脑脊液的microRNA分析采用实时定量PCR技术

摘要

我们描述了实时PCR的协议来分析小分子RNA在脑脊液（CSF）。除的RNA提取的协议，该过程可以扩展到从其它体液，细胞培养，或组织标本中提取的RNA。

摘要

微RNA（miRNA）构成由指导RISC到目标位于mRNA的位点，因此，通过调节它们的翻译抑制基因调控的一种有效层。改变的miRNA表达已被证明参与所有主要复杂疾病的发展。此外，最近的研究结果表明，miRNA能够被分泌到细胞外环境，并进入血液和其他体液中，他们可以以高稳定性循环。这种循环miRNA的功能在很大程度上仍然是难以捉摸的，但系统的高通量方法，如miRNA表达谱阵列，已经导致miRNA的签名鉴定的几个病理条件下，包括神经退行性疾病和多种类型的癌症。在此背景下，miRNA的表达谱在脑脊液鉴定，据报道在我们最近的研究，使得miRNA的有吸引力的候选生物标志物分析。 _content“>有可用于分析小分子RNA，如微阵列几个工具，定量实时PCR（定量PCR），以及深度测序。在这里，我们描述一个敏感的方法，通过实时定量PCR技术来分析在脑脊髓液的microRNA。我们用Exiqon的microRNA准备使用的PCR人类面板I和II V2.R，它允许检测742独特的人类微小RNA，我们进行的阵列，一式三份运行，我们使用GENEX专业5软件进行处理和分析数据。

使用该协议，我们已经成功地描出的microRNA在各种类型的细胞系和原代细胞，脑脊髓液，血浆和福尔马林固定，石蜡包埋的组织。

引言

小分子RNA属于小型的家庭（21-23核苷酸长）非编码调控基因表达转录后的RNA。微小RNA可分泌在它们似乎是相对稳定的细胞外空间。在确定改变miRNA的表达可以向鉴定生物标志物的一个重要步骤，进行miRNA表达谱和处理大量数据的可吓人。

在这里，我们描述了一种协议，以确定在脑脊液（适用于其他体液）由一个敏感的实时PCR的变化的miRNA表达。我们还描述了使用软件进行数据分析，包括统计分析和结果的图形表示。整个过程是比较容易和简单，并根据样本进行概要分析和实时PCR机器的数量可用，也比较快的数目。实验部分要求精度处理RNA和移液到384孔板，同时采用GENEX数据分析部分要求在信息学和统计学的一些基本知识。

研究方案

以下协议描述了标准程序，从使用现成PCR板CSF和轮廓的microRNA分离RNA。需要注意的是，有机相萃取是可选的，并且该提取的RNA以确保最大的恢复过程中的载体RNA被加入到样品中。因此，没有必要进行量化的RNA。

总体而言，平均为6-8板可以在一天之内运行，如果该cDNA之前（约2小时）的天合成。当所有的样品已经成型并加载到软件进行数据分析。取决于样品/组或它们的组合的用于比较的数量，数据分析可能需要从一个到几个小时。

1。 RNA提取

的RNA提取从脑脊液样品上进行，冷冻储存在-80℃下以等分试样直至分析。用于此过程的mirVana巴黎分离试剂盒被使用时，按照制造商的仪器ctions总RNA分离。请注意，虽然富集小RNA种类可以使用该试剂盒，该步骤不进行和RNA的提取步骤的总RNA分离步骤之后结束。此外，虽然mirVana巴黎分离试剂盒（像其他市售的RNA提取试剂盒）不需要有机萃取，协议对本程序可以在下面找到。
的协议，用于RNA提取由两个步骤组成：
1.1。有机萃取（如果没有使用mirVana巴黎RNA提取试剂盒必填）
1.2.2。总RNA的提取

1.1。有机萃取

1.1.1。制备试剂

1. 添加375微升2 - 巯基乙醇的2倍变性溶液中，并将其储存于4℃。

1.1.2。准备脑脊液

1. 在RNA提取前解冻CSF对冰每等分。添加1 MS2 RNA载体微克至0.5毫升解冻脑脊液，轻轻混合。请注意，如果省略了有机提取，对MS2载体将被添加到在1.2.2.1下面描述的样本之前的RNA分离。
2. 混合0.5毫升2倍变性溶液在室温至脑脊液。
3. 加入1 ml酸 - 苯酚：氯仿CSF被加上2倍的变性溶液：一定要取出含磺酸 - 苯酚的底部相：氯仿，并不在于对混合物的顶部的水性缓冲液。另外，请注意，酸酚：氯仿含有苯酚，这一试剂工作时，这是一种毒药和刺激性，使用手套和其他个人防护装备。
4. 旋涡30-60秒混匀。为方便起见，2毫升样品/变性溶液/酸 - 苯酚：氯仿混合物分成2个1.5毫升的Eppendorf管中。
5. 在室温下离心以最大速度5分钟（10,000 XG）。
6. 小心除去水（上部）相，而不会干扰下层相或相间并将其传输到一个新管。注意恢复音量。

1.2。 RNA分离

我们建议有一个专门的长凳上，设置移液器，和机架处理RNA样品。工作区域和工具使用RNA酶扎普喷雾是净化和湿巾前每个实验。

1.2.1。制备试剂：

1. 加21毫升100％乙醇中，miRNA的洗涤液1和40毫升100％乙醇洗涤溶液的2/3。请注意，miRNA的清洗液1包含硫氰酸胍是一种潜在的危险物质。

1.2.2。总RNA的提取

1. 添加1.25体积室温的100％乙醇，从有机萃取水相，并充分混合。
2. 将滤芯放入收集管中的一个。
3. 吸管不超过700微升裂解液/乙醇混合物到滤芯。
4. 离心30秒在最大速度。应用超过700微升在连续应用到相同的滤波器的混合物。每次离心后弃去流通和保存收集管的清洗步骤。
5. 适用于700微升的miRNA清洗液1的滤芯，离心15秒，最大速度。通过从收集管中丢弃的流量和更换滤芯到同一个收集管。
6. 适用于500微升洗涤液的2/3，离心15秒以最大速度。通过从收集管中丢弃的流量和更换滤芯到同一个收集管。申请第二个500微升洗涤液的2/3，离心15秒，最大速度。通过从收集管中丢弃的流量和更换滤芯到同一个收集管。旋转组件1分钟以最大速度从过滤器除去残留的液体。
7. 转移滤芯到一个新的收集管。适用于100＆万亩;升的预热（95℃）无核酸酶的水至过滤器的中心，并关闭盖子。离心30秒以最大速度恢复的RNA。
8. 收集的洗脱液中含有的RNA，并将其储存于-80℃用于后续的应用。
9. 量化1μlRNA提取的使用NanoDrop 2000c的分光光度计。需要注意的是RNA定量可以如果一种RNA载体的RNA提取过程中加入到样品中被跳过。在这种情况下，8μL的RNA受到cDNA合成，详见下文。

2。 miRNA的个人资料：定量RT-PCR检测协议

该协议为miRNA谱由两个步骤组成：

1. 第一链cDNA合成
2. 实时PCR扩增

2.1。第一链cDNA合成

2.1.1。稀释模板的RNA

1. 每个模板RNA样品调整至5纳克/微升使用不含核酸酶的水的浓度。如果RNA并没有被量化（见步骤1.2.2.9），然后8μL的RNA被用于cDNA合成

2.1.2。制备试剂

1. 轻轻解冻5×反应缓冲液和无核酸酶的水，并立即放置冰上。
2. 涡旋混匀。重悬的RNA穗中加入40μL无核酸酶的水到管涡旋混合，让它在冰上15-20分钟。临用前，从冰箱中取出酶混合物，轻弹管混合并放置冰上。降速所有试剂。

2.1.3。逆转录反应设置

1. 准备所需的1.5ml离心管，或同等RT工作液量（以比例如表1所示，除RNA模板），涡旋（1-2秒，最大速度）混匀，短暂降速（我们使用一个小型的Eppendorf离心机与固定测速，10秒），并将其放置在冰上。注意，UniSp6核糖核酸穗-在之前的RT反应加入到样品（ 见表1）。
2. 免除RT工作液为无核酸酶PCR管。
3. 分配模板RNA在每个管中。
   注：记得要计算10％的过量体积/每个试剂的移液和/或机械死体积。

   试剂	面板I体积（μl）	面板I + II体积（μl）
   5X反应缓冲液	4.4	8.8
   无核酸酶的水	9.9	19.8
   酶混合物	2.2	4.4
   UniSp6 RNA穗模板	1.1	2.2
   模板总RNA（5纳克/微升）	4.4	8.8
   总成交量	22	44

   
   表1。逆转录反应设置。

2.1.4。混合和自旋试剂

1. 混合通过温和（1-2秒）涡旋的反应，以确保所有试剂充分混合。混合后，短暂离心（微型Eppendorf离心机以固定的速度，10秒）。

2.1.5。培育和热失活

1. 程序PCR仪如下：
2. 孵育60分钟，在42℃下
3. 加热灭活在95℃下的逆转录酶5分钟
4. 立即冷却至4℃
5. 储存于4°C或冻结
   注意：该协议可以在这个阶段被中断。未稀释的cDNA可保持在-20℃下长达5周（在4℃可选存储长达4天）。

2.2。实时PCR扩增

2.2.1。准备试剂，用于实时定量PCR

1. 冰上放置的cDNA（从步骤2.1.5）。
2. 解冻无核酸酶的水和PCR扩增预混冰上。用铝箔覆盖它们避光PCR扩增预混试剂瓶。临用前，用涡旋1-2秒，迷你离心机混合PCR扩增预混和自旋向下在1500×g离心1分钟。

2.2.2。结合SYBR Green母液，水，和cDNA，并加入到PCR板

下面的过程，建议，以避免粘到管表面低浓度的cDNA：

1. 在取出板密封，在短暂冷冻离心机降速板（S）在1500×g离心1分钟。
2. 在一个15毫升的锥形管，结合2X PCR扩增预混试剂和水。第一小组：2,000微升2个主结构和1,980μl水;面板I + II：4,000微升2个主结构和3,960μ;升水。
3. 加入20微升的cDNA（面板I）或40μL的cDNA（面板I + II）和混合。
4. 涡旋1-2秒，轻轻混匀，并在冷冻离心机降速为1500×g离心1分钟。
5. 将PCR扩增预混/基因组合，多道移液器水库。可能必须识别储层具有多通道移液管的长度。这样可以使体积的足够高的允许等体积的等分试样在整个多声道的电平。这是对过去的几等份的关键。
6. 分配10μl的PCR主混合/混合的cDNA至384 - 孔板的使用16通道移液器各孔中。
7. 与光学密封密封板。
8. 在冷冻离心机（1500×g离心1分钟）旋转简要板，以混合溶液并除去气泡。
   
   注意：本实验可以在此时被暂停。存储避光，在4℃下进行长达24小时的反应。

2.2.3。实时时间PCR

以下在表2中详述的参数进行实时PCR扩增和熔解曲线分析。

流程步骤	设置，罗氏LC480
聚合酶活化/变性	95℃，10分钟
放大	扩增45个循环; 95°C，10秒 60℃，1分钟 升温速率 1.6°C /秒 光学读
熔解曲线分析	是的

表2。使用Roche的LightCycler 480实时荧光定量PCR循环条件。

2.3。实时荧光定量PCR数据分析

实时PCR数据分析是完成与Exiqon GENEX专业5.0，下面的T他建议说明。该GENEX一步一步的手册可在下载http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf
数据分析包括三个步骤：

1. 数据的导入
2. 数据的预处理
3. 统计分析

2.3.1。数据的导入

1. 在罗氏公司的LightCycler 480选择^第二衍生物的分析方法和计算CQ值。数据导出为一个表，并保存为文本文件。
2. 要导入数据，开放GENEX并点击Exiqon导入向导按钮，然后点击“开始”。按照说明来选择格式，仪表板和布局文件（S）。需要注意的是板布局文件（Excel文件）从Exiqon网站（被下载http://www.exiqon.com/plate-layout-files ）。
3. IMPOR吨面板I和II，并单击“下一步”。
4. 文件导入后生成的表包含预定义的列。样品名称可以被编辑和分类的列可以被添加或在该步骤中除去。点击“下一步”，当你这样做。
5. 保存数据并加载到数据编辑器。

2.3.2。数据的预处理

1. 所推荐的Exiqon和GENEX，比较多个板时，要做的第一件事就是从预处理菜单中选择板间的校准来校准板之间的数据。
2. 建议在一式三份的运行运行的miRNA阵列。如果一个miRNA的不存在，至少在三分之二的副本将被设置为nonexpressed。
3. 在预处理的下一个步骤中，设置一个隔断。限定切断值指示与阈值循环（C _T），高于此值的数据将被丢弃。在使用脑脊液标本，本实验中，切断设定在39。疗法安伏，用_C T比三个副本39更高的所有样本将被丢弃。如果与miRNA具有C _T> 39为一个探针（一个复制品出三个），该读数将与在C _t的另外两个探针的平均取代，条件是它们均低于39。
4. 定义参考基因。 GENEX专业有利用geNorm和/或NormFinder识别参照基因的选择。选择具有类似CQ值在所有样品并运行geNorm和/或NormFinder miRNA的列表。根据这样的分析，在这里提供的例子中，miR-622和miR-1266具有横跨试样的最均匀的值，并且被选择作为参考基因（ 图1）。
5. 接着，数据使用的参考基因归一化并且所获得的值对应于ΔC _吨
6. 如果cDNA合成反应中以一式三份进行，在这点的值进行平均。
7. 验证表重新移动空，几乎空列。在预处理的窗口中选择“验证表”，并比对申请删除空列线。在下面的行，选择有效数据所需的百分比，然后单击应用。例如，选择100％，如果你想比较通用于所有样品只的miRNA。
8. 处理缺失数据。
   请从预处理菜单中的“缺失数据”并选择选项来处理丢失的数据之一。此步骤是必需的。请注意，如果您尝试加载包含未处理丢失的数据文件GENEX会给你错误。
9. 确定样本（ 即 。实验与对照）组之间相对定量。群体之间的相对定量是使用_ΔΔC T法计算。在GENEX，单击预处理选项卡，并选择相对定量。在窗口中选择参照组和命中适用。请注意，对于图形表示和/或作进一步的统计分析中，expr分裂国家的数据应该转换为对数刻度。在预处理菜单中，选择LOG2。

2.3.3。统计分析

GENEX软件允许多种统计分析，包括t检验和方差分析。

1. 加载最终mdf文件到GENEX和开放的数据管理。关键是要选择其中进行统计分析的样品的正确的样品或组。
2. 选择“统计”，并选择对应于所期望的测试的图标。
3. 单击“运行”，在控制面板窗口。结果保存为Excel或MDF文件。

2.3.4。表达谱

小分子RNA和样品可分类，聚类和可视化的热图和树状图，如下

1. 加载最终mdf文件到GENEX和开放的数据管理。使用此窗口来选择并创建样品或miRNA的群体。单击“应用”时，你就完成了。
2. 在左上角选择群集，然后单击上的热图图标
3. 在控制面板窗口中，单击“运行”。热图可以储存在不同的格式，如TIFF或BMP，它也可以被复制，并根据需要进行修改。

结果

从本研究结果先前已公布的^1。 图1显示了使用geNorm应用候选参考microRNA的分析结果。因此，2微小RNA中，miR-622和miR-1266，被确定为参考基因和被用于归一化的miRNA值。

对于脑脊液研究中，我们有三组样品的HIV-（N = 10），HIVE（N = 4）和HIV（+）无脑炎（HIV（+）中，n = 5）。这两个群体，HIVE和HIV阳性，与对照病毒组进行了比较。经统计分析?...

讨论

microRNA是小非编码RNA，通过抑制翻译和/或促进mRNA降解²调节基因表达。由于其高稳定性在无细胞的条件下，微小RNA已在许多体液检测。此外，microRNA的独特表达谱已与相关阶段和/或进展中的各种人类癌症^3-9。

有可用来分析小分子RNA的几种工具，其中包括经典的芯片阵列或最新的深度测序技术。然而，我们选择利用一个高度敏感的qPCR平台^10，11，其具有...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3. List of equipment.
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Pipette Tips	Thermo Scientific	9400613
Thermal Cycler C1000	Biorad
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes	Biorad	TLS0801
Flat Cap Strips	Biorad	TLS0803
LightCycler 480 Real-Time PCR System	Roche
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche	04 729 757 001
Refrigerated Centrifuge 5804R	Eppendorf
Swing-bucket Rotor, 4-place	Eppendorf	A-4-44
Bench-Top Mini Centrifuge	Fisher	05-090-100
Bench-Top Vortex	Fisher
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized	Fisher	02-681-5
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173
Table 4. List of reagents.
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml	Exiqon	203400
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana miRNA isolation Kit, 40 isolations	Ambion	AM1556
MS2 RNA carrier	Roche Applied Science	10165948001
2-mercaptoethanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
Ethanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nuclease free water	Qiagen	1039480
RNAse Zap	Ambion	AM9780