A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
אנו מתארים פרוטוקול של PCR בזמן אמת לפרופיל מיקרו RNA בנוזל המוח והשדרה (CSF). למעט פרוטוקולי מיצוי RNA, ההליך יכול להתארך עד RNA המופק מנוזלים אחרים בגוף, תאים בתרבית, או דגימות רקמה.
מיקרו RNA (miRNAs) מהווה שכבה חזקה של ויסות הגנים על ידי המנחה RISC למקד לאתרים הממוקמים על mRNAs וכתוצאה מכך, על ידי ויסות דיכוי translational שלהם. שינויים בביטוי מירנה הוכחו להיות מעורבים בפיתוח של כל המחלות מורכבות הגדולות. יתר על כן, הממצאים אחרונים הראו כי יכול להיות מופרש miRNAs לסביבה תאית ולהיכנס למחזור הדם ונוזלי גוף אחרים שבו הם יכולים להסתובב עם יציבות גבוהה. הפונקציה של miRNAs במחזור כזה נשארה במידה רבה חמקמקה, אבל גישות שיטתיות תפוקה גבוהה, כגון מערכי פרופיל מירנה, יש להוביל לזיהוי של חתימות מירנה בכמה מצבים פתולוגיים, כוללים הפרעות ניווניות ומספר סוגים של סרטן. בהקשר זה, את זיהוי של פרופיל ביטוי מירנה בנוזל השדרה, כפי שדווח במחקר שנערך לאחרונה שלנו, הופך את המועמדים אטרקטיביים miRNAs לניתוח סמן ביולוגי. _content "> ישנם מספר כלים זמינים לאפיון מיקרו RNA, כגון microarrays, כמותיים בזמן אמת PCR (qPCR), ורצף עמוק. כאן אנו מתארים שיטה רגישה לפרופיל מיקרו RNA בנוזלי המוח והשדרה על ידי בזמן אמת PCR כמוני. השתמש בפנלי האדם PCR Exiqon microRNA מוכנים לשימוש I ו-II V2.R, המאפשר זיהוי של מיקרו RNA האנושי 742 הייחודי. ביצענו מערכים בריצות בשלושה עותקים ועבדנו וניתחנו נתונים באמצעות תוכנת Genex המקצועית 5.
באמצעות פרוטוקול זה, יש לנו צדודית בהצלחה מיקרו RNA בסוגים שונים של שורות תאים ותאים ראשוניים, CSF, פלזמה, וברקמות מוטבעות פרפין קבוע פורמלין.
מיקרו RNA שייך למשפחתו של קטן (21-23 NT באורך) noncoding RNAs המווסתים את ביטוי הגנים שלאחר תעתיק. יכול להיות מופרש מיקרו RNA במרחב תאי שבו הם נראים יציבים יחסית. תוך קביעת שינויים בביטוי מירנה יכולה להיות צעד חשוב לקראת זיהוי של סמנים ביולוגיים, ביצוע פרופילי מירנה וטיפול בכמות גדולה של נתונים עלולים להיות מפחיד.
כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי לקבוע שינויים בביטוי מירנה בנוזל המוח והשדרה (החלים על נוזלי גוף אחרים) על ידי בזמן אמת רגיש ה-PCR. אנו גם מתארים את השימוש בתוכנות לניתוח נתונים, כוללים ניתוח סטטיסטי וייצוג גרפי של תוצאות. התהליך כולו הוא קל ופשוט יחסית, ותלוי במספר דגימות להיות צדודית ומספר מכונות PCR בזמן אמת זמין, גם מהיר יחסית. החלק הניסיוני דורש דיוק בטיפולרנ"א וpipetting לתוך צלחות 384 גם, ואילו סעיף ניתוח נתונים באמצעות Genex דורש קצת ידע בסיסי באינפורמטיקה ונתונים סטטיסטיים.
הפרוטוקול הבא מתאר את ההליך הסטנדרטי לבודד RNA ממייקרו RNA CSF והפרופיל באמצעות צלחות PCR מוכנות. שים לב שמיצוי השלב האורגני הוא אופציונלי, וכי רנ"א ספק מתווסף למדגם במהלך החילוץ להבטיח התאוששות מקסימלי של רנ"א. כתוצאה מכך, אין צורך לכמת את RNA.
בסך הכל, ממוצע של 6-8 צלחות ניתן להפעיל ביום אחד אם cDNA מסונתז ביום שלפני (כ 2 שעות). ניתוח של הנתונים מתבצע כאשר כל הדגימות היו צדודית ונטענות לתוך התוכנה. בהתאם למספר דגימות / קבוצות או השילוב שלהם, לצורך השוואה, ניתוח נתונים עשוי לדרוש מאחד לכמה שעות.
1. RNA חילוץ
מיצוי RNA בוצע דגימות CSF, לאחסן קפוא ב -80 מעלות צלזיוס בaliquots עד לניתוח. להליך זה הייתה בשימוש בערכת בידוד mirVana פריז, בעקבות instru של היצרןctions לסך בידוד RNA. שים לב, כי על אף העשרה למיני RNA קטנים אפשרית עם ערכה זו, בשלב זה לא נעשה והליך מיצוי RNA הוא הסתיים לאחר בסך הכל צעד בידוד RNA. בנוסף, למרות שערכת mirVana פריז הבידוד (כמו ערכות בידוד RNA זמינות מסחרי אחרות) אינה דורשת מיצוי אורגני, ניתן למצוא בפרוטוקול בהליך זה בהמשך.
הפרוטוקול להפקת RNA מורכב משני שלבים:
1.1. הפקה אורגנית (לא נדרש אם באמצעות ערכת חילוץ RNA mirVana פריז)
1.2.2. בידוד RNA סה"כ
1.1. מיצוי אורגני
1.1.1. הכן את חומרים כימיים
1.1.2. הכן את CSF
1.2. בידוד RNA
מומלץ לי ספסל ייעודי, קבוצה של טפטפות, ומדפים לטיפול בדגימות רנ"א. אזור העבודה והכלים לחטא באמצעות תרסיס RNase זאפ ומנגב לפני כל ניסוי.
1.2.1. הכן את חומרים כימיים:
1.2.2. בידוד RNA סה"כ
2. פרופיל מירנה: qRT-PCR פרוטוקול
הפרוטוקול לפרופיל מירנה מורכב משני שלבים:
2.1. סינתזת cDNA גדיל הראשונה
2.1.1. לדלל RNA תבנית
2.1.2. הכן את חומרים כימיים
2.1.3. הגדרת תגובת שעתוק לאחור
מגיב | לוח כרך (μl) | לוחי + כרך ב '(μl) |
מאגר תגובת 5x | 4.4 | 8.8 |
מים nuclease חופשי | 9.9 | 19.8 |
תערובת אנזים | 2.2 | 4.4 |
UniSp6 RNA ספייק-בתבנית | 1.1 | 2.2 |
רנ"א הכל התבנית (5 ng / μl) | 4.4 | 8.8 |
נפח כולל | 22 | 44 |
2.1.4. מערבבים וספין ריאגנטים
2.1.5. דגירה ולהשבית חום
class = "jove_step"> 2.2. הגברה PCR בזמן אמת
2.2.1. הכן ריאגנטים עבור Real-Time PCR
2.2.2. שלב SYBR תערובת ירוקה הורים, מים, וcDNA ולהוסיף לצלחות PCR
ההליך הבא מומלץ להימנע מריכוזים נמוכים של cDNA מהקפדה על פני השטח צינור:
2.2.3. בזמן אמת PCR
לבצע בזמן אמת הגברה PCR וניתוח עקום ההתכה הבאה הפרמטרים מפורטים בטבלה 2.
שלב תהליך | הגדרות, רוש LC480 |
פולימראז ההפעלה / Denaturation | 95 C °, 10 דקות |
הגברה | 45 מחזורי הגברה ב 95 C °, 10 שניות 60 ° C, 1 דקות רמפה שיעור 1.6 ° C / sec קריאה אופטית |
ניתוח עקום התכה | כן |
טבלה 2. בזמן אמת בתנאי מחזור PCR באמצעות רוש LightCycler 480.
2.3. ניתוח נתוני ה-PCR בזמן אמת
לא בעקבות ניתוח נתונים PCR בזמן אמת נעשה עם Exiqon Genex המקצועית 5.0,הוא המליץ על הוראות. מדריך צעד אחר צעד Genex ניתן להוריד בhttp://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf
ניתוח נתונים מורכב משלושה שלבים:
2.3.1. יבוא של נתונים
2.3.2. עיבוד מקדים של נתונים
2.3.3. ניתוח סטטיסטי
תוכנת Genex מאפשרת מגוון רחב של ניתוחים סטטיסטיים, כוללים מבחן t וניתוח שונה.
2.3.4. פרופיל ביטוי
מיקרו RNA ודגימות יכולים להיות מסווגים, באשכולות, ומדמיינים בחום מפות וdendrograms, כדלקמן
תוצאות ממחקר זה כבר פורסמו בעבר 1. איור 1 מציג תוצאות מהניתוח של מיקרו RNA התייחסות המועמד באמצעות יישום geNorm. בהתאם לכך, שני מיקרו RNA, miR-622 ו miR-1266, זוהו כגני התייחסות ושימש לנרמל את ערכי מירנה.
לצורך המחקר CSF היו לנו שלוש ...
מיקרו RNA הוא RNAs noncoding הקטן המווסתים את ביטוי הגנים על ידי עיכוב תרגום ו / או קידום mRNA השפלה 2. בשל היציבות הגבוהה שלהם בתנאים ללא תא, מיקרו RNA שכבר זוהה בנוזלי גוף רבים. יתר על כן, פרופיל ביטוי מובהק של מיקרו RNA כבר בקורלציה עם שלב ו / או התקדמות בסוגים שונים של הסרטן א?...
יש המחברים אין לחשוף.
הפרויקט המתואר נתמכה על ידי מספר פרס R01MH079751 (PI: פ Peruzzi) מהמכון הלאומי לבריאות נפש. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות נפש או המכון הלאומי לבריאות.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 3. List of equipment. | |||
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter | Thermo Scientific | HH05279 | |
Finntip Pipette Tips | Thermo Scientific | 9400613 | |
Thermal Cycler C1000 | Biorad | ||
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes | Biorad | TLS0801 | |
Flat Cap Strips | Biorad | TLS0803 | |
LightCycler 480 Real-Time PCR System | Roche | ||
LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04 729 757 001 | |
Refrigerated Centrifuge 5804R | Eppendorf | ||
Swing-bucket Rotor, 4-place | Eppendorf | A-4-44 | |
Bench-Top Mini Centrifuge | Fisher | 05-090-100 | |
Bench-Top Vortex | Fisher | ||
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized | Fisher | 02-681-5 | |
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml | Thermo Scientific | 8093 | |
Thermomixer Confort | Eppendorf | ||
Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15 | Sigma | ||
Bench-Top Vortex | Velp Scientifica | F202A0173 | |
Table 4. List of reagents. | |||
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns | Exiqon | 203300 | |
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml | Exiqon | 203400 | |
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free | Invitrogen | 10977-015 | |
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R | Exiqon | 203608 | |
mirVana miRNA isolation Kit, 40 isolations | Ambion | AM1556 | |
MS2 RNA carrier | Roche Applied Science | 10165948001 | |
2-mercaptoethanol 98% | Sigma Aldrich | M3148-25ml | |
Ethanol 100% | Carlo Erba | 64-17-5 | |
Nuclease free water | Qiagen | 1039480 | |
RNAse Zap | Ambion | AM9780 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved