JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

من خلال الجمع بين الأم ويشابك مناعي لونين مع عالية الدقة الطيف الكتلي، نهج ChroP تمكن من تشريح بنية البروتين المركب من التعديلات هيستون، المتغيرات والبروتينات غير histonic التآزر في المجالات ونين متميزة وظيفيا.

Abstract

الكروماتين هو مجمع البروتين النووي ديناميكية للغاية مصنوعة من الحمض النووي والبروتينات التي تتحكم في العمليات التي تعتمد على الحمض النووي المختلفة. وينظم هيكل لونين وظيفة في مناطق معينة من التخصيب المحلي للهيستون بعد متعدية التعديلات (hPTMs) والمتغيرات، والبروتينات ملزمة لونين، بما في ذلك عوامل النسخ، والحامض النووي. توصيف البروتين من تكوين لونين في مناطق وظيفية متميزة أعاق حتى الآن بسبب عدم وجود بروتوكولات فعالة لإثراء هذه المجالات في النقاء وكمية مناسبة لاحقة لتحليل متعمق من قبل الطيف الكتلي (MS). نحن هنا وصف استراتيجية البروتينات لونين المصممة حديثا، واسمه ChroP (CHRO ماتان P roteomics)، حيث تم استخدام لونين مناعي التحضيرية لعزل المناطق التي لونين متميزة الميزات، من حيث hPTMs، وشارك المتغيرات المرتبطة البروتينات غير histonic، هي تحليلها من قبل MS. نحن لتوضيح انهإعادة المنطقة لاقامة ChroP لإثراء وتحليل المناطق heterochromatic الصمت transcriptionally، والتي تمثلت في وجود ثلاثي مثيلة ليسين 9 على هيستون H3. النتائج التي تحققت بيان إمكانيات ChroP في وصف بدقة بروتيوم المغاير واثبات ذلك باعتبارها استراتيجية تحليلية قوية لفهم كيفية محددات البروتين متميزة من لونين تفاعل وتضافر لإنشاء تكوينات الهيكلية والوظيفية مكان محدد.

Introduction

الكروماتين هو مجمع البروتين النووي ديناميكية للغاية التي تشارك كقالب الأساسي لكافة العمليات بوساطة الحمض النووي. النيوكليوسومات هي الوحدة الأساسية المتكررة من لونين وتتكون من نواة octameric البروتينية التي تحتوي على جزيئين من كل H2A هيستون الكنسي، H2B، H3 H4 و، وتجمع حولها 147 سنة مضت من الحمض النووي يتم تغليف 1،2. وتنظم كل histones الأساسية كمجال كروي ومرنة N-محطة "ذيل" أن يبرز خارج جسيم نووي. ويستند إحدى الآليات الرئيسية لتنظيم بنية الكروماتين وديناميكية على التساهمية التعديلات بعد متعدية (PTMs)، والتي تحدث أساسا على N-تيرميني من الهستونات 3،4. يمكن التعديلات هيستون تعمل إما عن طريق تغيير بنية النظام أعلى لونين، من خلال تغيير الاتصالات بين الهستونات-DNA أو بين Nucleosomes لل، وبالتالي السيطرة على إمكانية الحصول على البروتينات ملزمة الحمض النووي (آليات رابطة الدول المستقلة)، أو عن طريق العمل كمركز dockinز مواقع للبروتينات التنظيمية، إما وحدة واحدة، أو جزءا لا يتجزأ من المجمعات multimeric. ويمكن لهذه البروتينات التي تنظم ممارسة وظيفتها في طرق مختلفة: عن طريق تحوير مباشرة التعبير الجيني (أي البروتينات TAF)، أو عن طريق تغيير وضع النيوكليوسومات (أي لونين إعادة عرض المجمعات) أو عن طريق تعديل بقايا هيستون الأخرى (أي البروتينات مع ميثيل ترانسفيراز أو أسيتيل النشاط ترانسفيراز) (الآليات العابرة) 5. ملاحظة أن أنماط متميزة PTM العنقودية في مواضع محددة لونين أدى إلى وضع فرضية أن تعديلات مختلفة في مواقع متميزة قد تضافر لتوليد رمز الجزيئية التوسط في حالة وظيفية من الحمض النووي الأساسي. اكتسب "فرضية كود هيستون" توافق كبير في السنوات ولكن تم التحقق التجريبي الذي عقد قبل الظهر القيود التقنية 6،7.

وقد برزت البروتيوميات مطياف الكتلة (MS) على النحو الوارد فيأداة قوية لرسم أنماط تعديل هيستون وتميز ملزم لونين البروتينات 8. MS بالكشف عن التعديل باعتباره Δmass محددة بين كتلة التجريبية والنظرية من الببتيد. على مستوى الهستونات الفردية، MS يوفر وسيلة غير متحيزة وشاملة لخريطة PTMs، والسماح للكشف عن تعديلات جديدة وinterplays كاشفة بينهم 9-14.

