נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

Summary

אנו מתארים פרוטוקול של PCR בזמן אמת לפרופיל מיקרו RNA בנוזל המוח והשדרה (CSF). למעט פרוטוקולי מיצוי RNA, ההליך יכול להתארך עד RNA המופק מנוזלים אחרים בגוף, תאים בתרבית, או דגימות רקמה.

Abstract

מיקרו RNA (miRNAs) מהווה שכבה חזקה של ויסות הגנים על ידי המנחה RISC למקד לאתרים הממוקמים על mRNAs וכתוצאה מכך, על ידי ויסות דיכוי translational שלהם. שינויים בביטוי מירנה הוכחו להיות מעורבים בפיתוח של כל המחלות מורכבות הגדולות. יתר על כן, הממצאים אחרונים הראו כי יכול להיות מופרש miRNAs לסביבה תאית ולהיכנס למחזור הדם ונוזלי גוף אחרים שבו הם יכולים להסתובב עם יציבות גבוהה. הפונקציה של miRNAs במחזור כזה נשארה במידה רבה חמקמקה, אבל גישות שיטתיות תפוקה גבוהה, כגון מערכי פרופיל מירנה, יש להוביל לזיהוי של חתימות מירנה בכמה מצבים פתולוגיים, כוללים הפרעות ניווניות ומספר סוגים של סרטן. בהקשר זה, את זיהוי של פרופיל ביטוי מירנה בנוזל השדרה, כפי שדווח במחקר שנערך לאחרונה שלנו, הופך את המועמדים אטרקטיביים miRNAs לניתוח סמן ביולוגי. _content "> ישנם מספר כלים זמינים לאפיון מיקרו RNA, כגון microarrays, כמותיים בזמן אמת PCR (qPCR), ורצף עמוק. כאן אנו מתארים שיטה רגישה לפרופיל מיקרו RNA בנוזלי המוח והשדרה על ידי בזמן אמת PCR כמוני. השתמש בפנלי האדם PCR Exiqon microRNA מוכנים לשימוש I ו-II V2.R, המאפשר זיהוי של מיקרו RNA האנושי 742 הייחודי. ביצענו מערכים בריצות בשלושה עותקים ועבדנו וניתחנו נתונים באמצעות תוכנת Genex המקצועית 5.

באמצעות פרוטוקול זה, יש לנו צדודית בהצלחה מיקרו RNA בסוגים שונים של שורות תאים ותאים ראשוניים, CSF, פלזמה, וברקמות מוטבעות פרפין קבוע פורמלין.

Introduction

מיקרו RNA שייך למשפחתו של קטן (21-23 NT באורך) noncoding RNAs המווסתים את ביטוי הגנים שלאחר תעתיק. יכול להיות מופרש מיקרו RNA במרחב תאי שבו הם נראים יציבים יחסית. תוך קביעת שינויים בביטוי מירנה יכולה להיות צעד חשוב לקראת זיהוי של סמנים ביולוגיים, ביצוע פרופילי מירנה וטיפול בכמות גדולה של נתונים עלולים להיות מפחיד.

כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי לקבוע שינויים בביטוי מירנה בנוזל המוח והשדרה (החלים על נוזלי גוף אחרים) על ידי בזמן אמת רגיש ה-PCR. אנו גם מתארים את השימוש בתוכנות לניתוח נתונים, כוללים ניתוח סטטיסטי וייצוג גרפי של תוצאות. התהליך כולו הוא קל ופשוט יחסית, ותלוי במספר דגימות להיות צדודית ומספר מכונות PCR בזמן אמת זמין, גם מהיר יחסית. החלק הניסיוני דורש דיוק בטיפולרנ"א וpipetting לתוך צלחות 384 גם, ואילו סעיף ניתוח נתונים באמצעות Genex דורש קצת ידע בסיסי באינפורמטיקה ונתונים סטטיסטיים.

Protocol

הפרוטוקול הבא מתאר את ההליך הסטנדרטי לבודד RNA ממייקרו RNA CSF והפרופיל באמצעות צלחות PCR מוכנות. שים לב שמיצוי השלב האורגני הוא אופציונלי, וכי רנ"א ספק מתווסף למדגם במהלך החילוץ להבטיח התאוששות מקסימלי של רנ"א. כתוצאה מכך, אין צורך לכמת את RNA.

בסך הכל, ממוצע של 6-8 צלחות ניתן להפעיל ביום אחד אם cDNA מסונתז ביום שלפני (כ 2 שעות). ניתוח של הנתונים מתבצע כאשר כל הדגימות היו צדודית ונטענות לתוך התוכנה. בהתאם למספר דגימות / קבוצות או השילוב שלהם, לצורך השוואה, ניתוח נתונים עשוי לדרוש מאחד לכמה שעות.

1. RNA חילוץ

מיצוי RNA בוצע דגימות CSF, לאחסן קפוא ב -80 מעלות צלזיוס בaliquots עד לניתוח. להליך זה הייתה בשימוש בערכת בידוד mirVana פריז, בעקבות instru של היצרןctions לסך בידוד RNA. שים לב, כי על אף העשרה למיני RNA קטנים אפשרית עם ערכה זו, בשלב זה לא נעשה והליך מיצוי RNA הוא הסתיים לאחר בסך הכל צעד בידוד RNA. בנוסף, למרות שערכת mirVana פריז הבידוד (כמו ערכות בידוד RNA זמינות מסחרי אחרות) אינה דורשת מיצוי אורגני, ניתן למצוא בפרוטוקול בהליך זה בהמשך.
הפרוטוקול להפקת RNA מורכב משני שלבים:
1.1. הפקה אורגנית (לא נדרש אם באמצעות ערכת חילוץ RNA mirVana פריז)
1.2.2. בידוד RNA סה"כ

1.1. מיצוי אורגני

1.1.1. הכן את חומרים כימיים

1. הוספת 375 μl של 2-mercaptoethanol ל2x denaturing פתרון, ולאחסן אותו ב 4 ° C.

1.1.2. הכן את CSF

1. הפשירו כל aliquot של CSF על קרח לפני מיצוי RNA. הוסף 1 מיקרוגרם של ספק RNA MS2 ל0.5 מיליליטר של CSF מופשר ובעדינותלערבב. שים לב שאם המיצוי האורגני מושמט, מוביל MS2 יתווסף למדגם בידוד RNA לפני שמתואר ב1.2.2.1 להלן.
2. מערבבים 0.5 מיליליטר של 2x denaturing פתרון בטמפרטורת חדר כדי CSF.
3. הוסף 1 מיליליטר של חומצת פנול: כלורופורם לCSF בתוספת 2x denaturing הפתרון: הקפד נסוג השלב התחתון המכיל חומצת פנול: כלורופורם, לא חיץ המימית שנמצאת בחלק העליון של התערובת. בנוסף, שים לב שחומצת פנול: כלורופורם מכיל פנול, שהוא רעל ומגרים, כפפות ושימוש בציוד מגן אישי אחר כאשר עובדים עם מגיב זה.
4. וורטקס למשך 30-60 שניות כדי לערבב. להנוחיות, 2 מיליליטר של מדגם / denaturing פתרון / חומצת פנול: כלורופורם תמהיל מחולק לשני צינורות 1.5 מיליליטר Eppendorf.
5. צנטריפוגה במשך 5 דקות במהירות המרבית (10,000 XG) בטמפרטורת חדר.
6. מוציא בזהירות את השלב המימית (העליון) מבלי להפריע את השלב הנמוך או ביניים ולהעביר אותוצינור טרי. הערה הנפח התאושש.

1.2. בידוד RNA

מומלץ לי ספסל ייעודי, קבוצה של טפטפות, ומדפים לטיפול בדגימות רנ"א. אזור העבודה והכלים לחטא באמצעות תרסיס RNase זאפ ומנגב לפני כל ניסוי.

1.2.1. הכן את חומרים כימיים:

1. הוספת 21 מיליליטר של אתנול 100% למירנה לשטוף פתרון 1 ואתנול 40 מיליליטר של 100% לשטוף פתרון 2/3. שים לב שמירנה לשטוף פתרון 1 מכיל thiocyanate guanidium שהוא חומר שעלול להיות מסוכן.

1.2.2. בידוד RNA סה"כ

1. הוסף 1.25 כרכים של טמפרטורת חדר אתנול 100% לשלב מימיים ממיצוי האורגני ומערבבים היטב.
2. הנח מחסנית מסנן לתוך אחד צינורות האיסוף.
3. פיפטה לא יותר מ -700 μl של תערובת lysate / אתנול על פילטר.
4. צנטריפוגה במשך 30 שניות במקסימוםמהירות. החל את התערובת עולה 700 μl ביישומים רצופים לאותו מסנן. מחק את הזרימה דרך אחרי כל צנטריפוגה ולשמור את צינור האיסוף לשלבי הכביסה.
5. החל 700 μl מירנה לשטוף פתרון 1 למחסנית הסינון וצנטריפוגות במשך 15 שניות במהירות המרבית. מחק את הזרימה דרך מצינור האיסוף ולהחליף את מחסנית המסנן לתוך אותו צינור האיסוף.
6. החל 500 μl לשטוף פתרון 2/3 ו צנטריפוגות במשך 15 שניות במהירות המרבית. מחק את הזרימה דרך מצינור האיסוף ולהחליף את מחסנית המסנן לתוך אותו צינור האיסוף. החל 500 μl שני לשטוף פתרון 2/3 ו צנטריפוגות במשך 15 שניות במהירות המרבית. מחק את הזרימה דרך מצינור האיסוף ולהחליף את מחסנית המסנן לתוך אותו צינור האיסוף. ספין ההרכבה 1 דקות במהירות המרבית כדי להסיר את הנוזלים שנותרו במסנן.
7. העבר את מחסנית המסנן לתוך צינור אוסף טרי. החל 100 & mu; ליטר של (ל95 מעלות צלזיוס) nuclease ללא מים חוממו מראש למרכז של המסנן, ולסגור את המכסה. צנטריפוגה במשך 30 שניות במהירות המרבית כדי לשחזר את רנ"א.
8. לאסוף RNA eluate מכיל ולאחסן אותו ב-80 ° C ליישומים שלאחר מכן.
9. לכמת 1 μl של רנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר 2000C NanoDrop. שים לב שכימות RNA ניתן לדלג אם ספק RNA יתווסף למדגם במהלך מיצוי RNA. במקרה זה 8 μl של RNA חשופים לסינתזת cDNA כמפורט להלן.

2. פרופיל מירנה: qRT-PCR פרוטוקול

הפרוטוקול לפרופיל מירנה מורכב משני שלבים:

1. סינתזת cDNA גדיל הראשונה
2. הגברה PCR בזמן אמת

2.1. סינתזת cDNA גדיל הראשונה

2.1.1. לדלל RNA תבנית

1. התאם כל אחת מהדגימות RNA התבנית לריכוז של 5 ng / μl שימוש במי nuclease חינם. אםRNA לא היה לכמת (ראה שלב 1.2.2.9), ולאחר מכן 8 μl של RNA מנוצלים לסינתזת cDNA

2.1.2. הכן את חומרים כימיים

1. בעדינות להפשיר את מאגר תגובת 5x וnuclease מים חופשיים, ומייד מניח על קרח.
2. מערבבים על ידי vortexing. Resuspend RNA ספייק-במים על ידי הוספה בחינם 40 nuclease μl לצינור ומערבבים על ידי vortexing; להשאיר אותו על קרח למשך 15-20 דקות. מייד לפני השימוש, הסר את תערובת האנזים מהמקפיא, לערבב על ידי מצליף את הצינורות ומניח על קרח. ספין למטה את כל חומרים כימיים.

2.1.3. הגדרת תגובת שעתוק לאחור

1. הכן את הכמות הנדרשת של פתרון עובד RT בצינור 1.5 מיליליטר Eppendorf, או שווה ערך (בפרופורציות מפורטות בטבלה 1, פרט לתבנית RNA), מערבב על ידי vortexing (שניות 1-2 במהירות מקסימלית), ספין למטה בקצרה ( אנו משתמשים בצנטריפוגה Eppendorf מיני עם מהירות קבועה, 10 שניות) ולמקם אותו על קרח. שימו לב שספייק RNA UniSp6ב מתווסף למדגם לפני תגובת RT (ראה טבלה 1).
2. לוותר על פתרון עובד RT לתוך צינורות PCR nuclease חינם.
3. לוותר RNA תבנית בצינור אחד.
   הערה: אל תשכח לחשב 10% נפח עודף / כל מגיב לpipetting ו / או נפח מת רובוטית. r>

   מגיב	לוח כרך (μl)	לוחי + כרך ב '(μl)
   מאגר תגובת 5x	4.4	8.8
   מים nuclease חופשי	9.9	19.8
   תערובת אנזים	2.2	4.4
   UniSp6 RNA ספייק-בתבנית	1.1	2.2
   רנ"א הכל התבנית (5 ng / μl)	4.4	8.8
   נפח כולל	22	44

   
   טבלת 1. הפוך התקנת תגובת שעתוק.

