA constructions (Figure 1). Nous avons démontré de façon concluante que ce domaine de trimérisation stabilise fonctionnelle, conséquencesrved épitopes conformationnels sur la tige-domaine de HA ^1. Le tétramérisation correcte de la NA pourrait également contribuer à corriger le pliage et la fonction NA ^10. Séquences et des vecteurs baculovirus transfert hébergeant trimérisation ou tétramérisation domaines peuvent être demandés aux auteurs ou à d'autres laboratoires dans le ^{domaine, 9,10,12.}

Une autre question importante pour l'expression de protéines sécrétées dans des cellules d'insectes est le choix de la lignée cellulaire droite. Alors que Spodoptera frugiperda dérivé des cellules Sf9 en charge la réplication baculovirus très bien et sont généralement utilisés pour le sauvetage de virus et la propagation, ils ont la capacité de sécréter de grandes quantités de protéines limité. Trichoplusia ni dérivé BTI-TN-5B1-4 cellules (communément appelés High Five) avoir une capacité de sécrétion plus élevée et sont de la lignée cellulaire de choix pour l'expression dans ce protocole ^13,14. En outre, il est utile pour réduire ou même éliminer le sérum de veau fœtal (FBS) à partir de cultures d'expression. Nous utilisons donc médias réduite (3%) contenu FBS pour la croissance des stocks de roulement de virus, et nous effectuons l'expression de protéines dans des milieux sans sérum.

Protéines HA et NA recombinants sont utilisés pour de nombreuses techniques immunologiques. Peut-être la plus commune est dans des tests ELISA pour mesurer la conversion de sérum sur la vaccination chez les humains ou les animaux ^4,6,7,15. AN engage et sont également utilisées dans des analyses ELISPOT comme les deux molécules stimulatrices et des réactifs de détection pour les cellules sécrétant l'anticorps ^16. Leur utilisation comme amorces moléculaires permet de trier spécifiquement pour plasmoblastes ou d'autres types de cellules B qui peuvent ensuite être utilisés pour isoler des anticorps monoclonaux (thérapeutiques) (Acm). Des molécules de HA et NA recombinants sont ensuite utilisés dans la caractérisation de ces anticorps monoclonaux ^8. D'autres exemples comprennent l'étude de la stabilité du pH ou la spécificité du récepteur de a exprimé par différents isolats de virus, ou d'évaluer quantitativement enzymatique spécifique NAl'activité ou de la résistance aux inhibiteurs. En outre, recombinant, HA purifiée peut être utilisée pour normaliser teneur en HA de vaccins inactivés du virus de la grippe.

Surtout, AHr (et dans une certaine mesure NA) candidats vaccins sont actuellement testés dans des modèles animaux et des essais cliniques sur des humains avec un candidat vaccin est autorisé par la FDA en 2013 ^2,17-19. L'avantage de ces nouveaux vaccins est que, en raison de la nature de ces protéines recombinantes, le procédé de génération de virus réassortis de croissance élevés de main-d'œuvre pourrait être évité. Peut-être est d'autant plus pertinente que le fait de leur rendement de HA est élevée et reproductible d'une souche à l'. En outre, étant donné que ces vaccins sont produits dans un système sans oeuf, ils ne contiennent pas de contaminants protéiques qui sont problématiques pour des individus allergiques aux œufs.

Ici, nous avons choisi d'exprimer les protéines HA et NA de deux isolats du virus de la grippe roman H7N9 chinois, A / Anhui/1/13 et A/Shanghai/1/13 ^20,21. Ce sont des exemples rapides, mais le protocole décrit peuvent être utilisés pour l'expression selon l'une quelconque des protéines de la grippe A et B de HA ou de NA et peuvent être adaptés pour exprimer toutes les autres protéines virales ou cellulaires sécrétés. Protéines transmembranaires trimères ou tétramères peuvent être clonées dans les cassettes d'expression utilisées pour HA et NA, respectivement. Toutefois, les protéines cellulaires sécrétées plus solubles, comme les interférons, par exemple, n'ont pas besoin d'un domaine supplémentaire pour la stabilisation et peuvent être exprimés uniquement avec un tag hexa-histidine C-terminal.