في السنوات الأخيرة، تم وضع عدد من الاستراتيجيات لتشريح تكوين البروتين لونين، بما في ذلك توصيف الكروموسومات سليمة الإنقسامية 15، وتحديد للذوبان في ملزمة hPTM البروتينات 16-18 وعزل وتحليل مناطق محددة لونين (أي التيلوميرات) 19،20. ومع ذلك، والتحقيق في أوجه التآزر موضع محددة بين PTMs هيستون، المتغيرات، والبروتينات المرتبطة ونين لا تزال غير مكتملة. هنا، نحن تصف نهجا جديدا، واسمه ChroP (الاستشراب roteomics ماتان P) 21، وأننا قد وضعت لتميز بكفاءة متميزة وظيفيا المجالات لونين. هذا النهج يتكيف مناعي لونين (رقاقة)، ​​وبروتوكول راسخة المستخدمة في البحوث جينية، لتحليل البروتين كفاءة يستند إلى MS-من العينة المخصب. وضعنا اثنين من بروتوكولات مختلفة، اعتمادا على نوع من لونين تستخدم كمدخل ومسألة تتناولها MS؛ على وجه الخصوص: يعمل 1) الشذرة من لونين الأم غير المثبتة يتفاعل مع MNase لتنقية أحادية Nucleosomes للوتشريح hPTMs شارك في ربط (N-ChroP)؛ 2) يستخدم الشذرة من لونين crosslinked مجزأة بواسطة صوتنة في تركيبة مع استراتيجية interactomics القائم على SILAC لتوصيف جميع المشاركين في إثراء البروتينات لونين (X-ChroP) ملزمة. نحن هنا توضيح مزيج من N-X-وChroP لإثراء ودراسة المغاير، وذلك باستخدام H3K9me3 كطعم للخطوات مناعي. استخدام ChroP يمكن تمديدهاإما لدراسة مناطق مختلفة على لونين، أو تغييرات في تركيبة لونين داخل المنطقة نفسها خلال الفترة الانتقالية إلى حالة وظيفية مختلفة، مما يمهد الطريق لتطبيقات مختلفة في علم التخلق.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. خلية ثقافة

  1. متوسطة القياسية لرقاقة الأصلي
    1. تنمو خلايا هيلا في تعديل متوسطة Dulbecco والنسر (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ الجلوتامين، 1٪ القلم / بكتيريا و 10 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.5.
  2. وضع العلامات SILAC ليشابك الشذرة
    1. تنمو خلايا هيلا في SILAC DMEM المتوسطة، المنضب من ليسين وأرجينين، على أن تستكمل مع FBS 10٪ مدال، 1٪ الجلوتامين، 1٪ القلم / بكتيريا، 10 ملي HEPES 7.5 درجة الحموضة وإما ضوء L-يسين (ليز 0) وL- أرجينين (الارجنتين 0) أو نظرائهم الثقيلة، L-يسين (ليز 8) وL-أرجينين (الارجنتين 10) (مواد الجدول)، في تركيزات النهائي من 73 ملغم / لتر و 42 ملغم / لتر، على التوالي.
    2. تنمو الخلايا لمدة تصل إلى ثمانية أجيال في SILAC المتوسطة لضمان استكمال الأحماض الأمينية تلوينها النظائر التأسيس. تمر الخلايا كل يومين، عندما تصل كثافة 1.0-1.5 × 10 6 خلية / مل، بذر منهم في ميلانoncentration من 3 × 10 5 خلية / مل.
    3. تقييم نمو الخلايا وقدرتها على البقاء في SILAC متوسطة إلى individuate أي تغيير ممكن من علم وظائف الأعضاء التي قد تنجم عن تكوين الأفقر من SILAC المتوسطة؛ للقيام بذلك:
      1. تفقد البصر الخلايا التشكل في المجهر كل يوم خلال وضع العلامات.
      2. عد الخلايا ومنحنيات النمو مؤامرة الخلايا نموا في SILAC مقابل المتوسطة القياسية.

2. الأصلية مناعي لونين (N-رقاقة)

