Expressão da Funcionais recombinante hemaglutinina ea neuraminidase Proteínas do vírus Influenza H7N9 Novel usando a expressão Sistema de Baculovirus

Resumo

Aqui nós descrevemos uma forma de expressar antígenos de superfície do vírus da influenza corretamente dobradas e funcionais decorrentes do novo vírus H7N9 chinês em células de insetos. A técnica pode ser adaptado para expressar ectodomínios de quaisquer proteínas de superfície virais ou celulares.

Resumo

O sistema de expressão de baculovírus é uma ferramenta poderosa para a expressão de proteínas recombinantes. Aqui vamos usá-lo para produzir versões dobradas corretamente e glicosiladas da vírus influenza A glicoproteínas da superfície - a hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). Como um exemplo, nós escolhemos as proteínas HA e NA expressas pelo novo vírus H7N9, que surgiu recentemente na China. No entanto, o protocolo pode ser facilmente adaptado para proteínas HA e NA expressas por qualquer outro vírus influenza A e estirpes de vírus B. Proteínas recombinantes HA (rHA) e NA (ARN) são reagentes importantes para ensaios imunológicos, tais como ELISPOT e ELISA, e também são largamente utilizados para a padronização da vacina, a descoberta de anticorpos, o isolamento e caracterização. Além disso, as moléculas de NA recombinante pode ser usada para o rastreio de inibidores de moléculas pequenas e que são úteis para a caracterização da actividade enzimática do NA, bem como a sua sensibilidade para os antivirais. Proteínas HA recombinantes também são being testado como vacinas experimentais em modelos animais, e de uma vacina baseada na HA recombinante foi recentemente licenciada pela FDA para utilização em seres humanos. O método que descrevemos aqui para produzir essas moléculas é direto e pode facilitar a pesquisa nos laboratórios da gripe, uma vez que permite a produção de grandes quantidades de proteínas rápidas e de baixo custo. Embora aqui se concentrar em glicoproteínas da superfície do vírus da gripe, este método também pode ser usado para produzir outras proteínas de superfície virais e celulares.

Introdução

Como uma primeira resposta ao recente surgimento do romance H7N9 estirpe do vírus da gripe na China, adquirimos plasmídeos que transportam as seqüências genômicas para a hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) genes dos dois primeiros isolados. Usando estes plasmídeos fomos capazes de construir rapidamente os vectores de expressão de baculovírus recombinante para a produção de HA e NA em células de insetos. Este sistema de expressão é bem estabelecida em nosso laboratório e provou crucial para muitos dos nossos projectos de investigação em curso ^1-8. Células de insetos são capazes de dobrar corretamente e após a tradução modificar proteínas complexas. Essas modificações incluem a glicosilação N-ligada, o que é importante para muitas glicoproteínas virais. Como tal, não é surpreendente que o sistema de baculovirus é bem estabelecida para a expressão de antigénios de superfície de vírus da gripe. De facto, muitas das estruturas cristalinas de HA e de NA foram resolvidos utilizando células de insecto expressaram proteínas ^9-11. Outra vantagem dosistema encontra-se em seus rendimentos de alta proteína confiáveis ​​de até 30 mg de HA / L de cultura de células (com base na nossa experiência com mais de 50 proteínas diferentes de HA) - uma conseqüência da infecção pelo vírus da expressão expulsos do forte promotor da poliedrina.

A remoção do domínio transmembranar e endodomínio de proteínas HA e NA permite a expressão de versões secretável, solúveis das proteínas e, assim, facilita muito o processo de purificação. Além disso, estes ectodomínios hexahistidina são marcados e podem, portanto, ser purificado usando a cromatografia de afinidade usando Ni ^{2 +-resina.} Os domínios transmembranares de proteínas HA e NA contribuir para homotrímero e formação homotetrâmero, respectivamente. A fim de preservar estes oligomerizations, que adiciona um domínio de trimerização C-terminal para a HA-, e um domínio N-terminal de tetramerização à AN construções (Figura 1). Temos mostrado de forma conclusiva que um tal domínio de trimerização estabiliza funcional, conserved epítopos conformacionais na haste do domínio de HA ^1. O tetramerização correta do NA também pode contribuir para corrigir dobrável e função NA ^10. Seqüências e vetores de transferência de baculovírus abrigando trimerização ou tetramerização domínios podem ser solicitadas aos autores ou de outros laboratórios no ^{campo, 9,10,12.}

Um outro problema importante para a expressão de proteínas secretadas em células de insectos é a escolha da linha de células para a direita. Enquanto Spodoptera frugiperda derivadas de células Sf9 suporte à replicação de baculovírus muito bem e são geralmente utilizados para resgate e propagação de vírus, eles têm a capacidade de secretar grandes quantidades de proteína limitado. Trichoplusia ni derivado BTI-TN-5B1-4 células (vulgarmente conhecido como High Five) têm uma capacidade maior secreção e são a linha de células de escolha para a expressão neste protocolo ^13,14. Além disso, é útil para reduzir ou até mesmo eliminar soro fetal bovino (FBS) a partir de culturas de expressão. Nós, portanto, usar a mídia com reduzida (3%) conteúdo FBS para o cultivo das ações de trabalho do vírus, e realizar a expressão da proteína em meio livre de soro.

Proteínas HA e NA recombinantes que são usados ​​para muitas técnicas imunológicas. Talvez o mais comum é em ensaios de ELISA para medir a soroconversão após a vacinação em humanos ou animais ^4,6,7,15. HAs e AEs são também utilizados em ensaios ELISPOT de ambas as moléculas estimuladoras e reagentes de detecção de células secretoras de anticorpos ^16. A sua utilização como iscas moleculares permite classificar especificamente para plasmablasts ou outros tipos de células-B, que podem então ser utilizados para isolar os anticorpos monoclonais (terapêutico) (mAbs). Moléculas de HA e NA recombinantes que são posteriormente usados ​​para a caracterização destes mAbs ^8. Outros exemplos incluem o estudo da estabilidade do pH ou especificidade do receptor de expressou por diferentes isolados de vírus, ou quantitativamente avaliar enzimática NA específicaactividade ou resistência a inibidores. Por outro lado, recombinante, purificada de HA pode ser utilizada para padronizar o conteúdo de HA de vacinas inactivadas do vírus da gripe.

Importante, rHA (e até certo ponto NA) candidatos a vacinas estão sendo testadas em modelos animais e ensaios clínicos em humanos com um candidato a vacina que está sendo licenciada pelo FDA em 2013 ^2,17-19. A vantagem destes novos vacinas é de que, devido à natureza recombinante destas proteínas, o processo de trabalho intensivo de geração de vírus de crescimento elevadas reassortant poderia ser evitado. Talvez ainda mais relevante é o fato de que seu rendimento HA é alto e reproduzível de estirpe para estirpe. Além disso, uma vez que essas vacinas são produzidas em um sistema de livre-ovo, eles não contêm contaminantes de proteínas que são problemáticos para indivíduos com alergias ao ovo.

Aqui nós escolhemos para expressar as proteínas HA e NA de dois isolados do romance chinês do vírus da gripe H7N9, A / Anhui/1/13 e A/Shanghai/1/13 ^20,21. Estes são exemplos oportunos, mas o protocolo descrito pode ser usado para a expressão de qualquer vírus influenza A e B proteínas HA ou NA e pode ser adaptado para expressar quaisquer outras proteínas virais ou celulares segregados. Proteínas transmembranares triméricos ou tetraméricos pode ser clonado em cassetes de expressão utilizados para HA e NA, respectivamente. No entanto, as proteínas celulares secretados mais solúveis, como interferons, por exemplo, não precisa de um domínio adicional para a estabilização e pode ser expresso apenas com uma marca de hexa-histidina C-terminal.

Protocolo

1. Geração de Baculovirus Recombinante

1. A clonagem em baculovírus transferência plasmídeos
   1. Clone H7 HA e NA N9 ectodomínio (ou qualquer outro gene de HA ou NA), em plasmídeos de transferência pFastBac modificados (ver introdução). Vectores de HA contendo um domínio de trimerização C-terminal e uma etiqueta de hexa-histidina, assim como para NA contendo um domínio N-terminal de tetramerização e tag hexa-histidina, foram descritos ^1,10,11,22 (Figura 1) e pode ser pedido a partir de os autores.
      Nota explicativa: ectodomínios HA expressas sem um domínio de trimerização vai ser dobrado de forma incorrecta, levando à perda de epítopos de neutralização conformacionais, em especial no domínio do talo. Da mesma forma, a função enzimática NA invoca tetramerização adequada.
   2. Geração de bacmids
      Transformação de transferência plasmídeos de baculovírus contendo genes HA e NA nas bactérias DH10Bac acordo com uma expressão de baculovírussistema de acordo com as instruções do fabricante. Isolar e purificar bacmids usando um kit Midiprep de acordo com as instruções do fabricante (Figura 2).
2. Resgate de baculovírus recombinante e verificação da expressão de proteínas
   Nota explicativa: Os seguintes passos têm de ser realizados assepticamente numa câmara de fluxo laminar. Execute este procedimento de forma independente para HA e NA (ou qualquer outro gene de interesse). As células de insecto são normalmente cultivadas a 28 ° C, sem _CO2. Células Sf9 para este protocolo são cultivadas em meios completos de células de insecto TNM-FH suplementado com 10% FBS, 1% de Pen-Strep ^* e solução Pluronic F68 a 0,1%, se não for indicado de outra forma, e passadas a 1:04 duas vezes por semana. High Five de células são cultivadas em meio de soro livre SFX 1:15 e passadas duas vezes por semana.
   ^* A adição de antibióticos deve ser considerada opcional ao longo do protocolo e ajustado de acordo com as práticas utilizadas em cada laboratório.
   1. Placa de células de insecto Sf9 em placas de 6 poços a uma densidade de 2 x 10 ⁵ células / cm ² e deixar repousar durante 20 minutos, num incubador de 28 ° C (sem _CO2).
   2. Misture 2 mg (concentração de 0,5-2 mg / ul) de bacmídeo recombinante com 100 l de meio TNM-FH (sem soro, 1% Pen-Strep). Misture 6 l de agente de transfecção com 100 l de meio TNM-FH (soro livre, Pen-Strep). Combine os dois volumes, misture delicadamente e deixe descansar por 20 minutos em temperatura ambiente (mistura de transfecção). Incluir um pseudo-transfecção como controlo (Figura 3).
   3. Remover o sobrenadante a partir de células Sf9 embutidas (células irá agora ficar com a placa) e substitua com 2 ml de meio isento de soro TNM-FH contendo Pen-Strep (1%). Adicionar o volume total da mistura de transfecção (a partir do passo 1.2.2) e agitar a placa de 6 poços cuidadosamente durante 5 segundos. Incubar numa incubadora de 28 ° C, sem CO ₂ durante 6 horas (Figura 3).
   4. Substitua wi mídiacompletas mídia TNM-FH fresco th (contendo 10% de FBS, 1% de Pen-Strep e 0,1% de Pluronic F68). Incubar numa incubadora de 28 ° C, sem CO ₂ durante 6 dias. Verifique ocasionalmente células sob um microscópio. As células infectadas aparecem geralmente maior, mais redondo, ampliaram núcleos, e começar a separar (Figura 4).
   5. Colheita das células e a confirmação da expressão da proteína
      1. Colheita de células 6 dias após a transfecção por centrifugação a 2000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. O sobrenadante contém o baculovirus recombinante - o que irá ser utilizado para gerar stocks de trabalho imediatamente, ou pode ser armazenado a 4 ° C durante anos.
      2. Para verificar a expressão da proteína coletar pelotas e ressuspender em 500 mL de PBS. Misturar 50 ml da suspensão com 50 mL de tampão de carga de SDS-PAGE (contendo um agente de redução). Executar SDS-PAGE e efectuar uma análise de Western blot com um anticorpo anti-hexa-histidina para confirmar a expressão do gene. Incluir células do simuladotransfecção como controlos negativos (Figura 3).
   6. Elaboração de ações de trabalho
      1. Placa 5 x 10 ⁵ células Sf9 / cm ² em um frasco T175 cm ² e deixe descansar por 20 min permitir que eles atribuem ao prato. Substitua completo mídia TNM-FH com a mídia TNM-FH contendo 3% FBS (e 1% Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68).
      2. Infectar as células com 100 ul do sobrenadante de resgate. Incubar numa incubadora de 28 ° C, sem CO _2, durante 6 dias e, ocasionalmente, se vá obter células infectadas (tal como descrito no passo 1.2.5.).
      3. Gire a 2.000 xg à temperatura ambiente durante 5 minutos e recolher o sobrenadante. Este é agora o seu estoque P2. Este material pode ser armazenado indefinidamente a 4 ° C. Repita o procedimento de infecção usando 100 mL do estoque P2 para infectar as células. O material resultante é denominada P3 ou estoque de trabalho, que pode ser armazenado a 4 ° C ou utilizado directamente para a expressão da proteína. O estoque P3 geralmente contém 10 ^{7 a 10 9 unidades formadoras de placas / ml.}

2. Protein Expression and Purification

Nota explicativa: células Sf9 suportar o crescimento de baculovirus muito bem. No entanto, a sua capacidade para segregar grandes quantidades de proteína recombinante é limitada. Assim, utilizamos uma outra linha de células de insectos, células de High Five, para a expressão de proteínas recombinantes segregadas. Estas células não suportam a replicação de baculovírus para muito altos títulos ^13, mas têm alta capacidade secretora.

1. Crescendo High Five células
   Crescer High Five células em meio de cultura celular SFX inseto em T175 cm ² frascos. Passagem a cada dois dias 01:03. Para uma cultura de 200 ml expressão que você vai precisar para crescer 5 frascos confluentes.
2. Colheita e infectar células High Five
   1. Retire High Five células de 5 cm ² frascos T175 tocando os frascos com a mão. Recolher o suspe celularnsion e transferir para tubos de 50 ml de centrifugação.
   2. Gire a 1.200 xg por 7 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante por decantação e unir as pelotas por ressuspensão em 15 ml de estoque P3.
   3. Deixar repousar durante 15 minutos na câmara de fluxo (Figura 5).
   4. Transferir 200 ml de Hyclone SFX meio de cultura em um, estéril 1000 ml frasco agitador limpo (sem Buffles, selado com folha de alumínio antes da autoclavagem, não deveria ter sido usado para culturas bacterianas antes).
   5. Transferir a suspensão P3/cell para o balão agitador. Seal com folha de alumínio estéril e frasco de transferência num shaker. Agitar a 70 rpm a 28 ° C durante 72-96 horas.
3. Colhendo proteína recombinante a partir de cinco altos sobrenadantes expressão celular
   1. 72-96 hr de transferência de sobrenadante de cultura de infecção pós em 500 ml baldes centrifugação. Gire a 5.500 xg por 20 min a 4 ° C. Entretanto lave os frascos shaker 3x com água bidestilada_(DdH2O).
   2. Transferência de 3 ml de resina Ni-lama para um tubo de 50 ml com 45 ml de PBS (uma necessária por 200 ml de cultura). Agitar bem e girar a 3000 xg à temperatura ambiente durante 10 min. Decantar o PBS e manter o sedimento. Mistura-se o sobrenadante de células de insecto com o sedimento de Ni-resina e transferir para os frascos de agitação já lavadas. Incubar a 4 ° C durante 2-4 horas, enquanto se agita (Figura 6).
   3. Monte 10 ml coluna de polipropileno em um grampo em um suporte de apoio. Remova as duas tampas e coloque um copo abaixo da coluna para coletar o fluxo através (resíduos). Tomar o agitador rotativo para fora do agitador e começar a transferir a mistura do sobrenadante / pasta na coluna, que irá reter o Ni-resina e apenas o sobrenadante irá fluir. Passar todo o volume ao longo da coluna (Figura 7).
   4. Lavar as resinas com 4x 15 ml de tampão de lavagem (50 mM de Na ₂ HCO _3, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8). Vamos todos a fuga tampão de lavagema partir da coluna e fechá-lo com a tampa (lado inferior).
   5. Adicionar 2 ml de tampão de eluição (50 mM de Na ₂ HCO _3, NaCl 300 mM, 300 mM de imidazol, pH 8) e deixar repousar durante 5 min. Abra coluna e recolher o eluído. Repetir este procedimento mais três vezes (com um total de 8 ml de tampão de eluição). O eluato que contém elevadas concentrações de proteína apresenta tipicamente espuma quando agitadas (Figura 7). Mantenha eluato no gelo molhado sempre que possível.
4. Troca e concentração do tampão
   1. Prespin 15 ml unidades de centrifugação (de ultrafiltração de 30 kDa de corte para HA / NA, mas pode variar dependendo do tamanho da proteína purificada) com PBS (pH 7,4-7,6) a 3000 xg, a 4 ° C durante 20 min. Descartar fluir através de e carga eluído na coluna rodada. Encha-se com 5 ml de estéril, gelada PBS e centrifugação por 60 minutos a 3.000 xg, a 4 ° C.
   2. Fluxo de descarga através de novo, encha com 15 ml de PBS gelado e rotação por 60 minutos a 3.000 xg, a 4 ° C. Repita este procedimentoDure mais uma vez.
   3. Tome a coluna girar fora da centrífuga e recolher o tampão trocado concentrado (tipicamente 200 mL). Isto é altamente concentrada de proteína recombinante. Lavar a coluna de spin com 400 l de estéril gelada PBS e adicione ao concentrado. Manter o concentrado em gelo em todos os momentos.

3. Caracterização e Controle de Qualidade

1. Medição de concentração de proteínas
   Tome uma alíquota do concentrado e medi-la usando o método de quantificação de proteínas de escolha. Definir a concentração de proteína a 1 mg / ml por adição de PBS e congelar pequenas alíquotas a -80 ° C. Ciclos de descongelamento Congelar prejudicar a estrutura da proteína e pode levar à agregação.
2. SDS-PAGE e coloração com Coomassie
   Executar 500 ng de sua proteína numa SDS-PAGE e efectuar uma coloração com Coomassie. Para a coloração rápida e conveniente utilizar o reagente de Coomassie, em combinação com um protocolo de micro-ondas. Proteínas HA normalmente aparecem em 64kDa enquanto que as proteínas de NA devem funcionar com um tamanho de cerca de 56 kDa (Figuras 8A e B). Usando o protocolo descrito você não deve ver qualquer produto de degradação. Se ocorrer a degradação é geralmente um sinal de contaminação por fungos / fúngico durante a expressão. Neste caso, repita o procedimento e certifique-se de manter tudo estéril.
3. Western blot / ELISA
   A fim de verificar a identidade da proteína recomendamos fazer para um Western blot ou ensaio ELISA com um anticorpo específico. Idealmente, ensaios de ELISA são efectuadas com um anticorpo que se liga aos epítopos conformacionais (por exemplo, anticorpos anti-HA haste ^1). Usando um tal anticorpo o enrolamento correcto da proteína pode ser confirmada (Figura 8C).
4. Medindo NA atividade
   Enrolamento correcto da NA virai também podem ser determinados medindo a actividade de NA. Sugerimos realizar este teste usando o ensaio NA * STAR comercialmente disponível (apenas seguir as orientações do usuário).

Resultados

Moléculas de HA e de A/Shanghai/1/13 A/Anhui/1/13 expressa bem com rendimentos de cerca de 20 mg / L de cultura. Moléculas de NA de ambas as estirpes apresentaram níveis moderados de expressão variam entre 0,2 mg / L de cultura para A/Shanghai/1/13 a 0,7 mg / L para A/Anhui/1/13. Todas as quatro preparações de proteína teve muito pouco ou nenhum impurezas (Figuras 8A e B) com vem sendo de pureza mais elevada do que o AN, que pode ser explicado por o nível de expressão. A/Shangh...

Discussão

Embora a expressão de proteínas do vírus da influenza, HA e NA em células de insecto utilizando o sistema de expressão de baculovírus é geralmente para a frente, existem diversos pontos importantes a considerar. É importante, como apontado na introdução, que ectodomínios da HA e NA são expressos em fusão com trimerização ou tetramerização domínios, respectivamente. Estes domínios de assegurar a correcta dobragem das moléculas normalmente assistida por o domínio transmembranar, o que não está prese...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bac-to-Bac Baculovirus expression system	Invitrogen	10359-016	Follow manufacturer's instructions
TNM-FH insect medium	Gemini Bioproducts	600-311
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher	SH30278.02
Cellfectin II Reagent	Invitrogen	P/N58760
Pluronic F68	Sigma	1000702664
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018240
Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K	Millipore	UFC902024
Pen Strep	Gibco	15140-122
Polypropylene Columns (5 ml)	Qiagen	34964
Max efficiency DH10Bac bacteria	Invitrogen	10361-012
PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit	Invitrogen	K210015
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399-100G	for elution and wash buffers
Sf9 cells	ATCC	CRL-1711
High Five cells	Invitrogen	B85502