Спинномозговой жидкости профилирования микроРНК с использованием количественных ПЦР в реальном времени

Резюме

Мы описываем протокол ПЦР в реальном времени к профилю микроРНК в спинномозговой жидкости (ликвора). За исключением протоколов экстракции РНК, процедура может быть расширена до РНК, выделенной из других жидкостей организма, культивируемых клеток или тканей образцов.

Аннотация

Микро РНК (микроРНК) составляют мощный слой регуляции генов, направляя RISC таргетинг на сайты, расположенные на мРНК и, следовательно, путем модуляции их репрессии трансляции. Изменения в экспрессии микроРНК, как было показано, участвуют в развитии всех основных сложных заболеваний. Кроме того, недавние исследования показали, что микроРНК может быть секретируется во внеклеточную среду и попадают в кровоток и другие жидкости организма, где они могут циркулировать с высокой стабильностью. Функция такого циркулирующего микроРНК остается в значительной степени неуловимым, но систематические подходы высокой пропускной способностью, такие как микроРНК профилирования массивов, привели к идентификации подписей микроРНК в нескольких патологических состояний, в том числе нейродегенеративных расстройств и несколько видов рака. В этом контексте, выявление микроРНК профиля экспрессии в спинномозговой жидкости, о чем сообщается в недавнем исследовании, делает микроРНК привлекательными кандидатами для анализа биомаркеров. _content "> Есть несколько инструментов, доступных для профилирования микроРНК, такие как микрочипы, количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР), и глубокое секвенирование. Здесь мы описываем чувствительный метод для профилирования микроРНК в спинно-мозговой жидкости с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Мы использовали Exiqon микроРНК готовые к использованию ПЦР человека панелей я и II V2.R, что позволяет обнаружение 742 уникальных человеческих микроРНК. Мы провели массивы в трех экземплярах трасс и мы обработаны и проанализированы данные с помощью программного обеспечения Genex Профессиональный 5.

Используя этот протокол, мы успешно профилированного микроРНК в различных типах клеточных линий и первичных элементов, CSF, плазмы и фиксированных формалином парафин тканях.

Введение

Микро РНК относятся к семейству малых (21-23 нт в длину) некодирующих РНК, которые регулируют экспрессию генов посттранскрипционно. микроРНК может быть секретируется в межклеточное пространство, где они появляются, чтобы быть относительно стабильным. При определении изменения в экспрессии микроРНК может быть важным шагом на пути выявления биомаркеров, выполняя профили микроРНК и обработке большого количества данных может быть пугающим.

Здесь мы опишем протокол для определения изменения в экспрессии микроРНК в спинномозговой жидкости (применимой к другими биологическими жидкостями) чувствительным ПЦР в реальном времени. Мы также описывают использование программного обеспечения для анализа данных, в том числе статистического анализа и графического представления результатов. Вся процедура относительно легко и просто и, в зависимости от количества образцов, профилированных и количество машин ПЦР в реальном времени, доступных, также относительно быстро. Экспериментальная часть требует точности в обработкеРНК и пипетки в 384-луночных планшетах, в то время как раздел анализа данных с использованием Genex требуется некоторые базовые знания в области информатики и статистики.

протокол

Следующий протокол описывает стандартную процедуру, чтобы изолировать РНК из CSF и профильных микроРНК с использованием готовых ПЦР планшет. Следует отметить, что извлечение органическую фазу не является обязательным, и что РНК носитель добавляют к образцу во время экстракции, обеспечивающих максимальный восстановление РНК. Следовательно, нет необходимости количественной оценки РНК.

В целом, в среднем 6-8 пластин могут быть запущены в течение одного дня, если кДНК синтезируется накануне (около 2 часов). Анализ данных выполняется, когда все образцы были профилированы и загружаются в программное обеспечение. В зависимости от количества образцов / групп или их комбинации для сравнения, анализ данных может потребовать от одного до нескольких часов.

1. Экстракция РНК

Выделение РНК проводили на образцах CSF, хранили замороженными при -80 ° C в аликвотах до анализа. Для этой процедуры используется набор для выделения Mirvana Париж, такой прибор производителястрельчатые на общую выделения РНК. Обратите внимание, что, хотя обогащение для мелких видов РНК можно с помощью этого комплекта, этот шаг не делается, и процедура извлечения РНК закончился после полной стадии выделения РНК. Кроме того, хотя изоляция комплект Mirvana Париж (как и другие коммерчески доступных наборов изоляции РНК) не требует органической экстракции, протокол для этой процедуры можно найти ниже.
Протокол для экстракции РНК состоит из двух этапов:
1.1. Органические Добыча (не требуется, если используется Mirvana Париж набора для экстракции РНК)
1.2.2. Всего Выделение РНК

1.1. Органическая добыча

1.1.1. Подготовка реагентов

1. Добавить 375 мкл 2-меркаптоэтанола в 2 раза Денатурирующий решение, и хранить его при температуре 4 ° C.

1.1.2. Подготовьте CSF

1. Оттепель каждый аликвоты CSF на льду перед экстракции РНК. Добавить 1 мкг РНК MS2 носителя в 0,5 мл размороженной CSF и осторожноперемешать. Заметим, что если органический извлечение опущен, носитель MS2 будет добавлен к образцу предварительного выделения РНК, описанной в 1.2.2.1 ниже.
2. Смешайте 0,5 мл 2 раза денатурации раствора при комнатной температуре в CSF.
3. Добавить 1 мл кислотного фенола: хлороформа в CSF плюс 2 х денатурации раствора: обязательно выведены нижнюю фазу, содержащую кислотно-фенол: хлороформ, а не водном буфере, который лежит на верхней части смеси. Кроме того, обратите внимание, что кислота фенол: хлороформ содержит фенол, который является ядом и раздражителем, используйте перчатки и другое оборудование и средства индивидуальной защиты при работе с этим реагентом.
4. Vortex для 30-60 сек перемешать. Для удобства, 2 мл образца / денатурации раствора / кислотно-фенол: хлороформ смесь делятся на две пробирки 1,5 мл Eppendorf.
5. Центрифуга течение 5 мин при максимальной скорости (10000 мкг) при комнатной температуре.
6. Осторожно снимите водный (верхний) фазу, не нарушая нижнюю фазу или интерфазу и передать его насвежий труба. Обратите внимание на объем восстановлены.

1.2. Выделение РНК

Рекомендуется иметь специальный стенд, набор пипеток и стеллажи для обработки образцов РНК. Рабочая зона и инструменты обеззараживают с помощью РНКазы Zap спрей и салфетки до каждого эксперимента.

1.2.1. Подготовка реагентов:

1. Добавить 21 мл 100% этанола, микроРНК промывочного раствора 1 и 40 мл 100% этанола, чтобы промывочного раствора 2/3. Обратите внимание, что микроРНК промывочный раствор 1 содержит гуанидина тиоцианата, который является потенциально опасным веществом.

1.2.2. Всего Выделение РНК

1. Добавить 1,25 объемы комнатной температуре 100% этанола в водной фазы от органической экстракции и тщательно перемешать.
2. Поместите фильтр-патрона в один из Коллекция трубок.
3. Пипеток не более 700 мкл лизата / этанол на фильтр-картридж.
4. Центрифуга в течение 30 сек при максимальнойскорость. Нанесите смесь превышающую 700 мкл в последовательном применении к тому же фильтр. Откажитесь от проточных после каждого центрифугирования и сохранить пробирку на стадии отмывки.
5. Применить 700 мкл микроРНК промывочного раствора 1 к картридж фильтра и центрифуги в течение 15 сек при максимальной скорости. Откажитесь от потока через от пробирку и заменить фильтр-патрона в ту же пробирку.
6. Применить 500 мкл промывочного раствора 2/3 и центрифуги в течение 15 сек при максимальной скорости. Откажитесь от потока через от пробирку и заменить фильтр-патрона в ту же пробирку. Нанесите второй 500 мкл промывочного раствора 2/3 и центрифуги в течение 15 сек при максимальной скорости. Откажитесь от потока через от пробирку и заменить фильтр-патрона в ту же пробирку. Спин сборку в течение 1 мин при максимальной скорости для удаления остаточной жидкости из фильтра.
7. Перенести фильтр-патрона в свежем пробирку. Применить 100 & му; Л предварительно нагретого (до 95 ° С) нуклеазы без воды до центра фильтра и закройте крышкой. Центрифуга в течение 30 сек с максимальной скоростью, чтобы восстановить РНК.
8. Сбор Элюат, содержащий РНК и хранить его при температуре -80 ° С в течение последующих применений.
9. Количественная 1 мкл РНК с помощью NanoDrop 2000C спектрофотометр. Следует отметить, что количественное РНК может быть пропущен, если РНК носитель добавляют к образцу во время экстракции РНК. В этом случае 8 мкл РНК подвергают синтеза кДНК, как описано ниже.

2. микроРНК профиля: Qrt-ПЦР протокол

Протокол для микроРНК профилирования состоит из двух этапов:

1. Первой цепи синтеза кДНК
2. ПЦР в реальном времени усиления

2.1. Первой цепи синтеза кДНК

2.1.1. Развести матричную РНК

1. Регулировка каждого из образцов РНК шаблона до концентрации 5 нг / мкл с использованием нуклеазы свободной воды. ЕслиРНК не определены (см. шаг 1.2.2.9), а затем 8 мкл РНК используются для синтеза кДНК

2.1.2. Подготовка реагентов

1. Осторожно растопить 5x реакционного буфера и нуклеазному свободной воды, и сразу же разместить на льду.
2. Смешайте встряхиванием. Ресуспендируют РНК шип в добавлением 40 мкл нуклеазы свободной воды к трубке и перемешать на вортексе; оставить его на льду в течение 15-20 мин. Непосредственно перед использованием, удалите смеси ферментов из морозильника, смешать, щелкая трубки и поместить на лед. Спином вниз все реагенты.

2.1.3. Обратный установки реакция транскрипции

1. Подготовьте необходимое количество РТ рабочего раствора в 1,5 мл трубки Эппендорф, или эквивалент (в пропорциях, указанных в таблице 1, для РНК-матрицы исключением), перемешать встряхиванием (1-2 сек на максимальной скорости), кратко спином вниз ( мы используем мини Eppendorf центрифуги с фиксированной скоростью, 10 сек) и поместить его на льду. Обратите внимание, что РНК шип UniSp6В добавлении к образцу до реакции RT (см. таблицу 1).
2. Внесите рабочего раствора RT в нуклеазных бесплатно ПЦР пробирок.
3. Не включать матричную РНК в каждую пробирку.
   Примечание: не забудьте рассчитать 10% избыточного объема / каждый реагент для пипетки и / или роботизированной мертвого объема.

   Реагент	Панель Я Объем (мкл)	Панель I + II Объем (мкл)
   5x реакционного буфера	4.4	8.8
   Нуклеазы свободной воды	9.9	19.8
   Смесь ферментов	2.2	4.4
   UniSp6 РНК Спайк в шаблоне	1.1	2.2
   Шаблон общую РНК (5 нг / мкл)	4.4	8.8
   Общий объем	22	44

   
   Таблица 1. Обратный настройки реакции транскрипции.

2.1.4. Смешайте и спин реагентов

1. Смешайте реакцию нежной (1-2 сек) встряхиванием убедиться, что все реагенты тщательно перемешивают. После смешивания, спин вниз (мини Eppendorf центрифуги с фиксированной скоростью, 10 сек).

2.1.5. Выдержите и нагревать инактивированную

1. Программирование машину ПЦР следующим образом:
2. Инкубировать в течение 60 мин при 42 ° С
3. Тепло-инактивации обратной транскриптазы в течение 5 мин при 95 ° С
4. Остудите до 4 ° С
5. Хранить при температуре 4 ° С или замораживания
   Примечание: протокол может быть прерван на данном этапе. Неразбавленный кДНК можно хранить при температуре -20 ° С в течение до 5 недель (опционально Хранить при температуре 4 ° С в течение 4 суток).

2.2. ПЦР в реальном времени усиления

2.2.1. Подготовка реагентов для ПЦР в реальном времени

1. Наведите кДНК (с шага 2.1.5) на льду.
2. Оттепель нуклеазы свободной воды и ПЦР Мастер смесь на льду. Защита ПЦР флаконов Master Mix от света, покрывая их алюминиевой фольгой. Непосредственно перед использованием смешайте Master Mix ПЦР встряхиванием 1-2 секунды в мини центрифуги и спином вниз при 1500 мкг в течение 1 мин.

2.2.2. Объединить SYBR Green основной смеси, воду и кДНК и добавить в ПЦР планшет

Следующая процедура рекомендуется избегать низкие концентрации кДНК от присоединения к поверхности трубы:

1. Перед снятием пластины печать, кратко спин вниз пластину (ы) в охлажденном центрифуге при 1500 мкг в течение 1 мин.
2. В 15 мл коническую трубку, объединить 2x PCR Master смесь и воду. Панель I: 2000 мкл 2x мастер микс и 1980 мкл воды; Панель I + II: 4000 мкл 2x мастер микс и 3960 μ; Л воды.
3. Добавить 20 мкл кДНК (панель I) или 40 мкл кДНК (панель I + II) и перемешать.
4. Осторожно перемешать встряхиванием 1-2 секунды и спином вниз в охлаждаемой центрифуге при 1500 мкг в течение 1 мин.
5. Поместите PCR Master Mix / кДНК смесь в резервуаре пипетки многоканальный. Вы можете иметь идентифицировать резервуар, который имеет длину многоканальной пипетки. Это держит уровень громкости достаточно высоко позволяет равные аликвоты объемом по всему многоканальный. Это очень важно в направлении последних нескольких аликвот.
6. Разлить по 10 мкл PCR Master Mix / кДНК смешивать в каждую лунку 384-луночного планшета с помощью пипетки 16-канала.
7. Уплотнение тарелку с оптическим уплотнением.
8. Спин пластину кратко в охлаждаемой центрифуге (1500 мкг в течение 1 мин), для смешивания растворов и удаления пузырьков воздуха.
   
   Примечание: эксперимент может быть приостановлена ​​в этой точке. Хранить реакции защищенном от света месте при 4 ° С в течение до 24 часов.

2.2.3. В режиме реального времени PCR

Выполните в режиме реального времени ПЦР-амплификации и анализа кривых плавления следующие параметры, указанные в таблице 2.

Шаг процесса	Настройки, Рош LC480
Полимеразной Активация / Денатурацию	95 ° С, 10 мин
Усиление	45 амплификации циклов при 95 ° С, 10 сек 60 ° С, 1 мин Разгона скорость 1.6 ° C / сек Оптический чтения
Таяние анализ кривой	Да

Таблица 2. ПЦР в реальном времени условия цикла с использованием Roche LightCycler 480.

2.3. В режиме реального времени анализ данных ПЦР

В режиме реального времени анализ данных ПЦР делается с Exiqon Genex Professional 5.0, после тон рекомендовал инструкции. Genex шаг за шагом руководство может быть загружен в http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf
Анализ данных состоит из трех этапов:

1. Импорт данных
2. Предварительная обработка данных
3. Статистический анализ

2.3.1. Импорт данных

1. В Рош LightCycler 480 выбора способа ^й производной анализа 2 и вычислить значения CQ. Данные экспортируются в виде таблицы и сохранить как текстовые файлы.
2. Для импорта данных, открытая Genex и нажмите на кнопку Мастер импорта Exiqon и нажмите кнопку "Пуск". Следуйте инструкциям, чтобы выбрать формат, инструмент и пластины файл (ы) макета. Обратите внимание, что пластины файлы макета (Excel файлы) загружаемые с веб-сайта Exiqon ( http://www.exiqon.com/plate-layout-files ).
3. Imporт Панели я и II и нажмите «Далее».
4. В таблице генерируется после импорта файла содержит предопределенные столбцы. Образцы имена могут быть отредактированы и столбцы классификации могут быть добавлены или удалены на этом шаге. Нажмите "Next", когда вы сделали.
5. Сохранить данные и загрузить в редакторе данных.

2.3.2. Предварительная обработка данных

1. В соответствии с рекомендацией Exiqon и Genex, при сравнении нескольких пластин первое, что нужно сделать, это для калибровки данных между пластинами, выбрав калибровку между пластиной из меню предварительной обработки.
2. Рекомендуется для работы массивов микроРНК в трех экземплярах трасс. Если микроРНК нет в по крайней мере два из трех реплик он будет установлен как nonexpressed.
3. На следующем этапе в предварительной обработки, установить отсечения. Определение отрезать значение указывает, что данные с пороговым цикла (С _т) выше этого значения, отбрасываются. В нынешних экспериментов с использованием спинномозговой образец жидкости, отрезать был установлен на уровне 39 лет. ТамEfore, все образцы с C _т выше, чем 39 в трех реплик, будут отвергнуты. Если микроРНК имеет С _т> 39 для одного зонда (один реплики из трех), что чтение будет заменен в среднем по C _T для двух других зондов, при условии, что они оба ниже 39.
4. Определить эталонные гены. Genex Профессиональный имеет возможность, чтобы использовать geNorm и / или NormFinder определить опорные гены. Выберите список микроРНК, которые имеют аналогичные значения CQ по всей выборке и работают geNorm и / или NormFinder. Согласно этому анализу, в примере представленная здесь, микроРНК-622 и микроРНК-1266 были самые единые ценности через образцов и в качестве опорных генов были выбраны (рис. 1).
5. Далее, данные нормализованы с помощью опорных генов и полученные величины соответствуют ΔC _т
6. Если реакции синтеза кДНК проведены трижды, на данный момент значения должны быть усреднены.
7. Подтвердить лист повторнодвигаться пустые и почти пустые столбцы. В окне предварительной обработки выберите "Подтвердить лист" и того, чтобы применять на Удалить пустые столбцы линии. В приведенном ниже линии, выбрал нужный процент достоверных данных и нажмите применить. Например, выберите 100%, если вы хотите сравнить только микроРНК, общие для всех образцов.
8. С отсутствующими данными.
   Выберите "Нет данных о" из меню предварительной обработки и выбрал один из вариантов поступить с отсутствующими данными. Этот шаг необходим. Обратите внимание, что Genex даст вам ошибку, если вы попытаетесь установить файлы, которые содержат необработанные недостающие данные.
9. Определить относительную количественную между группами образцов (то есть. Эксперимента в сравнении с контролем). Относительная количественная среди групп рассчитывается с использованием метода _т ΔΔ C. В Genex, перейдите на вкладку предварительной обработки и выберите относительную количественную. В окне выбора референтной группы и нажмите применить. Заметим, что для графического представления и / или для дальнейших статистических анализов, выражениеДанные Эссионе должны быть преобразованы в логарифмической шкале. В меню предварительной обработки, выберите log2.

2.3.3. Статистический анализ

Программное обеспечение Genex позволяет широкий спектр статистических анализов, в том числе Т-теста и ANOVA.

1. Загрузите конечный файл МДФ в Genex и открытого менеджера данных. Очень важно выбрать правильные образцы или группы образцов, для которых выполняется статистический анализ.
2. Выберите "Статистика" и выбрал значок, соответствующий желаемому теста.
3. Нажмите кнопку "Выполнить" в окне панели управления. Сохранение результатов в виде Excel или МДФ файлов.

2.3.4. Профилирование Выражение

Микро РНК и образцы могут быть классифицированы, собраны, и визуализируется на тепловых карт и дендрограмм, как следует

1. Загрузите конечный файл МДФ в Genex и открытого менеджера данных. Используйте это окно для выбора и создания групп образцов или микроРНК. Нажмите кнопку "Применить", когда вы сделали.
<литий> В левом верхнем углу выберите кластера и нажмите на значок Тепловая карта
2. В окне панели управления выберите "Выполнить". Тепловая карта может быть сохранен в различных форматах, таких как TIFF или BMP, а также может быть скопирована и изменена по мере необходимости.

Результаты

Результаты этого исследования были опубликованы ранее ^1. Рисунок 1 показывает результаты анализа кандидатов справочных микроРНК с использованием приложения geNorm. Соответственно, два микроРНК, микроРНК-622 и микроРНК-1266, были определены в качестве эталонных генов и были ис...

Обсуждение

Микро РНК являются малые РНК некодирующих, которые регулируют экспрессию генов путем ингибирования перевод и / или содействие деградации мРНК ^2. Благодаря своей высокой стабильности в условиях бесклеточных, микроРНК были обнаружены во многих жидкостях организма. Кроме того, отл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3. List of equipment.
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Pipette Tips	Thermo Scientific	9400613
Thermal Cycler C1000	Biorad
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes	Biorad	TLS0801
Flat Cap Strips	Biorad	TLS0803
LightCycler 480 Real-Time PCR System	Roche
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche	04 729 757 001
Refrigerated Centrifuge 5804R	Eppendorf
Swing-bucket Rotor, 4-place	Eppendorf	A-4-44
Bench-Top Mini Centrifuge	Fisher	05-090-100
Bench-Top Vortex	Fisher
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized	Fisher	02-681-5
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173
Table 4. List of reagents.
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml	Exiqon	203400
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana miRNA isolation Kit, 40 isolations	Ambion	AM1556
MS2 RNA carrier	Roche Applied Science	10165948001
2-mercaptoethanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
Ethanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nuclease free water	Qiagen	1039480
RNAse Zap	Ambion	AM9780