  1. إعداد نواة من الخلايا المستزرعة
    1. استخدام 1-2 × 10 8 خلايا HeLaS3 غير المسماة في التجربة. خلايا الحصاد، وجعل قسامة من 50 × 10 6 خلايا في 50 مل أنابيب الطرد المركزي في 340 وx ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، وغسلها مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.
    2. في resuspend كل بيليه خلية في 8 مل الاحتياطي تحلل (الجدول 1)، واحتضان لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية على عجلة دوارة. صب كاليفورنياrefully كل المحللة الخلوية على وسادة السكروز (الجدول 1) وأجهزة الطرد المركزي في الدوار سوينغ التدريجي في 3،270 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية، لفصل النوى من السيتوبلازم.
    3. تجاهل supernatants، والحفاظ على الكريات النووية وغسلها مرتين في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة بواسطة الطرد المركزي، وتجاهل طاف في كل غسل.
  2. Micrococcal نوكلياز (MNase) الهضم (الصغيرة) ومراقبة الجودة لونين بعد الهضم
    1. resuspend الكرية النووي غسلها في 1 مل العازلة الهضم (الجدول 1)؛ تقسيم في اثنين aliquots من 500 ميكرولتر والحفاظ على الجليد.
    2. قياس الكثافة الضوئية (OD) في 260 نيوتن متر من قسامة، المخفف 1:200 في 0.2٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) ملاحظة: OD = 1 يعادل حوالي 50 ميكروغرام / مل من الحمض النووي لونين. عادة، بدءا من 2 × 10 8 خلايا، والتطوير التنظيمي هو في حدود 40-60.
    3. تأخذ 1٪ من النوى، إضافة MNase انزيم إلى تركيز النهائي من 0.005 U انزيم / ميكرولتر من النوى واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة هفوات مختلفة الوقت (0، 10، 20، 40، 60 دقيقة).
    4. في كل نقطة زمنية، وجمع 4 ميكرولتر من نوى هضمها وإضافة 1 ملم EDTA لوقف رد الفعل MNase. الحفاظ على الجليد.
    5. استخراج عينات من الحمض النووي من قبل PCR عدة تنقية وأزل لهم في 50 ميكرولتر TE العازلة (الجدول 1).
    6. يستغرق 20 ميكرولتر من كل عينة الحمض النووي، وإضافة 10 ميكرولتر تحميل العازلة (الجدول 1) وتحميل العينات على 1٪ (ث / ت) التي تحتوي على هلام الاغاروز إيثيديوم الميثيل، مع PCR علامة كعنصر تحكم الحجم.
    7. تحقق عملية الهضم تقييم سلم النيوكليوسومات لونين تنتجها MNase الحضانة.
    8. اختيار الوقت الأمثل لعملية الهضم، استنادا إلى انتشار أحادية Nucleosomes للفي التحضير. . عادة ل0.005 U انزيم / ميكرولتر من نوى الوقت الأمثل للMNase الهضم هو 60 دقيقة (الشكل 1B، اللوحة اليسرى) ملاحظة: تركيز / الوقت الأمثل للMNase digestiويمكن تعديل على هذا يتوقف على نوع من الخلايا المطلوبة وعلى حجم Nucleosomes للامتداد.
  3. Large-scale/preparative MNase الهضم والتعافي من كسور لونين للذوبان
    1. إضافة إلى كل قسامة (انظر 2.2.1) 5 ميكرولتر MNase الموافق تركيز النهائي من 0.005 U انزيم / ميكرولتر من النوى؛ المزيج بلطف واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة (أو بشكل عام عن الفاصل الزمني الأمثل، استنادا إلى اختبار على نطاق صغير).
    2. إضافة 1 ملم EDTA لوقف رد الفعل والحفاظ على الجليد. بيليه نوى هضمها بواسطة الطرد المركزي في 7،800 XG في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. نقل supernatants (جزء S1) في أنبوب جديد وتخزينها في 4 درجات مئوية. ملاحظة: يحتوي S1 أول جزء للذوبان من لونين تضم أحادية Nucleosomes لل. إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني (الجدول 1).
    3. Resuspend الكريات بعناية في 1 مل العازلة غسيل الكلى (الجدول 1) وdialyze بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (جحزب التحرير الخروج من أنبوب غسيل الكلى هو 3.5 كيلو دالتون)، في 3 L غسيل الكلى العازلة، مع التحريك المستمر خفيفة. جمع المواد مدال وأجهزة الطرد المركزي في 7،800 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل طاف (S2 جزء) في أنبوب إيبندورف جديدة وتخزينها في 4 درجات مئوية. ملاحظة: S2 يتألف دي لEPTA-Nucleosomes لل، اعتمادا على مدى MNase الهضم.
  4. مراقبة الجودة من لونين قبل مناعي
    1. اتخاذ قسامة الموافق 5 ميكروغرام من S1 و S2 الكسور لونين (كميا عن طريق قياس OD في 260 نانومتر في نظام معمل NanoDrop). استخراج الحمض النووي عن طريق PCR عدة تنقية وأزل في 50 ميكرولتر TE العازلة (الجدول 1).
    2. يستغرق 20 ميكرولتر من الحمض النووي S2 S1 و، مع مزيج 10 ميكرولتر تحميل العازلة (الجدول 1) وتحميلها على 1٪ (ث / ت) agarose هلام. تحقق من جودة وكفاءة MNase الهضم عن طريق التفتيش البصري للسلم Nucleosomes للملاحظة: جزء S1 هو غايةالمخصب في أحادية Nucleosomes لل، في حين كسر S2 يحتوي أساسا بولي Nucleosomes لل(1B الشكل، لوحة على اليمين).
  5. حضانة لونين مع الأجسام المضادة
    1. تخزينها في -20 درجة مئوية 50 ميكرولتر من S1 جزء لاحقة تحليل الطيف الكتلي.
    2. إضافة 1 حجم رقاقة التخفيف العازلة (الجدول 1) إلى جزء S1.
    3. إضافة الأجسام المضادة ضد hPTM (أو البروتين) في المصالح؛ احتضان بين عشية وضحاها على عجلة دوارة في 4 درجات مئوية. ملاحظة: عادة، استخدام 10 ميكروغرام إلى 20 ميكروغرام من الأجسام المضادة ل2 × 10 8 خلايا. النسبة المثلى بين كمية الأجسام المضادة وخلايا بدءا رقم يجب تعيين بعناية كل حالة على حدة، اعتمادا على وفرة من hPTM / بروتين يستخدم كطعم ضمن العينة وعلى كفاءة الجسم المضاد. الأمثل هو التجريبية، استنادا إلى الاختبارات التالية:
      1. مقارنة كمية hPTM / البروتين في المصالح بين المدخلات والتدفق من خلال (FT،انظر 2.7.2) من قبل لطخة غربية أو MS للتحقق من أن مناعي يثري نسبة كبيرة من المنطقة لونين محددة ملاحظة: ويتم ذلك عادة عندما يتم استنفاد 50٪ على الأقل من الطعم hPTM / البروتين في FT (الشكل 1C) .
      2. تأكد من أن البروتين immunoprecipitated من الفائدة هو ظاهرة على هلام SDS-PAGE، والتي تضمن أن كمية كافية من المواد متاحة للتحليل MS ملاحظة: إن وجود على هلام من عصابات المقابلة لhistones الأساسية الأربعة في العناصر المتفاعلة الصحيح يشير إلى أن النيوكليوسومات سليمة وقد immunoprecipitated التي كتبها N-ChroP (1D الشكل). عدم وجود العناصر المتفاعلة الصحيح هو في الواقع يدل على التقويض الجزئي / تتكشف من النيوكليوسومات.
    4. في موازاة ذلك، يعد البروتين يقترن G حبات المغناطيسي (انظر 2.6).
  6. موازنة وحجب البروتين يقترن G حبات المغناطيسي
    1. تتوازن 100 ميكرولتر من البروتين حبات مغناطيسية G-جانب الطين في عرقلة الحل (الجدول 1)، وغسل ثلاث مرات وتفرخ لهم بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على عجلة دوارة ملاحظة: بعد القدرة ملزم من الخرز، واستخدام 100 ميكرولتر من الطين ل 2-20 ميكروغرام من الأجسام المضادة.
    2. تغسل حبات منعت مرة واحدة مع عرقلة الحل ثم مرتين مع الشذرة التخفيف العازلة (الجدول 1).
  7. عزل لونين باستخدام الخرز المغناطيسي
    1. إضافة 100 ميكرولتر من الخرز منعت لونين العينة S1 واحتضان لهم على عجلة دوارة في 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعة. أجهزة الطرد المركزي في 340 x ج لمدة 1 دقيقة لتدور باستمرار عينة من غطاء من النصائح. وضعها في رف المغناطيسي لتكوير الخرز.
    2. نقل طاف لأنبوب إيبندورف جديدة. هذا هو تدفق من خلال (FT)، وهي جزء من لونين التي لم ربط الأجسام المضادة.
    3. تغسل حبات أربعةمرات في غسل العازلة (الجدول 1) زيادة تركيز الملح في كل غسل (75، 125 و 175 ملي مول كلوريد الصوديوم).
    4. لأزل لونين immunoprecipitated، واحتضان حبات في 30 ميكرولتر من عينة LDS العازلة، على أن تستكمل مع 50 ملي dithiothreitol (DTT) لمدة 5 دقائق عند 70 درجة مئوية. فصل البروتينات مزال على 4-12٪ مكرر تريس الأكريلاميد SDS-PAGE مسبقة الصب التدرج جل وصمة عار الجل مع صمغي Coomassie عدة تلطيخ (الشكل 1D).

3. يشابك مناعي لونين (X-الشذرة)

  1. يشابك من الخلايا مع الفورمالديهايد
    1. إضافة 0.75٪ الفورمالديهايد إلى الخلايا المسمى SILAC، مزيج لفترة وجيزة واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إخماد الفورمالديهايد بإضافة 125 ملي الجلايسين واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. تقسيم الخلايا في 5 × 10 7 مأخوذة؛ شطف لهم ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة بواسطة الطرد المركزي في 430x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، والتخلص من supernatants بعد كل غسل. في غسل الماضي، وتجاهل طاف والحفاظ على بيليه. ملاحظة: بمجرد crosslinked الخلايا، ويمكن تخزينها في -80 درجة مئوية، إذا لم يتم استخدامها على الفور.
  2. إعداد نوى
    1. في resuspend كل بيليه خلية في 10 مل الاحتياطي تحلل (الجدول 1). احتضان لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية مع التناوب. أجهزة الطرد المركزي في 430 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل supernatants؛ تبقي الكريات النووية.
    2. في resuspend كل بيليه في 10 مل النووية غسل العازلة (الجدول 1). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة على عجلة دوارة.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 430 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل supernatants وجمع الكريات.
    4. في resuspend كل الكريات النووية في 3 مل الشذرة الحضانة العازلة (الجدول 1). الحفاظ على الجليد.
  3. صوتنة لونين ومراقبة الجودة
    1. يصوتن الفصل. romatin في 200 W (دورات 30 ثانية "على" و1 دقيقة "قبالة")، في Bioruptor تبريد، لتفتيت لونين ملاحظة: يعتمد على عدد من الدورات وفترات صوتنة على نوع من الخلايا ومتوسط ​​طول النووي nucleosomal تمتد المطلوب. عادة، و 30 دقيقة من صوتنة ضرورية لتوليد شظايا الحمض النووي من 300-500 سنة مضت في أطوال الموافق ثنائي وثلاثي Nucleosomes لل. اختيار حجم شظايا يعتمد على نوع المجال لونين قيد التحقيق.
    2. تأخذ 2٪ من مجموع المدخلات، عكس يشابك قبل الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة في الحضانة الشذرة العازلة. استخراج الحمض النووي عن طريق PCR عدة تنقية، أزل في 50 ميكرولتر TE العازلة وتحميل DNA على هلام الاغاروز للتحقق تجزئة لونين.
  4. حضانة لونين مع الأجسام المضادة
    1. إضافة حجم 1/10 من 10٪ تريتون X-100 لونين و sonicated. أجهزة الطرد المركزي في 12،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير ديخسارتك.
    2. انقاذ 50 ميكرولتر من المدخلات لونين من خلايا الثقيلة لاختبار مستوى إدماج الأحماض الأمينية SILAC في الخلايا المسمى وللبروتين التنميط.
    3. إضافة الضد من اختيار لونين المتبقية المسمى الثقيلة والخفيفة واحتضان بين عشية وضحاها و sonicated في 4 درجات مئوية على عجلة دوارة. في القناة الخفيفة، إضافة أيضا أضعاف الزيادة في الببتيد القابلة للذوبان. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على عجلة دوارة ملاحظات: يتم اختيار الشرط الأمثل بين ميكروغرام من الأجسام المضادة والمواد بدءا من الخلايا كل حالة على حدة، كما نوقش في 2.5.3. الأمثل المولية أضعاف الزيادة في الببتيد القابلة للذوبان في يتعلق الضد يجب معاير بعناية كل حالة على حدة.
  5. عزل لونين باستخدام الخرز المغناطيسي
    1. تتوازن ومنع البروتين يقترن G حبات مغناطيسية وذلك باتباع الخطوات الموضحة في 2.6 واستخدام رقاقة العازلة الحضانة.
    2. إضافة 100 ميكرولتر من سدت بEADS للعينات لونين واحتضان على عجلة دوارة لمدة 3 ساعة على 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي في 340 x ج لمدة 1 دقيقة لتدور باستمرار عينة من غطاء من النصائح. وضعها في رف المغناطيسي لتكوير الخرز. طاف هو تدفق من خلال (FT)، التي تحتوي على Nucleosomes للغير منضم. غسل حبات أربع مرات في غسل العازلة (الجدول 1) مع زيادة تركيز الملح (اثنان يغسل في 150 ملي واثنين على 300 ملي مول كلوريد الصوديوم).
    3. احتضان حبات في 30 ميكرولتر عينة SDS-PAGE تحميل العازلة (الجدول 1) ومدة 25 دقيقة في 95 درجة مئوية لكلا أزل وإزالة البروتينات immunoprecipitated تشعبي. البروتينات منفصلة على 4-12٪ مكرر تريس الأكريلاميد SDS-PAGE المواد الهلامية مسبقة الصب (الشكل 3D).

4. إعداد نموذج قبل MS

  1. في جل هضم الهستونات المخصب من N-الشذرة
    ملاحظة: أثناء اتخاذ الهضم من البروتين والببتيد استخراج الخطوات الرعايةللحد من التلوث الكيراتين التي تتداخل مع LC-MS/MS، كما هو موضح سابقا 22 و 23.
    1. قطع شرائح هلام المقابلة لhistones الأساسية العصابات (1D الشكل). دي صمة عار القطع هلام مع 50٪ أسيتونتريل (ACN) في DDH 2 O، بالتناوب مع 100٪ ACN لتقليص هلام. تكرار حتى يتم تماما دي الملون والمواد الهلامية القطع وتجفيفها في جهاز للطرد المركزي فراغ.
    2. إضافة D 6 الخليك أنهيدريد 01:09 (ت / ت) في 1 M بيكربونات الأمونيوم (NH 4 HCO 3) (عادة الحجم النهائي هو 60-100 ميكرولتر) و 3 ميكرولتر خلات الصوديوم (CH 3 COONa)، والمحفز. احتضان لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية مع الهز قوي ملاحظة: العينة قد تولد فقاعات في الدقائق الأولى بعد التجميع من ردود الفعل: من المهم التعامل بحذر والافراج عن الغاز ولدت، وفتح من وقت لآخر للأنابيب أثناء الحضانة.
    3. شطف القطع هلام عدة مرات ثإيث NH 4 HCO 3، تتناوب مع ACN إلى زيادة مئوية (من 50٪ الى 100٪)، من أجل القضاء على مخلفات D أنهيدريد الخليك 6 تماما.
    4. تقليص قطعة هلام في 100٪ ACN؛ تجفيفها في جهاز للطرد المركزي فراغ لضمان كاملة إزالة الماء. إعادة هيدرات قطعة هلام مع الثلج الباردة 100 نانوغرام / ميكرولتر حل التربسين في 50MM NH 4 HCO 3 واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. ملاحظة: مزيج من التعديل الكيميائي للlysines باستخدام أنهيدريد الخليك بالديوتيريوم والتربسين الهضم يولد "الارجنتين- C أحب "في نمط الهضم هلام من الهستونات 21،24.
    5. تجاهل الحل الزائدة وإضافة حجم 50 ملي NH 4 HCO 3 لتغطية كامل القطع هلام؛ احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    6. جمع الببتيدات هضمها للذوبان في أنبوب إيبندورف جديدة. يجفد الببتيدات. في resuspend لهم في 0.5٪ الخليك acid/0.1٪ حمض trifluoracetic (TFA). Desalt والتركيزالببتيدات على عكس المرحلة C 18 / الكربون "ساندويتش"، والتبادل الأيوني اللوني (SCX) على microcolumns يدوية الصنع (StageTip) 25.
    7. إعداد microcolumns StageTip عن طريق وضع أقراص تحتوي على شبكه تفلون يجمد C 18 / الكربون ("ساندويتش") وحبات SCX في 200 نصائح ميكرولتر. الحصول على "ساندويتش" عن طريق تحميل microcolumn C 18 على رأس تلميح الثانية محملة فلتر الكربون ملاحظة: إن الببتيدات قصيرة جدا، وهذا لا يتم الاحتفاظ على مرشح C 18، وتمرير في التدفق من خلال التي يتم تحميلها مباشرة على تلميح الكربون، والتي عادة ما يلتقط لهم. يمكن StageTips SCX إثراء الببتيدات محددة، مثل H3 (3-8) الببتيد، لا يتم الاحتفاظ بكفاءة من خلال عكس المرحلة اللوني.
    8. الحمل 50٪ من الببتيدات على C 18 / الكربون "StageTip شطيرة" و 50٪ على SCX StageTips. أزل لهم من نصائح C 18 / الكربون باستخدام 80٪ ACN/0.5٪ ميلان الخليكومعرف من نصائح SCX مع هيدروكسيد الأمونيوم 5٪ (NH 4 OH) / 30٪ الميثانول. بعد الببتيدات تجفيد، resuspend في 0.1٪ FA وتحليل من قبل LC-MS/MS.
  2. في جل هضم البروتينات immunopurified
    ويتم في جل هضم البروتينات خارج كما هو موضح سابقا 22، مع تعديلات طفيفة.
    1. قطع كل حارة في عشر شرائح (الشكل 3D) وكل شريحة في مكعبات صغيرة من 1 مم 3. دي صمة عار القطع هلام مع 50 ملي NH 4 HCO 3/50٪ من الإيثانول وإضافة الإيثانول المطلق لتقليص المواد الهلامية. كرر حتى المواد الهلامية هي تماما ملطخة دي.
    2. إضافة العازلة التخفيض (الجدول 1) إلى القطع هلام لمدة 1 ساعة عند 56 درجة مئوية، تليها إضافة العازلة الألكلة (الجدول 1) لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، في الظلام. غسل وتجفيف القطع هلام في فراغ الطرد المركزي.
    3. ترطيب قطعة هلام مع الثلج الباردة 12.5 نانوغرام / ميكرولتر التربسين سولution في 50 ملي NH 4 HCO 3 واحتضان على الجليد حتى الإماهة كاملة من القطع هلام. إزالة التربسين في الزائدة.
    4. إضافة 50 ملي NH 4 HCO 3 لتغطية كامل القطع هلام. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    5. جمع الجزء السائل. إضافة العازلة استخراج (الجدول 1) إلى القطع هلام؛ احتضان مع الانفعالات القوية لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر مرتين.
    6. احتضان القطع هلام في ACN لمدة 10 دقيقة مع الانفعالات القوية. كرر مرتين وتجميع جميع supernatants.
    7. يجفد الببتيدات. في resuspend الببتيدات المجففة في 0.5٪ الخليك acid/0.1٪ TFA.
    8. Desalt والتركيز الببتيدات على عكس المرحلة C 18 StageTip، كما هو موضح 26، 27.
    9. أزل الببتيدات من StageTip C 18 باستخدام 80٪ ACN/0.5٪ حامض الخليك. إزالة المذيبات العضوية عن طريق تبخير في جهاز للطرد المركزي فراغ و resuspend الببتيدات في 0.1٪ FA (عادة 5-10 و# 181؛ ل)، عندما تصبح جاهزة لتحليل MS.

