النخاعي السوائل عن طريق الرنا الميكروي التنميط الكمي في الوقت الحقيقي PCR

Summary

نحن تصف بروتوكول الوقت الحقيقي PCR لملف microRNAs في السائل النخاعي (CSF). باستثناء بروتوكولات استخراج الحمض النووي الريبي، ويمكن تمديد هذا الإجراء إلى الحمض النووي الريبي المستخرج من مخالطة سوائل جسمه الأخرى، الخلايا المستزرعة، أو عينات الأنسجة.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) تشكل طبقة قوية من تنظيم الجينات من خلال توجيه RISC لاستهداف مواقع تقع على mRNAs و، وبالتالي، من خلال تحوير قمعهم متعدية. وقد تبين أن التغيرات في التعبير ميرنا أن تشارك في تطوير جميع الأمراض المعقدة الكبرى. علاوة على ذلك، أظهرت النتائج الأخيرة التي miRNAs يمكن يفرز في البيئة خارج الخلية وتدخل إلى مجرى الدم وسوائل الجسم الأخرى حيث يمكن أن تعمم مع ارتفاع الاستقرار. لا تزال وظيفة مثل هذه miRNAs تعميم بعيد المنال إلى حد كبير، ولكن قد يؤدي النهج إنتاجية عالية منهجية، مثل ميرنا صفائف التنميط، إلى التعرف على التواقيع ميرنا في العديد من الحالات المرضية، بما في ذلك الاضطرابات العصبية وعدة أنواع من السرطان. في هذا السياق، وتحديد ميرنا الشخصي التعبير في السائل النخاعي، كما ورد في دراستنا الأخيرة، يجعل miRNAs المرشحين جذابة للتحليل العلامات البيولوجية. _content "> هناك العديد من الأدوات المتاحة لالتنميط microRNAs، مثل ميكروأرس، الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QPCR)، وتسلسل عميق. هنا، نحن تصف طريقة حساسة لملف microRNAs في السوائل المخية التي كتبها الكمي في الوقت الحقيقي PCR. نحن استخدام Exiqon الرنا الميكروي جاهزة للاستخدام الألواح الإنسان PCR الأول والثاني V2.R، والذي يسمح الكشف عن 742 microRNAs الإنسان فريدة من نوعها. أجرينا صفائف في أشواط ثلاث نسخ، ونحن المصنعة وتحليل بيانات باستخدام برنامج GENEX المهنية 5.

باستخدام هذا البروتوكول، لدينا لمحة بنجاح microRNAs في أنواع مختلفة من خطوط الخلايا والخلايا الأولية، CSF، والبلازما، والأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين الثابتة الفورمالين.

Introduction

MicroRNAs تنتمي لعائلة صغيرة (21-23 الإقليم الشمالي في الطول) غير المكودة الرنا التي تنظم التعبير الجيني آخر ما بعد transcriptionally. microRNAs يمكن يفرز في الفضاء خارج الخلية حيث تبدو مستقرة نسبيا. مع تحديد التغيرات في التعبير ميرنا يمكن أن يكون خطوة مهمة نحو تحديد المؤشرات الحيوية، وأداء لمحات ميرنا والتعامل مع كمية كبيرة من البيانات قد تكون مخيفة.

هنا، نحن تصف بروتوكول لتحديد التغيرات في التعبير ميرنا في السائل النخاعي (ينطبق على سوائل الجسم الأخرى) من قبل في الوقت الحقيقي PCR الحساسة. نحن أيضا وصف استخدام البرمجيات لتحليل البيانات، بما في ذلك التحليل الإحصائي وتمثيل رسومي للنتائج. الإجراء بأكمله من السهل نسبيا ومباشرة، واعتمادا على عدد من العينات المراد لمحة وعدد من آلات PCR الوقت الحقيقي متاحة، أيضا سريع نسبيا. الجزء التجريبي يتطلب الدقة في التعامل معالحمض النووي الريبي وpipetting لفي لوحات 384 جيدا، في حين أن قسم تحليل البيانات باستخدام GENEX يتطلب بعض المعرفة الأساسية في مجال المعلوماتية والإحصاءات.

Protocol

يصف بروتوكول التالية الإجراء العادي لعزل الحمض النووي الريبي من CSF و ملفه الشخصي microRNAs باستخدام لوحات PCR جاهزة. علما بأن استخراج مرحلة العضوية هو اختياري، والتي يتم إضافتها على الحمض النووي الريبي الناقل للعينة خلال استخراج ضمان الانتعاش القصوى من الحمض النووي الريبي. وبالتالي، ليست هناك حاجة لتحديد الحمض النووي الريبي.

عموما، يمكن تشغيل ما معدله 6-8 لوحات في يوم واحد إذا تم تصنيعه [كدنا] قبل (حوالي 2 ساعة) في اليوم. يتم تنفيذ تحليل البيانات عندما تم محة عن العينات وتحميلها في البرنامج. اعتمادا على عدد من العينات / مجموعات أو الجمع بينهما للمقارنة، قد تتطلب تحليل البيانات من واحد إلى عدة ساعات.

1. استخراج الحمض النووي الريبي

تم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي من عينات السائل النخاعي، وتخزينها في المجمد -80 درجة مئوية في مأخوذة حتى التحليل. لهذا الإجراء تم استخدام عدة العزلة mirVana باريس، في أعقاب الصكوك الشركة المصنعةctions لعزل الحمض النووي الريبي مجموع. يرجى ملاحظة أنه على الرغم من تخصيب للأنواع الحمض النووي الريبي الصغيرة هو ممكن مع هذه المجموعة، لا يتم إجراء هذه الخطوة ويتم إنهاء إجراءات استخراج الحمض النووي الريبي مجموع الخطوة بعد عزل الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن عدة العزلة mirVana باريس (مثل غيرها من مستلزمات عزل الحمض النووي الريبي متوفرة تجاريا) لا يتطلب استخراج العضوية، وبروتوكول لهذا الإجراء يمكن الاطلاع أدناه.
بروتوكول لاستخراج الحمض النووي الريبي يتكون من خطوتين:
1.1. استخراج العضوية (غير مطلوب إذا باستخدام mirVana باريس عدة استخراج الحمض النووي الريبي)
1.2.2. مجموع عزل الحمض النووي الريبي

1.1. استخراج العضوية

1.1.1. إعداد الكواشف

1. إضافة 375 ميكرولتر من 2 المركابتويثانول إلى 2x تغيير طبيعة الحل، وتخزينها في 4 درجات مئوية.

1.1.2. إعداد CSF

1. ذوبان الجليد كل قسامة من CSF على الجليد قبل استخراج الحمض النووي الريبي. إضافة 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي الناقل MS2 إلى 0.5 مل من السائل النخاعي إذابة وبلطفالمزيج. لاحظ أنه إذا تم حذف استخراج العضوية، وستضاف الناقل MS2 إلى عينة عزل الحمض النووي الريبي قبل وصفها في 1.2.2.1 أدناه.
2. خلط 0.5 مل من 2X تغيير طبيعة الحل في درجة حرارة الغرفة إلى CSF.
3. إضافة 1 مل من حمض الفينول: كلوروفورم إلى CSF بالإضافة إلى تغيير طبيعة الحل 2X: تأكد من سحب مرحلة القاع التي تحتوي على حمض الفينول: كلوروفورم، وليس العازلة المائية التي تقع على قمة الخليط. بالإضافة إلى ذلك، لاحظ أن حمض الفينول: كلوروفورم يحتوي على الفينول، وهو السم ومصدر إزعاج، والقفازات وغيرها من استخدام معدات الوقاية الشخصية عند العمل مع هذا كاشف.
4. دوامة لمدة 30-60 ثانية إلى المزيج. للراحة، ومل من عينة 2 / تغيير طبيعة الحل / حمض الفينول: كلوروفورم مزيج تنقسم إلى قسمين أنابيب 1.5 مل إيبندورف.
5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في أقصى سرعة (10،000 x ج) في درجة حرارة الغرفة.
6. إزالة بعناية (العلوي) المرحلة المائية من دون إزعاج مرحلة أقل أو الطور البيني وتحويلها إلىأنبوب جديد. لاحظ حجم استردادها.

1.2. عزل الحمض النووي الريبي

فمن المستحسن أن يكون لها مقعد مخصص، مجموعة من الماصات، ورفوف للتعامل مع عينات الحمض النووي الريبي. يتم تطهير منطقة العمل والأدوات باستخدام رذاذ ريبونوكلياز زاب ومناديل قبل كل تجربة.

1.2.1. إعداد الكواشف:

1. إضافة 21 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ لميرنا غسل الحل 1 و 40 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ لغسل الحل 2/3. يرجى ملاحظة أن ميرنا غسل الحل 1 يحتوي على ثيوسيانات guanidium التي هي عبارة عن مادة يحتمل أن تكون خطرة.

1.2.2. مجموع عزل الحمض النووي الريبي

1. إضافة 1.25 حجم درجة حرارة الغرفة الإيثانول بنسبة 100٪ إلى المرحلة المائية من استخراج العضوية وتخلط جيدا.
2. وضع خرطوشة تصفية في واحدة من أنابيب جمع.
3. ماصة لا يزيد عن 700 ميكرولتر من خليط المحللة / الإيثانول على خرطوشة تصفية.
4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية كحد أقصىالسرعة. تطبيق الخليط تتجاوز 700 ميكرولتر في التطبيقات المتتالية لنفس المرشح. تجاهل التدفق من خلال بعد كل الطرد المركزي وحفظ أنبوب جمع للخطوات الغسيل.
5. تطبيق 700 ميكرولتر ميرنا غسل الحل 1 إلى خرطوشة تصفية وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في أقصى سرعة. تجاهل التدفق من خلال أنبوب من جمع واستبدال خرطوشة تصفية في نفس مجموعة أنبوب.
6. تطبيق 500 ميكرولتر محلول الغسيل 2/3 وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في أقصى سرعة. تجاهل التدفق من خلال أنبوب من جمع واستبدال خرطوشة تصفية في نفس مجموعة أنبوب. تطبيق 500 ميكرولتر الثانية محلول الغسيل 2/3 وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في أقصى سرعة. تجاهل التدفق من خلال أنبوب من جمع واستبدال خرطوشة تصفية في نفس مجموعة أنبوب. تدور الجمعية لمدة 1 دقيقة في أقصى سرعة لإزالة السوائل المتبقية من التصفية.
7. نقل خرطوشة تصفية في أنبوب جمع الطازجة. تطبيق 100 ومو؛ لتر من مسخن (إلى 95 درجة مئوية) nuclease خالية من المياه لوسط التصفية، وأغلق الغطاء. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في أقصى سرعة لاسترداد الحمض النووي الريبي.
8. جمع الحمض النووي الريبي التي تحتوي على شطافة وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة التطبيقات اللاحقة.
9. قياس 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي باستخدام معمل معمل NanoDrop 2000C. لاحظ أن الحمض النووي الريبي الكمي يمكن تخطي إذا تم إضافة حاملة الحمض النووي الريبي للعينة خلال استخراج الحمض النووي الريبي. في هذه الحالة يتعرضون 8 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي لتخليق [كدنا] كما هو مفصل أدناه.

2. الملف ميرنا: بروتوكول QRT-PCR

بروتوكول لميرنا التنميط يتكون من خطوتين:

1. التوليف [كدنا] أول حبلا
2. في الوقت الحقيقي PCR التضخيم

2.1. التوليف [كدنا] أول حبلا

2.1.1. تمييع القالب الحمض النووي الريبي

1. ضبط كل من عينات الحمض النووي الريبي القالب إلى تركيز من 5 نانوغرام / ميكرولتر باستخدام نوكلياز مجانية المياه. إذا كانولم يتم تحديد الحمض النووي الريبي (راجع الخطوة 1.2.2.9)، ثم تستخدم 8 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي لتخليق [كدنا]

2.1.2. إعداد الكواشف

1. ذوبان الجليد بلطف العازلة رد فعل 5X والمياه nuclease الحرة، ووضع على الفور على الجليد.
2. مزيج من قبل vortexing. resuspend والحمض النووي الريبي في ارتفاع بإضافة 40 ميكرولتر المياه مجانا نوكلياز إلى أنبوب ومزيج من قبل vortexing؛ ترك الأمر على الجليد لمدة 15-20 دقيقة. مباشرة قبل الاستعمال، وإزالة مزيج الانزيم من الثلاجة، ومزيج عبها بواسطة الأنابيب ووضع على الجليد. تدور أسفل كل الكواشف.

2.1.3. عكس الإعداد رد فعل النسخ

1. إعداد المبلغ المطلوب من حل RT العمل في أنبوب 1.5 مل إيبندورف، أو ما يعادلها (بالنسب المشار إليها في الجدول 1، باستثناء القالب الحمض النووي الريبي)، ومزيج من قبل vortexing (1-2 ثانية في سرعة قصوى)، وتدور لفترة وجيزة لأسفل ( ونحن نستخدم أجهزة الطرد المركزي إيبندورف مصغرة مع سرعة ثابتة، و 10 ثانية) ووضعه على الجليد. لاحظ أن الحمض النووي الريبي ارتفاع UniSp6في يضاف إلى العينة قبل رد الفعل RT (انظر الجدول 1).
2. الاستغناء RT حل العمل في نوكلياز أنابيب PCR الحرة.
3. الاستغناء قالب الحمض النووي الريبي في كل أنبوب.
   ملاحظة: تذكر لحساب 10٪ حجم الفائض / كل كاشف للpipetting لو / أو حجم القتلى الروبوتية. ص>

   كاشف	الفريق الأول المجلد (ميكرولتر)	الفريق الأول + الثاني المجلد (ميكرولتر)
   5X العازلة رد فعل	4.4	8.8
   نوكلياز مجانية المياه	9.9	19.8
   مزيج انزيم	2.2	4.4
   UniSp6 RNA سبايك في قالب	1.1	2.2
   الحمض النووي الريبي مجموع القالب (5 نانوغرام / ميكرولتر)	4.4	8.8
   اجمالى حجم التداول	22	44

   
   الجدول 1. عكس النسخ الإعداد التفاعل.

2.1.4. خلط وتدور الكواشف

1. خلط رد فعل من جانب لطيف (1-2 ثانية) vortexing للضمان أن جميع الكواشف يتم خلطها بشكل تام. بعد الاختلاط، وتدور باستمرار (مصغرة الطرد المركزي إيبندورف مع سرعة ثابتة، و 10 ثانية).

2.1.5. احتضان وتعطيل الحرارة

1. برمجة جهاز PCR على النحو التالي:
2. احتضان لمدة 60 دقيقة في 42 ° C
3. للحرارة إبطال نشاط الناسخ العكسي لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية
4. بارد على الفور إلى 4 درجات مئوية
5. تخزينها في 4 درجة مئوية أو التجميد
   ملاحظة: يمكن أن توقف البروتوكول في هذه المرحلة. قد أبقى [كدنا] مخفف في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 أسابيع (مخزن اختياري في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام).

الطبقة = "jove_step"> 2.2. في الوقت الحقيقي PCR التضخيم

2.2.1. إعداد الكواشف لفي الوقت الحقيقي PCR

1. وضع كدنا] (من الخطوة 2.1.5) على الجليد.
2. ذوبان الجليد المياه الحرة وماستر PCR مزيج نوكلياز على الجليد. حماية PCR قارورة مزيج الماجستير من الضوء من خلال تغطية لهم رقائق الألومنيوم. فورا قبل الاستخدام، وخلط مزيج ماجستير PCR من قبل vortexing 1-2 ثانية في جهاز للطرد المركزي مصغرة وتدور باستمرار في 1،500 x ج لمدة 1 دقيقة.

2.2.2. الجمع بين SYBR الأخضر مزيج الرئيسي، والمياه، وكدنا] وإضافة إلى لوحات PCR

ينصح الإجراء التالي لتجنب تركيزات منخفضة من [كدنا] من الانضمام إلى سطح الأنبوب:

1. قبل إزالة الختم لوحة، وتدور لفترة وجيزة لأسفل لوحة (ق) في جهاز للطرد المركزي المبردة في 1،500 x ج لمدة 1 دقيقة.
2. في أنبوب 15 مل المخروطية، والجمع بين 2X PCR مزيج الماجستير والمياه. الفريق الأول: 2،000 ميكرولتر مزيج الرئيسي 2X و1،980 ميكرولتر المياه؛ وحة I + II: 4،000 ميكرولتر مزيج الرئيسي 2X و3،960 μ؛ لتر ماء.
3. إضافة 20 ميكرولتر [كدنا] (الفريق الأول) أو 40 ميكرولتر [كدنا] (لوحة I + II) والمزيج.
4. المزيج بلطف من قبل vortexing 1-2 ثانية وتدور باستمرار في جهاز للطرد المركزي المبردة في 1،500 x ج لمدة 1 دقيقة.
5. وضع PCR ماستر مزيج / [كدنا المزيج في ماصة الأقنية الخزان. قد يكون لديك لتحديد الخزان الذي يحتوي على طول ماصة الأقنية. هذا يحافظ على مستوى حجم عالية بما فيه الكفاية ليسمح مأخوذة حجم مساو في جميع أنحاء الأقنية. هذا أمر بالغ الأهمية نحو مأخوذة القليلة الماضية.
6. الاستغناء PCR 10 ميكرولتر مزيج ماستر / كدنا] مزيج إلى كل بئر من لوحة 384 جيدا باستخدام ماصة 16 قناة.
7. ختم لوحة مع الختم البصرية.
8. تدور لفترة وجيزة في لوحة أجهزة الطرد المركزي المبردة (1،500 x ج لمدة 1 دقيقة)، وخلط الحلول وإزالة فقاعات الهواء.
   
   ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتا التجربة في هذه المرحلة. ردود الفعل تخزين محمية من الضوء في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة.

2.2.3. في الوقت الحقيقي PCR

أداء في الوقت الحقيقي PCR التضخيم وتحليل منحنى ذوبان التالية المعلمات المفصلة في الجدول 2.

الخطوة العملية	الإعدادات، روش LC480
البلمرة تفعيل / تمسخ	95 ° C، 10 دقيقة
توسيع	45 دورات التضخيم في 95 ° C، 10 ثانية 60 درجة مئوية، 1 دقيقة معدل المنحدر 1.6 ° C / ثانية قراءة البصرية
تحليل منحنى ذوبان	نعم

الجدول 2. في الوقت الحقيقي PCR الظروف دورة باستخدام روش LightCycler 480.

2.3. في الوقت الحقيقي PCR تحليل البيانات

ويتم في الوقت الحقيقي PCR تحليل البيانات مع Exiqon GENEX الاحترافية 5.0، ر التاليةوأوصى التعليمات. وGENEX خطوة بخطوة دليل يمكن تحميلها في http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf
يتكون تحليل البيانات من ثلاث خطوات:

1. استيراد البيانات
2. تجهيزها من البيانات
3. التحليل الإحصائي

2.3.1. استيراد البيانات

1. في روش LightCycler 480 حدد أسلوب التحليل المشتقة ^{الثانية} (2) وحساب القيم الكلوروكوين. ويتم تصدير البيانات كجدول وحفظها كملفات نصية.
2. لاستيراد البيانات، مفتوحة GENEX وانقر على زر معالج الاستيراد Exiqon وانقر على زر "البدء". اتبع الإرشادات لتحديد الشكل، والصك وملف تخطيط لوحة (ق). لاحظ أن ملفات تخطيط لوحة (ملفات اكسل) يتم تحميلها من موقع على شبكة الإنترنت Exiqon ( http://www.exiqon.com/plate-layout-files ).
3. المجمدةر الفريق الأول والثاني وانقر على زر "التالي".
4. الجدول إنشاؤها بعد ملف الاستيراد يحتوي على أعمدة محددة مسبقا. أسماء العينات يمكن تحريرها والأعمدة تصنيف يمكن إضافة أو إزالة في هذه الخطوة. انقر على زر "التالي" عند الانتهاء.
5. حفظ البيانات وتحميل البيانات إلى محرر.

2.3.2. تجهيزها من البيانات

1. على النحو الموصى به من قبل Exiqon وGENEX، عند المقارنة بين لوحات متعددة أول شيء نفعله هو لمعايرة البيانات بين لوحات عن طريق اختيار بين لوحة المعايرة من القائمة تجهيزها.
2. فمن المستحسن لتشغيل صفائف ميرنا في أشواط ثلاث نسخ. إذا كان ميرنا غير موجود في اثنين على الأقل من أصل ثلاث نسخ طبق الأصل أن يتم تعيين أنها nonexpressed.
3. في الخطوة التالية في تجهيزها، ووضع قطع. تحديد قيمة قطع يشير إلى أن البيانات مع دورة عتبة (C _ر) أعلى من هذه القيمة يتم تجاهل. في التجارب الحالية باستخدام عينة السائل النخاعي، تم تعيين قطع في 39. ذرefore، سيتم تجاهل جميع العينات مع C _ر أعلى من 39 في النسخ المتماثلة الثلاثة. إذا كان لديه ميرنا C _ر> 39 لتحقيق واحد (نسخة متماثلة واحدة من أصل ثلاثة)، سيتم استبدال تلك القراءة مع متوسط ​​C _طن الآخر تحقيقين، شريطة أن تكون كلا أدناه 39.
4. تحديد الجينات المرجعية. GENEX المهنية لديه خيار للاستفادة geNorm و / أو NormFinder لتحديد الجينات المرجعية. تحديد قائمة لل miRNAs التي تحتوي على قيم الكلوروكوين مماثلة في جميع العينات وتشغيل geNorm و / أو NormFinder. وفقا لهذا التحليل، في المثال المقدمة هنا، وكان مير 622 ومير 1266 أهم القيم موحدة عبر العينات وكما تم اختيار الجينات المرجعية (الشكل 1).
5. المقبل، يتم تطبيع البيانات باستخدام الجينات المرجعية والقيم التي تم الحصول عليها تتوافق مع _ر ΔC
6. إذا أجريت ردود فعل التوليف [كدنا] في يثلث، في هذه النقطة يجب أن متوسط ​​القيم.
7. التحقق من صحة ورقة لإعادةنقل أعمدة فارغة وخاوية تقريبا. في إطار تجهيزها حدد "التحقق من صحة ورقة" ومما تنطبق على إزالة خط أعمدة فارغة. في السطر التالي، اختارت النسبة المئوية المطلوبة من بيانات صالحة وانقر فوق تطبيق. على سبيل المثال، حدد 100٪ إذا كنت ترغب في مقارنة miRNAs فقط مشتركة بين جميع العينات.
8. معالجة البيانات المفقودة.
   حدد "بيانات مفقود" من القائمة تجهيزها واختار واحد من الخيارات للتعامل مع البيانات المفقودة. مطلوب هذه الخطوة. نلاحظ أن GENEX سوف أعطيك خطأ إذا حاولت تحميل الملفات التي تحتوي على بيانات مفقودة لم تتم معالجته.
9. تحديد الكمي النسبي بين مجموعات من عينات (أي. التجربة مقابل السيطرة). يتم حساب الكمي النسبي بين المجموعات باستخدام ΔΔ C طريقة _ر. في GENEX، انقر فوق علامة التبويب تجهيزها وتحديد الكمي النسبي. في إطار اختيار المجموعة المرجعية وضرب تطبيق. لاحظ أن للتمثيلات رسومية و / أو لمزيد من التحليلات الإحصائية، EXPRيجب تحويل البيانات ession إلى مقياس لوغاريتمي. في القائمة تجهيزها، حدد Log2.

2.3.3. التحليل الإحصائي

برنامج يسمح GENEX مجموعة واسعة من التحليلات الإحصائية، بما في ذلك اختبار T-ANOVA و.

1. تحميل ملف يمول النهائي في GENEX وإدارة البيانات المفتوحة. فمن الأهمية بمكان لتحديد عينات أو مجموعات الصحيح للعينات التي تم إجراء التحليل الإحصائي.
2. حدد "الإحصاء" واختار رمز المقابلة لاختبار المطلوب.
3. انقر على زر "تشغيل" في إطار لوحة التحكم. حفظ النتائج على النحو التفوق أو الملفات يمول.

2.3.4. التنميط التعبير

MicroRNAs والعينات ويمكن تصنيف، مجمعة، وتصور على نار خرائط وdendrograms، على النحو التالي

1. تحميل ملف يمول النهائي في GENEX وإدارة البيانات المفتوحة. استخدام هذه النافذة لتحديد مجموعات من عينات أو miRNAs وخلق. انقر فوق "تطبيق" عند الانتهاء.
<لى> في الزاوية اليسرى العليا حدد العنقودية وانقر على أيقونة heatmap
2. في إطار لوحة التحكم انقر فوق "تشغيل". يمكن حفظ heatmap في أشكال مختلفة مثل شجار أو BMP، بل يمكن أيضا أن يتم نسخها وتعديلها حسب الحاجة.

النتائج

النتائج من هذه الدراسة قد نشرت سابقا ^1. الشكل 1 يبين النتائج من تحليل microRNAs المرجعية المرشحة باستخدام تطبيق geNorm. وفقا لذلك، وهما microRNAs، مير 622 ومير 1266، كما تم تحديد الجينات المرجعية، وكانت تستخدم لتطبيع القيم ميرنا.

ل...

Discussion

MicroRNAs هي الرناوات غير المكودة الصغيرة التي تنظم التعبير الجيني عن طريق تثبيط الترجمة و / أو تعزيز تدهور مرنا ^2. بسبب ارتفاع الاستقرار في ظروف خالية من الخلايا، وقد تم الكشف عن microRNAs في كثير من سوائل الجسم. علاوة على ذلك، ارتبط الشخصي التعبير متميزة من microRNAs مع المر...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3. List of equipment.
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Pipette Tips	Thermo Scientific	9400613
Thermal Cycler C1000	Biorad
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes	Biorad	TLS0801
Flat Cap Strips	Biorad	TLS0803
LightCycler 480 Real-Time PCR System	Roche
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche	04 729 757 001
Refrigerated Centrifuge 5804R	Eppendorf
Swing-bucket Rotor, 4-place	Eppendorf	A-4-44
Bench-Top Mini Centrifuge	Fisher	05-090-100
Bench-Top Vortex	Fisher
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized	Fisher	02-681-5
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173
Table 4. List of reagents.
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml	Exiqon	203400
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana miRNA isolation Kit, 40 isolations	Ambion	AM1556
MS2 RNA carrier	Roche Applied Science	10165948001
2-mercaptoethanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
Ethanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nuclease free water	Qiagen	1039480
RNAse Zap	Ambion	AM9780