Protocole

Une. Génération de baculovirus recombinant

1. Clonage dans plasmides transfert baculovirus
   1. Clone H7 HA et NA N9 ectodomaine (ou tout autre gène HA ou NA) dans des plasmides de transfert pFastBac modifiés (voir introduction). Vecteurs pour HA contenant un domaine de trimérisation C-terminal et une étiquette hexahistidine, ainsi que pour NA contenant un domaine de tétramérisation N-terminal et tag hexa-histidine, ont été décrits ^1,10,11,22 (Figure 1) et peuvent être demandées les auteurs.
      Note explicative: ectodomaines HA exprimées sans un domaine de trimérisation seront pliées de manière incorrecte, conduisant à la perte d'épitopes conformationnels neutralisants, en particulier dans le domaine de la tige. De même, la fonction enzymatique NA s'appuie sur tétramérisation appropriée.
   2. Génération de bacmides
      Transformer transfert de baculovirus-plasmides contenant des gènes HA et NA dans des bactéries selon DH10Bac aide d'une expression de baculovirussystème selon les instructions du fabricant. Isoler et purifier bacmides utilisant un kit Midiprep selon les instructions du fabricant (figure 2).
2. Sauvetage de baculovirus recombinant et de la vérification de l'expression de la protéine
   Note explicative: Les étapes suivantes doivent être effectuées de manière aseptique dans une hotte à flux laminaire. Effectuez cette procédure indépendante pour HA et NA (ou tout autre gène d'intérêt). Les cellules d'insectes sont généralement cultivées à 28 ° C sans CO _2. Cellules Sf9 de ce protocole sont cultivées dans des milieux de cellules d'insectes TNM-FH complet supplémenté avec 10% de FBS, 1% de Pen-Strep ^* et 0,1% de solution de Pluronic F68, sauf indication contraire, et des passages 01h04 deux fois par semaine. Cellules High Five sont cultivées dans des milieux de sérum libre SFX et des passages 01h15 deux fois par semaine.
   ^* Ajout d'antibiotiques devrait être considérée comme facultative dans tout le protocole et ajusté selon les pratiques utilisées dans chaque laboratoire.
   1. Plate cellules d'insecte Sf9 dans des plaques à 6 puits à une densité de 2 x 10 ⁵ cellules / cm ² et laisser reposer pendant 20 min dans un incubateur à 28 ° C (sans CO _2).
   2. Mélanger 2 ug (conc. 0,5 à 2 ug / ul) de bacmide recombinant avec 100 ul de milieu TNM-FH (exempt de sérum, 1% de Pen-Strep). Mélangez 6 pi d'agent de transfection avec 100 pi de milieu TNM-FH (sans sérum, Pen-Strep). Combiner les deux volumes, mélanger délicatement et laisser reposer pendant 20 min à température ambiante (mélange de transfection). Inclure une maquette transfection comme contrôle (Figure 3).
   3. Retirer le surnageant de cellules Sf9 plaqués (cellules vont maintenant s'en tenir à la plaque) et le remplacer par 2 ml de milieu sans sérum TNM-FH contenant Pen-Strep (1%). Ajouter le volume complet du mélange de transfection (étape 1.2.2) et faites délicatement basculer la plaque de 6 puits pendant 5 sec. Incuber dans un incubateur à 28 ° C sans CO ₂ pendant 6 heures (figure 3).
   4. Remplacez le support wimédias ème frais complets TNM-FH (contenant 10% de FBS, 1% de Pen-Strep et 0,1% Pluronic F68). Incuber dans un incubateur à 28 ° C sans CO ₂ pendant 6 jours. Vérifier de temps en temps les cellules sous un microscope. Les cellules infectées apparaissent généralement plus gros, plus rond, ont élargi noyaux, et commencent à se détacher (Figure 4).
   5. La récolte de cellules et la confirmation de l'expression de la protéine
      1. Récolte des cellules 6 jours après la transfection par centrifugation à 2000 xg pendant 5 min à température ambiante. Le surnageant contient le baculovirus recombinant - il sera utilisé pour générer les stocks de travail tout de suite, ou peut être conservé à 4 ° C pendant des années.
      2. Pour vérifier l'expression des protéines de recueillir des pastilles et remettre en suspension dans 500 pi de PBS. Mélanger 50 pi de la suspension de 50 pi de tampon SDS-PAGE chargement (contenant un agent réducteur). Exécuter SDS-PAGE et d'effectuer une analyse par Western blot avec un anticorps anti-hexahistidine pour confirmer l'expression des gènes. Inclure les cellules de la maquettetransfection comme témoins négatifs (Figure 3).
   6. Préparation des stocks de travail
      1. Planche 5 x 10 ⁵ Sf9 / cm ² dans un flacon T175 cm ² et laisser reposer pendant 20 min permettent d'attacher à l'antenne. Remplacer complète médias TNM-FH avec les médias TNM-FH contenant 3% de FBS (et 1% de Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68).
      2. Infecter les cellules avec 100 pi de surnageant de sauvetage. Incuber dans un incubateur à 28 ° C sans CO ₂ pendant 6 jours et vérifier de temps en temps si les cellules sont infectées (comme décrit à l'étape 1.2.5.).
      3. Tourner à 2000 g à la température ambiante pendant 5 min et recueillir le surnageant. C'est maintenant votre P2 actions. Ce stock peut être conservé indéfiniment à 4 ° C. Répétez la procédure de l'infection en utilisant 100 pi de stock P2 pour infecter les cellules. Le stock en résulte est appelé P3 ou stock de travail, qui peut être conservé à 4 ° C ou utilisé directement pour l'expression de la protéine. Le P3 magasin contient généralement 10 ^{7 -10 9 unités formant plaque / ml.}

2. Protein Expression and Purification

Note explicative: cellules Sf9 de soutenir la croissance de baculovirus très bien. Cependant, leur capacité à sécréter de grandes quantités de protéine recombinante est limité. Par conséquent, nous utilisons une autre ligne de cellules d'insectes, cellules High Five, pour l'expression de protéines recombinantes sécrétées. Ces cellules ne prend pas en charge la réplication baculovirus à très haute de ¹³ titres, mais ont une grande capacité de sécrétion.

1. Grandir cellules High Five
   Cultiver cellules High Five dans SFX milieu de culture de cellules d'insecte en T175 ^cm2. Passage tous les jours 01h03. Pour une culture de 200 ml d'expression, vous devrez développer des flacons de 5 confluentes.
2. Récolte et infecter cellules High Five
   1. Détachez cellules High Five de 5 T175 ^cm2 en appuyant sur ​​les flacons avec votre main. Recueillir le suspe cellulairension et transférer dans des tubes de 50 ml de centrifugation.
   2. Tourner à 1200 xg pendant 7 min à température ambiante. Retirer le surnageant par décantation et d'unir les pastilles en les remettant en suspension dans 15 ml de P3 actions.
   3. Laisser reposer pendant 15 min dans la hotte à flux (Figure 5).
   4. Transférer 200 ml de milieu de culture Hyclone SFX en un, stérile 1000 ml shaker flacon propre (sans buffles, scellé avec une feuille d'aluminium avant l'autoclavage, ne doit pas avoir été utilisé pour les cultures bactériennes avant).
   5. Transférer la suspension P3/cell dans le ballon à secousses. Sceller avec du papier d'aluminium stérile et transfert ballon dans un shaker. Agiter à 70 tours par minute à 28 ° C pendant 72-96 h.
3. La récolte de la protéine recombinante à partir de surnageants de haute Cinq d'expression de cellules
   1. 72-96 h post-infection transfert surnageants de culture dans 500 ml seaux de centrifugation. Tourner à 5500 g pendant 20 min à 4 ° C. En attendant rincer les flacons shaker 3x avec de l'eau distillée deux fois(Le trou DDH ₂ O).
   2. Transfert 3 ml suspension Ni-résine dans un tube de 50 ml avec 45 ml de PBS (on avait besoin pour 200 ml de culture). Secouez bien et tourner à 3000 xg à température ambiante pendant 10 min. Décanter le PBS et garder le culot. Mélanger le surnageant de cellules d'insecte avec le culot Ni-résine et les transférer dans des flacons secoueurs déjà rincés. Incuber à 4 ° C pendant 2-4 heures, tout en agitant (Figure 6).
   3. Mont colonne de 10 ml en polypropylene sur une pince sur un stand de support. Retirer les deux bouchons et placer un bécher sous la colonne pour recueillir l'écoulement à travers (déchets). Prendre le ballon à secousses de l'agitateur et commencer à transférer le mélange surnageant / de suspension sur la colonne, il va conserver la résine Ni-et uniquement le surnageant s'écoule à travers. Passer la totalité du volume au-dessus de la colonne (figure 7).
   4. Laver 4x la résine avec 15 ml de tampon de lavage (50 mM de Na HCO _{3 2,} 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8). Que toute la vidange de tampon de lavagede la colonne et fermer avec le couvercle (côté inférieur).
   5. Ajouter 2 ml de tampon d'élution (mM Na 50 ₂ HCO _3, 300 mM de NaCl, mM imidazole, pH de 8 300) et laisser reposer pendant 5 min. Ouvrez colonne et recueillir l'éluat. Répéter cette opération 3 fois de plus (avec un total de 8 ml de tampon d'élution). Éluat qui contient des concentrations élevées de protéine montre typiquement mousse quand on les secoue (figure 7). Gardez éluat sur de la glace chaque fois que possible.
4. échange de tampon et la concentration
   1. Prespin 15 ml ultrafiltration unités de centrifugation (30 kDa de coupure pour HA / NA, mais peuvent varier en fonction de la taille de la protéine purifiée) avec du PBS (pH 7.4-7.6) à 3000 g à 4 ° C pendant 20 min. Jeter traverser et charge éluat sur la colonne. Remplir avec 5 ml de stérile, glacée PBS et centrifugation pendant 60 min à 3000 g à 4 ° C.
   2. débit de décharge par nouveau, remplir avec 15 ml de PBS glacé et essorage pendant 60 min à 3000 g à 4 ° C. Répétez cette procédureDure une fois de plus.
   3. Prenez la colonne de spin-out de la centrifugeuse et recueillir le concentré de tampon échangé (typiquement 200 pi). Ceci est très concentré protéine recombinante. Rincer la colonne de spin avec 400 pi de froid de glace PBS stérile et ajouter ce au concentré. Gardez le concentré sur la glace en tout temps.

3. Caractérisation et contrôle de la qualité

1. Mesure de la concentration protéique
   Prélever une partie aliquote du concentré et de le mesurer à l'aide de votre méthode de quantification de protéine de choix. Régler la concentration en protéine à 1 mg / ml par addition de PBS et de geler petites aliquotes à -80 ° C. Cycles de gel-dégel nuisent à la structure de la protéine et peuvent conduire à l'agrégation.
2. SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie
   Exécutez 500 ng de votre protéine sur un SDS-PAGE et effectuer une coloration de Coomassie. Pour la coloration rapide et pratique utiliser le réactif de Coomassie, en combinaison avec un protocole de micro-ondes. Protéines HA apparaissent généralement à 64kDa alors que les protéines NA doivent fonctionner à une taille d'environ 56 kDa (figures 8A et B). Selon le protocole décrit vous ne devriez pas voir tous les produits de dégradation. Si la dégradation se produit, il est généralement un signe de contamination levure / fongique lors de l'expression. Dans ce cas, répétez la procédure et assurez-vous de garder tout stérile.
3. Western blot / ELISA
   Afin de vérifier l'identité des protéines que nous recommandons à faire un Western blot ou ELISA avec un anticorps spécifique. Idéalement, les tests ELISA sont réalisés avec un anticorps qui se lie à des épitopes conformationnels (par exemple des anticorps anti-HA tige ^1). L'utilisation d'un tel anticorps du repliement correct de la protéine peut être confirmée (Figure 8C).
4. Mesure NA activité
   Un repliement correct de la NA du virus peut également être déterminée en mesurant l'activité de NA. Nous vous recommandons d'effectuer ce test en utilisant le test NA * STAR disponibles dans le commerce (il suffit de suivre les lignes directrices de l'utilisateur).

Résultats

Molécules HA de A/Shanghai/1/13 et A/Anhui/1/13 exprimé bien avec des rendements d'environ 20 mg / L de culture. NA molécules des deux souches ont montré des niveaux d'expression modérés allant de 0,2 mg / L de culture pour A/Shanghai/1/13 à 0,7 mg / L pour A/Anhui/1/13. Tous les quatre préparations de protéines ont très peu ou pas d'impuretés (figures 8A et B) Le fait d'être de pureté supérieur à AN qui peut s'expliquer par le niveau d'expression....

Discussion

Bien que l'expression de virus de la grippe HA et NA protéines dans des cellules d'insectes en utilisant le système d'expression baculovirus est généralement simple, il ya plusieurs points importants à considérer. Il est important, comme indiqué dans l'introduction, que les ectodomaines de HA et NA sont exprimés en fusion avec la trimérisation ou la tétramérisation des domaines, respectivement. Ces domaines d'assurer le repliement correct des molécules généralement assistée par le doma...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bac-to-Bac Baculovirus expression system	Invitrogen	10359-016	Follow manufacturer's instructions
TNM-FH insect medium	Gemini Bioproducts	600-311
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher	SH30278.02
Cellfectin II Reagent	Invitrogen	P/N58760
Pluronic F68	Sigma	1000702664
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018240
Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K	Millipore	UFC902024
Pen Strep	Gibco	15140-122
Polypropylene Columns (5 ml)	Qiagen	34964
Max efficiency DH10Bac bacteria	Invitrogen	10361-012
PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit	Invitrogen	K210015
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399-100G	for elution and wash buffers
Sf9 cells	ATCC	CRL-1711
High Five cells	Invitrogen	B85502