5. LC-MS تحليل

  1. التحليل اللوني السائل
    1. حزمة العمود التحليلية في 15 سم تنصهر السيليكا باعث (75 ميكرون القطر الداخلي، 350 ميكرون القطر الخارجي)، وذلك باستخدام عكس المرحلة (RP) C 18، 3 الراتنج ميكرومتر في الميثانول، عند ضغط الهيليوم ثابتة (50 بار) باستخدام الجهاز قنبلة لودر، كما هو موضح سابقا 28.
    2. زوجين باعث (C 18 العمود RP) معبأة مباشرة إلى منفذ صمام 6 المنفذ من خلال HPLC طويلة (25 ميكرون القطر الداخلي) 20 سم، وتنصهر السيليكا دون استخدام ما قبل العمود أو الجهاز الانقسام.
    3. تحميل الببتيدات هضمها في العمود C 18 RP في تدفق 500 NL / دقيقة الطور المتحرك A (0.1٪ FA / 5٪ ACN في DDH 2 O).
    4. بعد عينة التحميل وفصل الببتيدات باستخدام التدرجات التالية:
      1. تطبيق 0-40٪ الطور المتحرك B (0.1٪ FA/99٪ ACNفي DDH 2 O) في 250 NL / دقيقة أكثر من 90 دقيقة تليها التدرج من 40-60٪ في 10 دقيقة و 60-80٪ خلال 5 دقائق، لشطف من الببتيدات المستمدة من الهستونات (انظر 2).
      2. تطبيق 0-36٪ في الطور المتحرك B 250 NL / دقيقة أكثر من 120 دقيقة تليها التدرج من 36-60٪ في 10 دقيقة و 60-80٪ خلال 5 دقائق، لشطف من الببتيدات المستمدة من البروتينات immunopurified (انظر 3).
  2. تحليل الطيف الكتلي باستخدام LTQ-FT-ICR-الترا مطياف الكتلة
    1. تعمل في الاستحواذ التي تعتمد على البيانات (DDA) واسطة للتبديل تلقائيا بين MS واكتساب MSMS. يتم الحصول على MS أطياف مسح كامل، وعادة في نطاق م / ض من 200-1،650، ​​ويكتسب لقرار R = 100،000 في 400 م / ض. يتم عزل الخمسة (TOP5) الأيونات على أشده للتجزئة في فخ ايون الخطية باستخدام التفكك المستحث الاصطدام (CID) بقيمة 5،000 هدف.
    2. استخدام المعلمات المدرجة في الجدول 2 FOص على "ضبط" ملف الاستحواذ.
    3. تعيين إعدادات اقتناء القياسية كما هو موضح في الجدول رقم 2.

6. تحليل البيانات

  1. تسمية الكمي خالية من التعديلات هيستون التخصيب المشترك في المجالات الكروماتين
    1. تحويل الملفات الخام المكتسبة إلى ملفات إم جي إف باستخدام Raw2msm البرمجيات (الإصدار 1.10) 29.
    2. بحث التعديلات هيستون باستخدام برنامج Deamon التميمة (الإصدار 2.2.2)، تعيين المعلمات وصفها في الجدول 3.
    3. على التميمة الانتاج القائمة الببتيد، وإزالة الببتيدات مع درجة أقل من 15 أو أكثر من 5 PTMs المفترضة 29 ملاحظة: للحصول على كل معرف الببتيد واحد، حدد الببتيد وفقا لأعلى درجة التميمة وتصفية جميع الببتيدات زائدة أخرى مع نفس معرف .
    4. بناء المخططات الاستشرابية أيون استخراج (XIC) لكل السلائف المقابلة لكل الببتيدات المعدلة والسفلىإد على قيمة م / ض، وذلك باستخدام QualBrowser. حساب مساحة تحت المنحنى (AUC) لكل الذروة (الشكل 2A).
    5. التحقق من صحة كل الببتيدات تحتوي على التعديلات التي تم تحديدها عن طريق التفتيش البصري من أطياف MS / MS باستخدام QualBrowser (الشكل 2B).
    6. حساب الوفرة النسبية لكل الببتيد المعدلة. حساب تخصيب النسبية لكل التعديل في المواد الشذرة إد ملاحظة: يتم احتساب فرة النسبية كنسبة بين مفوضية الاتحاد الأفريقي من كل الببتيد تعديل محددة على مبلغ من الجامعة الأمريكية بالقاهرة من جميع أشكال معدلة وغير معدلة من نفس الببتيد، في حين النسبية تخصيب كنسبة من الوفرة النسبية للتعديل محددة في الشذرة على الإدخال (الشكل 2C).
  2. تحليل البروتين الكمي من البروتينات المرتبطة شارك ضمن المجالات لونين
    1. لتحديد وتقدير البروتينات استخدام حزمة MaxQuant(http://www. maxquant.org /) 30. تكوين محرك البحث المدمج في "أندروميدا" باستخدام AndromedaConfig.exe 31 وتعيين معلمات البحث المدرجة في الجدول 3.
  3. اختبار التأسيس
    1. تقدير درجة التأسيس من الأحماض الأمينية إلى بروتينات الثقيلة في الثقيلة المسمى إدخال لونين، وذلك باستخدام البرمجيات MaxQuant، على النحو التالي:
      1. تعيين المعلمات كما هو موضح في 6.2 ولكن تعطيل خيار إعادة تحديد.
      2. حساب النسبة المئوية التأسيس تطبيق الصيغة التالية لنسب الببتيد غير زائدة: التأسيس (٪) = نسبة (H / L) / نسبة (H / L) + 1 × 100 (الشكل 3B) ملاحظة: قبول إلا إذا دمج> 95 ٪.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

