Liquide céphalo-rachidien profilage de microARN Utilisation quantitative PCR en temps réel

Résumé

Nous décrivons un protocole de PCR en temps réel pour le profil de microARN dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). A l'exception des protocoles d'extraction d'ARN, la procédure peut être étendue à l'ARN extrait à partir d'autres fluides corporels, des cellules en culture, ou des échantillons de tissus.

Résumé

Les microARN (miARN) constituent une couche puissante de la régulation des gènes en guidant RISC à cibler des sites situés sur des ARNm et, par conséquent, en modulant leur répression de la traduction. Changements dans l'expression des miARN ont été révélés être impliqués dans le développement de toutes les grandes maladies complexes. En outre, des études récentes ont montré que les miARN peuvent être sécrétées dans l'environnement extracellulaire et dans la circulation sanguine et d'autres fluides corporels où ils peuvent circuler avec une grande stabilité. La fonction de ces miARN circulation reste largement insaisissable, mais des approches à haut débit systématiques, telles que miRNA tableaux de profilage, ont conduit à l'identification de signatures miRNA dans plusieurs conditions pathologiques, y compris les maladies neurodégénératives et plusieurs types de cancers. Dans ce cadre, l'identification de miARN profil d'expression dans le liquide céphalo-rachidien, comme indiqué dans notre étude récente, rend miARN candidats intéressants pour l'analyse de marqueurs biologiques. _content "> Il existe plusieurs outils disponibles pour le profilage de microARN, comme les puces, quantitative PCR en temps réel (qPCR), et le séquençage profond. Ici, nous décrivons une méthode sensible au profil microARN dans liquide céphalo-rachidien par PCR quantitative en temps réel. Nous utilisé les panneaux droits Exiqon microARN prêts à l'emploi PCR I et II V2.R, qui permet la détection de 742 microARN humains uniques. Nous avons effectué les tableaux en triple courses et nous avons traité et analysé les données en utilisant le logiciel GenEx Professional 5.

En utilisant ce protocole, nous avons profilé succès microARN dans divers types de lignées cellulaires et des cellules primaires, CSF, le plasma et les tissus inclus en paraffine fixés au formol.

Introduction

Les microARN appartiennent à la famille de la petite (21-23 nt de long) non codantes des ARN qui régulent l'expression des gènes post-transcriptionnel. microARN peuvent être sécrétées dans l'espace extracellulaire où ils semblent être relativement stables. Alors que la détermination des changements dans l'expression des miARN peut être une étape importante vers l'identification de biomarqueurs, effectuer profils miRNA et la manipulation d'une grande quantité de données peut être intimidant.

Ici, nous décrivons un protocole pour déterminer les changements dans l'expression des miARN dans le liquide céphalo-rachidien (applicable à d'autres fluides corporels) par un temps réel sensible PCR. Nous décrivons également l'utilisation de logiciels d'analyse de données, y compris l'analyse statistique et la représentation graphique des résultats. Toute la procédure est relativement simple et facile et, en fonction du nombre d'échantillons à profilés et le nombre de machines de PCR en temps réel disponibles, également relativement rapides. La partie expérimentale nécessite précision dans la manipulationARN et pipetage dans des plaques à 384 puits, tandis que la section d'analyse de données à l'aide GenEx nécessite quelques connaissances de base en informatique et en statistiques.

Protocole

Le protocole suivant décrit la procédure standard pour isoler l'ARN du CSF et profil microARN en utilisant des plaques de PCR prêts. Notez que l'extraction en phase organique est facultatif, et en ce qu'un ARN de support est ajouté à l'échantillon pendant l'extraction assurant la récupération maximale de l'ARN. Par conséquent, il n'est pas nécessaire de quantifier l'ARN.

Dans l'ensemble, une moyenne de 6-8 plaques peut être exécuté en un jour si l'ADNc est synthétisé la veille (environ 2 heures). L'analyse des données est effectuée lorsque tous les échantillons ont été profilée et chargé dans le logiciel. En fonction du nombre d'échantillons / ou des groupes de leur combinaison pour la comparaison, l'analyse des données peut nécessiter de une à plusieurs heures.

Une. Extraction de l'ARN

L'extraction de l'ARN a été réalisée à partir d'échantillons de LCR, stocké congelé à -80 ° C en fractions aliquotes jusqu'à l'analyse. Pour cette procédure, le kit d'isolation Mirvana Paris a été utilisé, à la suite de instrument du fabricantctions pour l'isolement de l'ARN total. S'il vous plaît noter que, bien que l'enrichissement pour petites espèces d'ARN est possible avec ce kit, cette étape n'est pas fait et la procédure d'extraction d'ARN est terminée après l'étape totale d'isolement d'ARN. En outre, bien que le kit d'isolation Mirvana Paris (comme d'autres kits d'isolement d'ARN disponibles dans le commerce) ne nécessite pas l'extraction organique, un protocole pour cette procédure peut être trouvé ci-dessous.
Le protocole d'extraction d'ARN est constituée de deux étapes:
1.1. Extraction organique (pas nécessaire si l'aide du kit d'extraction d'ARN Mirvana Paris)
1.2.2. L'isolement d'ARN total

1.1. Extraction organique

1.1.1. Préparer les réactifs

1. Ajouter 375 ul de 2-mercaptoéthanol 2x solution de dénaturation, et stocker à 4 ° C.

1.1.2. Préparer la CSF

1. Décongeler chaque aliquote de CSF sur la glace avant l'extraction de l'ARN. Ajouter 1 ug d'ARN MS2 porte à 0,5 ml de LCR décongelé et doucementmélanger. A noter que si l'extraction organique est omis, le transporteur MS2 sera ajouté à l'isolement de l'ARN de l'échantillon avant que décrit ci-dessous en 1.2.2.1.
2. Mélanger 0,5 ml de 2x dénaturation solution à la température ambiante à la CSF.
3. Ajouter 1 ml d'acide-phénol et de chloroforme à la CSF plus la dénaturation Solution 2x: assurez-vous de retirer la phase inférieure contenant de l'acide phénol: chloroforme, pas le tampon aqueux qui se trouve sur le dessus du mélange. En outre, notez que l'acide-phénol: chloroforme contient du phénol, qui est un poison et un irritant, utiliser des gants et autre équipement de protection personnel lorsque vous travaillez avec ce réactif.
4. Vortex pendant 30-60 secondes pour mélanger. Pour plus de commodité, les 2 ml d'échantillon / solution de dénaturation / acide-phénol: chloroforme mélange sont divisés en deux tubes Eppendorf de 1,5 ml.
5. Centrifuger pendant 5 min à vitesse maximale (10 000 xg) à température ambiante.
6. Retirez délicatement la phase aqueuse (supérieure) sans perturber la phase inférieure ou l'interphase et la transférer à unnouveau tube. Noter le volume récupéré.

1.2. isolement d'ARN

Il est recommandé d'avoir un banc dédié, un ensemble de pipettes, et supports pour la manipulation des échantillons d'ARN. La zone de travail et les outils sont décontaminés à l'aide de RNase Zap pulvérisation et lingettes avant chaque expérience.

1.2.1. Préparer des réactifs:

1. Ajouter 21 ml d'éthanol à 100% de miARN solution de lavage 1 et 40 ml d'éthanol à 100% de la solution de lavage 2/3. S'il vous plaît noter que miRNA Wash Solution 1 contient thiocyanate de guanidinium qui est une substance potentiellement dangereuse.

1.2.2. L'isolement d'ARN total

1. Ajouter 1,25 volumes de la température ambiante à 100% d'éthanol à la phase aqueuse de l'extraction organique et bien mélanger.
2. Placez une cartouche de filtre dans l'un des tubes de prélèvement.
3. Pipette pas plus de 700 pi du mélange lysat / éthanol sur la cartouche du filtre.
4. Centrifuger pendant 30 secondes au maximum devitesse. Appliquer le mélange dépassant 700 pi dans les applications successives au même filtre. Jeter l'effluent après chaque centrifugation et enregistrer le tube de prélèvement pour les étapes de lavage.
5. Appliquer 700 ul miRNA solution de lavage 1 à la cartouche du filtre et centrifuger pendant 15 secondes à la vitesse maximale. Jeter l'écoulement à travers de la collection Tube et remplacer la cartouche du filtre dans le même tube collecteur.
6. Appliquer 500 ul de solution de lavage 2/3 et centrifuger pendant 15 secondes à la vitesse maximale. Jeter l'écoulement à travers de la collection Tube et remplacer la cartouche du filtre dans le même tube collecteur. Appliquer une deuxième 500 pi de solution de lavage 2/3 et centrifuger pendant 15 secondes à la vitesse maximale. Jeter l'écoulement à travers de la collection Tube et remplacer la cartouche du filtre dans le même tube collecteur. Spin l'ensemble pendant 1 min à vitesse maximale pour éliminer le liquide résiduel du filtre.
7. Transférer la cartouche du filtre dans un tube de prélèvement frais. Appliquer 100 et mu; L de (à 95 ° C) de l'eau préchauffée sans nucléase au centre du filtre, et fermer le couvercle. Centrifuger pendant 30 secondes à la vitesse maximale de récupérer l'ARN.
8. Recueillir l'ARN éluat contenant et stocker à -80 ° C pour les applications suivantes.
9. Quantifier 1 ul d'ARN à l'aide du spectrophotomètre NanoDrop 2000c. Notez que la quantification de l'ARN peut être sautée si un support d'ARN est ajouté à l'échantillon pendant l'extraction d'ARN. Dans ce cas, 8 pi d'ARN sont soumis à la synthèse de l'ADNc comme détaillé ci-dessous.

2. miRNA Profil: Protocole qRT-PCR

Le protocole de miARN profilage est constitué de deux étapes:

1. La synthèse d'ADNc premier brin
2. En temps réel l'amplification par PCR

2.1. La synthèse d'ADNc premier brin

2.1.1. Diluer ARN matrice

1. Ajuster chacun des échantillons d'ARN de modèle à une concentration de 5 ng / pl en utilisant la nucléase libre de l'eau. Si l'ARN n'a pas été quantifiée (voir l'étape 1.2.2.9), puis 8 pi d'ARN sont utilisés pour la synthèse de l'ADNc

2.1.2. Préparer les réactifs

1. Décongeler doucement le tampon de réaction 5x et nucléases eau libre, et placer immédiatement sur glace.
2. Mélanger au vortex. Reprendre l'ARN pic en ajoutant de l'eau libre de 40 pi de nucléase au tube et mélanger au vortex; laisser sur la glace pendant 15-20 min. Immédiatement avant utilisation, retirer le mélange d'enzymes du congélateur, mélanger en feuilletant les tubes et les placer sur la glace. Isoler tous les réactifs.

2.1.3. Configuration inverse de la réaction de transcription

1. Préparer la quantité nécessaire de solution de travail RT dans un tube Eppendorf de 1,5 ml, ou l'équivalent (dans les proportions indiquées dans le tableau 1, à l'exception de la matrice d'ARN), mélanger par vortex (2.1 secondes à la vitesse maximale), centrifuger brièvement vers le bas ( nous utilisons un mini centrifugeuse Eppendorf à vitesse fixe, 10 sec) et le placer sur la glace. Notez que la pointe de l'ARN UniSp6-In est ajouté à l'échantillon avant la réaction de RT (voir le tableau 1).
2. Distribuer la solution de travail RT dans des tubes de PCR sans nucléase.
3. Distribuer matrice d'ARN dans chaque tube.
   Remarque: n'oubliez pas de calculer 10% d'excès de volume / chaque réactif pour pipetage et / ou volume mort robotique.

   Réactif	Groupe I Volume (pi)	Panel I + II Volume (pi)
   5x tampon de réaction	4.4	8.8
   Nucléase l'eau libre	9.9	19,8
   Mélange enzyme	2.2	4.4
   UniSp6 ARN Spike-en modèle	1.1	2.2
   ARN total gabarit (5 ng / pl)	4.4	8.8
   Volume total	22	44

   
   Tableau 1. Inverse configuration de réaction de transcription.

2.1.4. Mélangez et faites tourner réactifs

1. Mélanger la réaction en douceur (1-2 sec) vortex pour s'assurer que tous les réactifs soient bien mélangés. Après le mélange, spin-down (mini centrifugeuse Eppendorf à vitesse fixe, 10 sec).

2.1.5. Incuber et une inactivation de

1. Programmer une machine PCR comme suit:
2. Incuber pendant 60 min à 42 ° C
3. Heat-inactiver la transcriptase inverse pendant 5 min à 95 ° C
4. Immédiatement refroidir à 4 ° C
5. Conserver à 4 ° C ou gel
   Remarque: le protocole peut être interrompu à ce stade. L'ADNc non dilué peut être conservé à -20 ° C pendant jusqu'à 5 semaines (magasins en option à 4 ° C pendant 4 jours).

2.2. En temps réel l'amplification par PCR

2.2.1. Préparer les réactifs pour la PCR en temps réel

1. Placez ADNc (de l'étape 2.1.5) sur la glace.
2. Dégel de l'eau libre et maître PCR mélange nucléase sur la glace. Protéger les flacons de Master mix PCR de la lumière en les couvrant d'une feuille d'aluminium. Immédiatement avant utilisation, mélanger le Master Mix PCR par vortex 1-2 sec dans une mini centrifugeuse et centrifuger à 1500 g pendant 1 min.

2.2.2. Combinez SYBR Green master mix, de l'eau, et l'ADNc et ajouter à plaques PCR

La procédure suivante est recommandée pour éviter de faibles concentrations d'ADNc d'adhérer à la surface du tube:

1. Avant de retirer le joint de la plaque, centrifuger brièvement en bas de la plaque (s) dans une centrifugeuse réfrigérée à 1500 g pendant 1 min.
2. Dans un tube de 15 ml conique, combiner 2x PCR Master Mix et de l'eau. Groupe I: 2000 pi 2x master mix et 1980 pi d'eau; Panel I + II: 4000 pi 2x master mix et 3960 μ; L d'eau.
3. Ajouter 20 ul d'ADNc (panneau I) ou 40 ul d'ADNc (panneau I + II) et mélanger.
4. Mélanger doucement au vortex 1-2 sec et centrifuger dans une centrifugeuse réfrigérée à 1500 g pendant 1 min.
5. Placer le mélange PCR Master / ADNc mélange dans un réservoir de pipette multicanaux. Vous pouvez devoir identifier un réservoir qui a la longueur de la pipette à canaux multiples. Cela permet de maintenir le niveau du volume suffisamment élevé pour permettre aliquotes de volume égal à travers le multicanal. Cela est essentiel pour les dernières parties aliquotes.
6. Distribuer 10 ul PCR Master Mix / ADNc mélanger dans chaque puits de la plaque 384 puits en utilisant une pipette 16 canaux.
7. Sceller la plaque avec étanchéité optique.
8. Spin plaque brièvement dans une centrifugeuse réfrigérée (1500 g pendant 1 min), pour mélanger les solutions et éliminer les bulles d'air.
   
   Remarque: l'expérience peut être interrompue à ce point. Conserver les réactions abri de la lumière à 4 ° C pendant 24 heures.

2.2.3. Real-Time PCR

Effectuer en temps réel l'amplification par PCR et analyse de la courbe de fusion en suivant les paramètres décrits dans le tableau 2.

Étape du processus	Paramètres, Roche LC480
Polymérase Activation / Dénaturation	95 ° C, 10 min
Amplification	45 cycles d'amplification à 95 ° C, 10 sec 60 ° C, 1 min Rampe de taux 1,6 ° C / s Lecture optique
Melting analyse de la courbe	Oui

Tableau 2. Conditions de cycle de PCR en temps réel utilisant la Roche LightCycler 480.

2.3. Analyse en temps réel des données de PCR

Analyse en temps réel des données de PCR se fait avec l'Exiqon GenEx Professional 5.0, t la suiteil a recommandé instructions. Le manuel GenEx étape-par-étape peut être téléchargé à http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf
L'analyse des données consiste en trois étapes:

1. Importation de données
2. Prétraitement des données
3. L'analyse statistique

2.3.1. Importation de données

1. Dans la Roche LightCycler 480 sélectionner la méthode d'analyse ^ème dérivé 2 et calculer les valeurs Cq. Les données sont exportées sous forme de tableau et enregistrés en tant que fichiers texte.
2. Pour importer les données, ouvert GenEx et cliquez sur le bouton Exiqon assistant d'importation et cliquez sur "Démarrer". Suivez les instructions pour sélectionner le format, instrument et le fichier de configuration de plaque (s). Notez que les fichiers de mise en page de la plaque (fichiers Excel) sont téléchargés à partir du site Web Exiqon ( http://www.exiqon.com/plate-layout-files ).
3. Importancet panneaux I et II et cliquez sur "Suivant".
4. Le tableau généré après l'importation de fichier contient des colonnes prédéfinies. les noms des échantillons peuvent être édités et colonnes de classification peuvent être ajoutés ou supprimés à cette étape. Cliquez sur "Suivant" lorsque vous avez terminé.
5. Sauvegardez les données et charger à l'éditeur de données.

2.3.2. Prétraitement des données

1. Comme recommandé par Exiqon et GenEx, lorsque l'on compare plusieurs plaques, la première chose à faire est de calibrer les données entre les plaques en choisissant l'étalonnage inter-plaque dans le menu de pré-traitement.
2. Il est recommandé d'exécuter tableaux miRNA en triple pistes. Si un miRNA n'est pas présente dans au moins deux des trois répliques il sera défini comme non exprimés.
3. Dans l'étape suivante dans le prétraitement, définir une coupure. Définition d'une valeur couper indique que les données ayant un cycle de seuil (C _t) supérieure à cette valeur sont ignorés. Dans les expériences actuelles en utilisant l'échantillon de liquide céphalorachidien, l'arrêt de coupe a été fixé à 39. Thervant, tous les échantillons avec un C _t supérieure à 39 dans les trois répliques seront rejetées. Si un miARN un C _t> 39 pour une sonde (une réplique sur trois), que la lecture sera remplacé par la moyenne de la C _t pour les deux autres sondes, à condition qu'ils soient en dessous de 39.
4. Définir gènes de référence. GenEx professionnel a la possibilité d'utiliser geNorm et / ou NormFinder pour identifier les gènes de référence. Sélectionnez une liste de miARN qui ont des valeurs Cq similaires dans tous les échantillons et courent geNorm et / ou NormFinder. Selon cette analyse, dans l'exemple donné ici, miR-622 et miR-1266 avaient des valeurs les plus uniformes à travers les échantillons et ont été choisis en tant que gènes de référence (figure 1).
5. Ensuite, les données sont normalisées en utilisant les gènes de référence et les valeurs obtenues correspondent aux Ac _t
6. Si les réactions de synthèse d'ADNc ont été réalisées en triple, à ce point, les valeurs doivent être calculées.
7. Valider la feuille à nouveaudéplacer des colonnes vides et presque vides. Dans la fenêtre de prétraitement sélectionnez "Valider feuille" et que d'appliquer sur la ligne Supprimer des colonnes vides. Dans la ligne ci-dessous, choisissez le pourcentage désiré de données valides et cliquez sur Appliquer. Par exemple, sélectionnez 100%, si vous voulez comparer seulement miARN communs à tous les échantillons.
8. Traiter les données manquantes.
   Sélectionnez «données manquantes» dans le menu de prétraitement et choisir l'une des options pour gérer les données manquantes. Cette étape est nécessaire. Notez que GenEx vous donnera erreur si vous essayez de charger des fichiers contenant des données manquantes non gérées.
9. Déterminer quantification relative entre les groupes d'échantillons (c.. Expérience par rapport au contrôle). Quantification relative entre les groupes est calculée en utilisant la méthode _{de t} ΔΔ C. En GenEx, cliquez sur l'onglet de prétraitement et sélectionnez quantification relative. Dans la fenêtre, sélectionnez le groupe de référence et cliquez sur Apply. A noter que pour des représentations graphiques et / ou pour d'autres analyses statistiques, exprdonnées ession doivent être convertis en une échelle logarithmique. Dans le menu de prétraitement, sélectionnez Log2.

2.3.3. Analyse statistique

Logiciel GenEx permet un large éventail d'analyses statistiques, y compris T-test et analyse de la variance.

1. Chargez le fichier final de mdf en GenEx et gestionnaire de données ouverte. Il est essentiel de sélectionner les échantillons ou les groupes corrects d'échantillons pour lequel l'analyse statistique est effectuée.
2. Sélectionnez "Statistiques" et choisir l'icône correspondant à l'essai désiré.
3. Cliquez sur "Exécuter" dans la fenêtre du panneau de commande. Enregistrer les résultats sous forme de fichiers Excel ou mdf.

2.3.4. Profilage de l'expression

Les microARN et les échantillons peuvent être classées, regroupées et visualisées sur des cartes de chaleur et dendrogrammes, comme suit

1. Chargez le fichier final de mdf en GenEx et gestionnaire de données ouverte. Utilisez cette fenêtre pour sélectionner et créer des groupes d'échantillons ou miARN. Cliquez sur "Appliquer" lorsque vous avez terminé.
2. Dans le coin gauche, sélectionnez pôle supérieur et cliquez sur l'icône de heatmap
3. Dans la fenêtre du panneau de configuration, cliquez sur "Exécuter". La carte thermique peut être enregistré dans divers formats tels que TIFF ou BMP, elle peut aussi être copié et modifié au besoin.

Résultats

Les résultats de cette étude ont été publiés ^1. Figure 1 montre les résultats de l'analyse des micro-ARN de référence de candidats en utilisant l'application geNorm. En conséquence, deux microARN, miR-622 et miR-1266, ont été identifiés comme gènes de référence et ont été utilisés pour normaliser les valeurs de miARN.

Pour l'étude du LCR, nous avions trois groupes d'échantillons: le VIH (n = 10), HIVE (n = 4), ...

Discussion

Les microARN sont de petits ARN non codantes qui régulent l'expression des gènes par l'inhibition de la traduction et / ou de promotion de la dégradation de l'ARNm ^2. En raison de leur grande stabilité dans des conditions exemptes de cellules, les microARN ont été détectés dans de nombreux fluides corporels. En outre, le profil d'expression de microARN distinct a été corrélée avec le stade et / ou de la progression dans une variété de cancers chez l'homme ^9.3.

...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3. List of equipment.
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Pipette Tips	Thermo Scientific	9400613
Thermal Cycler C1000	Biorad
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes	Biorad	TLS0801
Flat Cap Strips	Biorad	TLS0803
LightCycler 480 Real-Time PCR System	Roche
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche	04 729 757 001
Refrigerated Centrifuge 5804R	Eppendorf
Swing-bucket Rotor, 4-place	Eppendorf	A-4-44
Bench-Top Mini Centrifuge	Fisher	05-090-100
Bench-Top Vortex	Fisher
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized	Fisher	02-681-5
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173
Table 4. List of reagents.
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml	Exiqon	203400
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana miRNA isolation Kit, 40 isolations	Ambion	AM1556
MS2 RNA carrier	Roche Applied Science	10165948001
2-mercaptoethanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
Ethanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nuclease free water	Qiagen	1039480
RNAse Zap	Ambion	AM9780