2.1.4. מערבבים וספין ריאגנטים

1. מערבבים את התגובה על ידי vortexing העדין (1-2 שניות) כדי להבטיח שכל חומרים כימיים מעורבבים היטב. לאחר הערבוב, ספין למטה (צנטריפוגות אפנדורף המיני עם מהירות קבועה, 10 שניות).

2.1.5. דגירה ולהשבית חום

1. לתכנת מכונה ה-PCR כדלקמן:
2. דגירה של 60 דקות על 42 מעלות צלזיוס
3. חום להשבית טרנסקריפטאז ההפוך למשך 5 דקות על 95 מעלות צלזיוס
4. מייד לצנן עד 4 מעלות צלזיוס
5. חנות ב 4 מעלות צלזיוס או הקפאה
   הערה: הפרוטוקול יכול להיות מופרע בשלב זה. CDNA חי יכול להיות כל הזמן ב-20 מעלות צלזיוס לתקופה של עד 5 שבועות (אופציונלית חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 ימים).

class = "jove_step"> 2.2. הגברה PCR בזמן אמת

2.2.1. הכן ריאגנטים עבור Real-Time PCR

1. הנח cDNA (מצעד 2.1.5) על קרח.
2. תמהיל הפשרת nuclease מים חופשיים ומאסטר PCR על קרח. להגן על בקבוקוני תמהיל מאסטר PCR מהאור על ידי מכסה אותם ברדיד אלומיניום. מייד לפני השימוש, לערבב את תערובת מאסטר PCR ידי vortexing 1-2 שניות בצנטריפוגה מיני ספין למטה ב1,500 XG דקות 1.

2.2.2. שלב SYBR תערובת ירוקה הורים, מים, וcDNA ולהוסיף לצלחות PCR

ההליך הבא מומלץ להימנע מריכוזים נמוכים של cDNA מהקפדה על פני השטח צינור:

1. לפני הסרת חותם הצלחת, ספין בקצרה את הצלחת (ים) בצנטריפוגה בקירור ב1,500 XG דקות 1.
2. בצינור חרוטי 15 מיליליטר, לשלב 2x תמהיל מאסטר PCR ומים. לוחי: 2,000 μl תערובת הורים 2x ו1,980 מים μl; לוח I + II: 4,000 μl תערובת ההורים 2x ו3,960 μ; מים ליטר.
3. הוסף 20 cDNA μl (אני פנל) או cDNA 40 μl (פנל I + II) ומערבבים.
4. מערבבים בעדינות על ידי vortexing 1-2 שניות וספין למטה בצנטריפוגה בקירור ב1,500 XG דקות 1.
5. הנח את ה-PCR מיקס מאסטר / cDNA לערבב במאגר פיפטה רבה. ייתכן שיהיה צורך לזהות מאגר שיש לו את אורכו של פיפטה הרבה. הדבר זה שומר את רמת עוצמת הקול הגבוהה מספיק ומאפשר לaliquots נפח שווים לאורך רבת ערוצים. זה קריטי לכיוון כמה aliquots האחרונים.
6. לוותר 10 μl תמהיל מאסטר PCR / cDNA לערבב היטב בכל הצלחת 384 גם באמצעות פיפטה 16 ערוצים.
7. חותם את הצלחת עם איטום אופטי.
8. ספין צלחת בקצרה בצנטריפוגה בקירור (1,500 XG במשך 1 דקות), כדי לערבב את הפתרונות ולהסיר בועות אוויר.
   
   הערה: הניסוי יכול להיות מושהה בשלב זה. אחסן את התגובות מוגנות מפני אור על 4 מעלות צלזיוס עד 24 שעות.

2.2.3. בזמן אמת PCR

לבצע בזמן אמת הגברה PCR וניתוח עקום ההתכה הבאה הפרמטרים מפורטים בטבלה 2.

שלב תהליך	הגדרות, רוש LC480
פולימראז ההפעלה / Denaturation	95 C °, 10 דקות
הגברה	45 מחזורי הגברה ב 95 C °, 10 שניות 60 ° C, 1 דקות רמפה שיעור 1.6 ° C / sec קריאה אופטית
ניתוח עקום התכה	כן

טבלה 2. בזמן אמת בתנאי מחזור PCR באמצעות רוש LightCycler 480.

2.3. ניתוח נתוני ה-PCR בזמן אמת

לא בעקבות ניתוח נתונים PCR בזמן אמת נעשה עם Exiqon Genex המקצועית 5.0,הוא המליץ ​​על הוראות. מדריך צעד אחר צעד Genex ניתן להוריד בhttp://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf
ניתוח נתונים מורכב משלושה שלבים:

1. יבוא של נתונים
2. עיבוד מקדים של נתונים
3. ניתוח סטטיסטי

2.3.1. יבוא של נתונים

1. ברוש LightCycler 480 לבחור את שיטת ניתוח ^nd הנגזרת 2 ולחשב את ערכי CQ. הנתונים מיוצאים כטבלה ונשמרו כקבצי טקסט.
2. כדי לייבא נתונים, Genex הפתוחה וללחוץ על כפתור אשף יבוא Exiqon ולחץ על "התחל". עקוב אחר ההוראות כדי לבחור פורמט, מכשיר וקובץ צלחת פריסה (ים). שים לב שקבצי צלחת הפריסה (קבצי Excel) הורדו מאתר האינטרנט Exiqon (http://www.exiqon.com/plate-layout-files).
3. Imporפנלי t I ו-II ולחצו על "הבא".
4. הטבלה שנוצרה לאחר יבוא קובץ מכילה עמודות מוגדרות מראש. ניתן לערוך דגימות שמות וניתן להוסיף עמודות סיווג או הוסרו בשלב זה. לחץ על "הבא" כאשר אתה עשית.
5. שמור את הנתונים ולטעון לנתוני עורך.

2.3.2. עיבוד מקדים של נתונים

1. כפי שהומלץ על ידי Exiqon וGenex, כאשר משווים צלחות מרובות הדבר הראשון שיש לעשות הוא לכייל את הנתונים בין הלוחות על ידי בחירת כיול בין צלחת מתפריט העיבוד המקדים.
2. מומלץ להפעיל מערכי מירנה בריצות בשלושה עותקים. אם מירנה אינה נוכחת בלפחות שניים מתוך שלושה העתקיו ייקבעו כnonexpressed.
3. בשלב הבא בעיבוד המקדים, להגדיר מנותק. הגדרת ערך מנותק מציינת כי נתונים עם מחזור סף _(לא C) גבוה יותר מאשר ערך זה מבוטלים. בניסויים הנוכחיים באמצעות דגימת נוזל השדרתי, את החתך נקבע על 39. Therefore, כל הדגימות עם גבוה יותר _t C מ39 בשלושת העתקים ייפסל. אם מירנה יש _t C> 39 לבדיקה אחד (העתק אחד מתוך שלוש), קריאה שתוחלף עם הממוצע של _לא C לשתי בדיקות האחרות, ובלבד שהם שניהם מתחת 39.
4. הגדר גנים התייחסות. יש Genex מקצועית האפשרות לנצל geNorm ו / או NormFinder לזהות גנים התייחסות. בחר רשימה של miRNAs שיש ערכי CQ דומים בכל המדגם ולהפעיל geNorm ו / או NormFinder. על פי ניתוח זה, בדוגמא הניתנת כאן, miR-622 ו miR-1266 היו הערכים אחידים ביותר על פני הדגימות ונבחרו כגני התייחסות (איור 1).
5. בשלב הבא, הנתונים מנורמלים באמצעות גנים ההתייחסות והערכים שהתקבלו מתאימות _לt ΔC
6. אם תגובות סינתזת cDNA בוצעו בtriplicates, בשלב זה צריכים להיות בממוצע הערכים.
7. לאמת את הגיליון מחדשלהעביר את העמודות ריקות וכמעט ריקות. בחלון העיבוד המקדים בחר "אמת את הגיליון" ויותר מלהחיל על קו העמודות ריקות הסר. בשורה מתחת, בחר את האחוז הרצוי של נתונים חוקיים ולחץ על החל. לדוגמא, בחר 100% אם אתה רוצה להשוות miRNAs רק משותף לכל דוגמאות.
8. להתמודד עם נתונים חסרים.
   בחר באפשרות "נתונים חסרים" מתפריט העיבוד המקדים ובחרתי באחת מהאפשרויות לטיפול בנתונים חסרים. צעד זה נדרש. שים לב שGenex תיתן לך שגיאה אם ​​אתה מנסה לטעון קבצים המכילים נתונים חסרים שלא טופלו.
9. לקבוע כימות יחסי בין קבוצות של דגימות (כלומר. ניסוי לעומת קבוצת ביקורת). כימות יחסי בקרב קבוצות מחושב בשיטה _לא ΔΔ C. בGenex, לחץ על כרטיסיית העיבוד המקדימה ובחר כימות יחסי. בחלון בחר את קבוצת ההתייחסות ופגע להחיל. שים לב כי לייצוגים גרפיים ו / או עבור ניתוחים סטטיסטיים נוספים, exprנתוני ession יש להמיר לסולם לוגריתמים. בתפריט העיבוד המקדים, בחר log2.

2.3.3. ניתוח סטטיסטי

תוכנת Genex מאפשרת מגוון רחב של ניתוחים סטטיסטיים, כוללים מבחן t וניתוח שונה.

1. טען את קובץ MDF הסופי לGenex ומנהל נתונים פתוח. זה קריטי כדי לבחור את דוגמאות או קבוצות הנכונות של דגימות שלניתוח סטטיסטי מבוצע.
2. בחר "סטטיסטיקה" ובחר בסמל המתאים לבדיקה הרצויה.
3. לחץ על "הפעל" בחלון לוח בקרה. שמירת תוצאות כקבצי mdf או Excel.

2.3.4. פרופיל ביטוי

מיקרו RNA ודגימות יכולים להיות מסווגים, באשכולות, ומדמיינים בחום מפות וdendrograms, כדלקמן

1. טען את קובץ MDF הסופי לGenex ומנהל נתונים פתוח. השתמש בחלון זה כדי לבחור וליצור קבוצות של דוגמאות או miRNAs. לחץ על "החל" כאשר אתה עשית.
2. באשכול בחר בפינה השמאלית העליון וללחוץ על סמל Heatmap
3. בחלון לוח הבקרה לחץ על "הפעלה". Heatmap ניתן לשמור בפורמטים שונים, כגון TIFF או BMP, זה גם יכול להיות מועתק והותאם בהתאם לצורך.

תוצאות

תוצאות ממחקר זה כבר פורסמו בעבר ^1. איור 1 מציג תוצאות מהניתוח של מיקרו RNA התייחסות המועמד באמצעות יישום geNorm. בהתאם לכך, שני מיקרו RNA, miR-622 ו miR-1266, זוהו כגני התייחסות ושימש לנרמל את ערכי מירנה.

לצורך המחקר CSF היו לנו שלוש ...

Discussion

מיקרו RNA הוא RNAs noncoding הקטן המווסתים את ביטוי הגנים על ידי עיכוב תרגום ו / או קידום mRNA השפלה ^2. בשל היציבות הגבוהה שלהם בתנאים ללא תא, מיקרו RNA שכבר זוהה בנוזלי גוף רבים. יתר על כן, פרופיל ביטוי מובהק של מיקרו RNA כבר בקורלציה עם שלב ו / או התקדמות בסוגים שונים של הסרטן א?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3. List of equipment.
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Pipette Tips	Thermo Scientific	9400613
Thermal Cycler C1000	Biorad
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes	Biorad	TLS0801
Flat Cap Strips	Biorad	TLS0803
LightCycler 480 Real-Time PCR System	Roche
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche	04 729 757 001
Refrigerated Centrifuge 5804R	Eppendorf
Swing-bucket Rotor, 4-place	Eppendorf	A-4-44
Bench-Top Mini Centrifuge	Fisher	05-090-100
Bench-Top Vortex	Fisher
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized	Fisher	02-681-5
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173
Table 4. List of reagents.
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml	Exiqon	203400
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana miRNA isolation Kit, 40 isolations	Ambion	AM1556
MS2 RNA carrier	Roche Applied Science	10165948001
2-mercaptoethanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
Ethanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nuclease free water	Qiagen	1039480
RNAse Zap	Ambion	AM9780