مناعي لونين هي تقنية قوية تستخدم لملف توطين البروتين أو تعديل هيستون على طول الجينوم. في ما يعادل البروتينات، ويتبع الشذرة بواسطة البروتينات يستند إلى MS-لتحديد نوعيا وكميا في hPTMs، المتغيرات بروتينات بسيطة وملزم لونين التي immunoprecipitated جنبا إلى جنب مع تعديل أو البروتين ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وصفناها مؤخرا ChroP، استراتيجية الكمية لتوصيف نطاق واسع من مكونات البروتين لونين. ChroP يجمع بين نهجين متكاملين المستخدمة في مجال جينية، والشذرة MS، والاستفادة من نقاط القوة والتغلب على القيود الخاصة بها. الشذرة جانب لتسلسل عميق (رقاقة تسلسل) يسمح للرسم خرائط الجينوم واس?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وقد نشر هذا البحث في الأصل في مول البروتيوميات الخلية. Soldi M. وBonaldi T. والبروتيومية التحقيق في لونين المجالات الوظيفية يكشف رواية Synergisms بين مكونات متميزة المغاير MCP. عام 2013؛ 12: 64-80. © الجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية. نشكر روبرتا Noberini (المعهد الإيطالي للتكنولوجيا ومكتب التقييم المستقل، إيطاليا) لقراءة نقدية للمخطوطة. ويدعم عمل السل من المنح المقدمة من جامعة هارفارد، Armenise برنامج جيوفاني مؤسسة التطوير الوظيفي، والجمعية الإيطالية لأبحاث السرطان ووزارة الصحة الإيطالية. وأيد العمل MS بواسطة زمالة FIRC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM LonzaBE12-614F
FBSInvitrogen10270-106
SILAC DMEMM-MedicalFA30E15086
Dialyzed FBSInvitrogen26400-044
Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine)Sigma AldrichL8662
Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine)Sigma AldrichA6969
Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine)Sigma Aldrich68041
Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine)Sigma Aldrich608033
Micrococcal NucleaseRoche10 107 921 001
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail TabletsRoche04 693 132 001
Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot lengthSpectrumlabs132720
QIAquick PCR purification kitQIAGEN28104
Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP gradeAbcamab8898
Histone H3 peptide tri-methyl K9 Abcamab1773
Dynabeads Protein GInvitrogen100.04D
NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel InvitrogenNP0335BOX
Colloidal Blue Staining KitInvitrogenLC6025
LDS Sample BufferInvitrogenNP0007
FormaldheydeSigma AldrichF8775
Aceti anhydride-d6Sigma Aldrich175641-1G
[header]
Formic AcidSigma Aldrich94318-50ML-F
Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystallineSigma AldrichI6125
DL-DithiothreitolSigma Aldrich43815
Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg)PromegaV5113
Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5Microcolumn SrlFS360-75-8-N-5-C15
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% CDr. Maisch GmbHr13.aq.
Carbon extraction disk, 47 mmAgilent Technologies12145040
Cation extraction diskAgilent Technologies66889-U

References

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  3. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  4. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
  5. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  6. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
  7. Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
  8. Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
  9. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
  10. Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
  11. Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
  12. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
  13. Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
  14. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
  15. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
  16. Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
  17. Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
  18. Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
  19. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  20. Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
  21. Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
  22. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
  23. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
  24. Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
  25. Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
  26. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
  27. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
  28. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
  29. Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
  30. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
  31. Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
  32. Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
  33. Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
  34. Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
  35. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
  36. Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
  37. Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
  38. Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
  39. Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
  40. Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

86 hPTMs SILAC chromatome hPTMs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved