ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

요약

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

초록

염색질은 다양한 DNA에 의존하는 프로세스를 제어하는​​ DNA와 단백질로 이루어진 매우 역동적 인 핵 단백질 복합체이다. 특정 지역에서 염색질의 구조와 기능은 전사 인자 및 DNA 메틸화를 포함 히스톤 번역 후 변형 (hPTMs) 및 변종, 크로 마틴 결합 단백질의 지역 농축에 의해 조절된다. 서로 다른 기능 영역에서 크로 마틴 조성물의 프로테오믹스 특성은 지금까지 질량 분석 (MS)에 의해 후속 심층 분석에 적합한 순도와 양에 같은 도메인을 풍부하게하는 효율적인 프로토콜의 부족에 의해 방해되었다. 우리는 여기에 예비 크로 마틴 면역이 그 기능 hPTMs의 측면에서, 변종 공동 관련된 비 histonic 단백질 별개의 염색질 영역을 분리하는 데 사용된다 ChroP (색도 MATIN의 P의 roteomics)라는 이름의 새롭게 디자인 된 염색질 단백질 체학 전략을, 설명 MS에 의해 분석 하였다. 우리는 그가를 설명히스톤 H3상의 라이신 9의 트라이 메틸화의 존재에 의해 표시 전사적으로 침묵 염색질 영역의 농축 및 분석을위한 ChroP의 설정까지 재. 달성 된 결과는 완전히 이질 염색질 프로테옴의 특징과 염색질의 고유 한 단백질 결정의 상호 작용 및 현장 별 구조 및 기능 구성을 설정하는 시너지 효과 방법을 이해하기위한 강력한 분석 전략으로 그것을 증명에 ChroP의 가능성을 보여줍니다.

서문

염색질은 모든 DNA가 중재 프로세스에 대한 기본 템플릿으로 관여하는 매우 역동적 인 핵 단백질 복합체이다. 뉴 클레오 솜은 염색질의 기본 반복 단위이며, DNA의 147 BP는 ^{1, 2를} 포장하는 주위에 각 표준 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4, 두 분자를 포함하는 단백질 octameric 코어로 구성되어 있습니다. 모든 핵심 히스톤은 구형 도메인과 뉴 클레오 외부에 돌출 유연한 N-말단 "꼬리"로 구성되어있다. 염색질 구조와 역학을 조절하기위한 중요한 메커니즘 중 하나는 주로 ^3,4 히스톤의 N-말단에 공유 결합이 발생 번역 후 변형 (PTMS)에 기초한다. 히스톤 변형이 히스톤-DNA 사이 또는 뉴 클레오 간의 접점을 변경함으로써, 고차 염색질 구조를 변경하고, 따라서 DNA 결합 단백질 (시스 메카니즘)의 액세스 가능성을 제어함으로써 어느 작동하거나 dockin 역할을하여규제 단백질, 하나 하나의 단위 또는 다중 체 복합체에 포함 된 같은 G 사이트. 이러한 조절 단백질이 다른 방법으로 그 기능을 발휘할 수있다 : 직접 유전자 발현 (즉, TAF 단백질)을 변조하여, 또는 뉴 클레오 솜 위치 (즉, 염색질 단지를 리모델링)을 변경하거나 다른 히스톤의 잔류 물 (메틸 트랜스퍼 나있는, 즉 단백질의 아세틸을 수정하여 전이 활성) (트랜스 메커니즘) ^5. 특정 염색질의 유전자 좌에서 별개의 PTM 패턴 클러스터는 별개의 사이트에서 다른 수정이 기본이되는 DNA의 기능 상태를 중재하는 분자 코드를 생성하는 시너지 효과를 수 있다는 가설의 고심을 주도하는 관찰. "히스톤 코드의 가설은"몇 년 동안 큰 공감대를 얻고있다하지만 실험적인 검증은 기술적 인 한계 ^6,7에 의해 다시 개최되었습니다.

질량 분석 (MS) 기반 프로테오믹스는로 떠오르고있다강력한 도구 히스톤 변형 패턴을 매핑하고, 염색질 결합 단백질 ^{8의 특징을.} MS는 펩티드의 이론 및 실험 질량 사이의 특정 Δmass로 변경을 감지합니다. 개별 히스톤의 수준에서, MS는 그 ^9-14 사이에서 새로운 수정과 계시 interplays의 검출을 허용, PTMS를 매핑하는 공정한하고 포괄적 인 방법을 제공한다.

최근, 전략의 숫자는 그대로 유사 분열 염색체 ^15, 수용성 hPTM 결합 단백질 ^16-18의 식별과 특정한 염색질 영역의 분리 및 분석의 특성을 포함하여 염색질의 프로테오믹스 조성물을 해부 개발되었다 (즉 말단 소립) ^{19, 20.} 그러나, 히스톤 PTMS, 변형, 염색질 관련 단백질의 궤적 별 시너지 효과의 조사는 아직 불완전하다. 여기, 우리는 (ChroP라는 새로운 접근 방식을 설명우리는 효율적으로 기능 별개의 염색질 도메인의 특성을 개발하는 것이 색도 MATIN의 P의 roteomics) ^21. 이 방법은 풍부한 샘플의 효율적인 MS 기반 단백체 분석을위한 크로 마틴 면역 침전 (칩), 후생 유전 학적 연구에 사용되는 잘 확립 된 프로토콜을 적응시킨다. 우리는 입력 및 MS에 의해 어드레싱 된 질문으로서 사용 염색질의 종류에 따라 두 가지 프로토콜을 개발 하였다; 특히 : MNase로 소화 고정되지 않은 기본 염색질의 1) 칩 모노 뉴 클레오을 정화하고 공동 연관 hPTMs (N-ChroP)를 해부하기 위해 사용된다; 2) 초음파에 의해 조각난 가교 염색질의 칩은 단백질 (X-ChroP)를 결합 모든 공동 농축 염색질의 특성을 SILAC 기반 interactomics 전략과 함께 사용됩니다. 우리는 여기에 면역 침전 단계에 대한 미끼로 H3K9me3를 사용하여, 이질 염색질을 풍부하게 공부에 대한 N-및 X-ChroP의 조합을 보여줍니다. ChroP의 사용은 연장 될 수있다따라서 후성 유전학의 다양한 응용 프로그램에 방법을 포장, 별개의 염색질에 지역, 또는 다른 기능 상태로 전환하는 동안 같은 지역 내에서 염색질 구성의 변화 중 하나를 공부합니다.

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프로토콜

1. 세포 배양

1. 기본 칩의 표준 매체
   1. 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 %의 글루타민, 1 % 펜 / Strep의 10 mM의 HEPES pH를 7.5로 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 HeLa 세포 성장.
2. 칩을 가교 SILAC 라벨링
   1. 10 % 투석 된 FBS, 1 %의 글루타민, 1 % 펜 / Strep의 10 mM의 HEPES pH를 7.5 및 광 L-라이신 (리스 0) 및 L-선택 보충 된 라이신과 아르기닌 고갈 SILAC DMEM 배지에서 HeLa 세포를, 성장 아르기닌 (의 Arg 0) 또는 무거운 대응, L-라이신 (리스 8) 및 L-아르기닌 (의 Arg 10) (자료 표), 각각 73 ㎎ / L, 42 ㎎ / L의 최종 농도.
   2. 완전한 동위 원소 코딩 아미노산 결합을 보장하기 위해 SILAC 매체에 최대 8 세대에 세포를 성장. 그들은 AC에서 그들을 시드, 1.0-1.5 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 밀도에 도달했을 때, 이틀 셀 합격oncentration ⁵ 10 × 3의 세포 / ml.
   3. SILAC 매체의 가난한 구성에서 발생할 수 생리학에서 가능한 모든 변경을 개별화 할 수 SILAC 매체에있는 세포의 성장과 생존 능력을 평가; 이 작업을 수행하려면 :
      1. 시각 세포가 표시 동안 매일 현미경으로 형태를 검사합니다.
      2. 표준 매체 대 SILAC에서 성장 세포의 세포와 음모의 성장 곡선을 계산합니다.

2. 기본 염색질 면역 침전 (N-칩)

1. 배양 된 세포에서 핵 준비
   1. 실험 1 ~ 2 × 10 ⁸ 레이블 HeLaS3 세포를 사용합니다. 수확 세포는, 4 ° C에서 10 분 340 XG에 50 ML 튜브와 원심 분리기에 50 X 10 ⁶ 세포의 분취 량을 얼음처럼 차가운 PBS로 씻어.
   2. 8 ㎖를 용해 버퍼 (표 1)의 각 세포 펠렛을 재현 탁하고 회전하는 바퀴에 4 ° C에서 10 분 동안 배양한다. 캘리포니아을 붓고지나는 곳마다 세포의 세포질에서 핵을 분리하는 4 ° C에서 20 분 동안 3,270 XG에서 스윙 아웃 로터에서 자당 쿠션 (표 1)과 원심 분리기에 해물.
   3. , 상층 액을 버리고 핵 펠렛을 유지하고 각각의 세척에 뜨는 폐기, 원심 분리하여 얼음처럼 차가운 PBS에서 그들을 두 번 씻는다.
2. Micrococcal 클레아 제 (MNase) 소화 (작은 규모) 소화 후 염색질의 품질 관리
   1. 1 ㎖ 소화 버퍼 (표 1)에서 세척 핵 펠렛을 재현 탁; 500 μL의 두 분량 씩 나누어 얼음 계속.
   2. 나누어지는 260 nm에서 광학 밀도 (OD)를 측정, 0.2 % 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)에 1:200으로 희석 주 :. OD = 1 염색질의 DNA의 약 50 ㎍ / ㎖의에 해당한다. 통상적으로, 2 ^× 108 세포로부터 시작 OD는 40-60의 범위이다.
   3. , 핵의 1 %을 0의 최종 농도에 M​​Nase 효소를 추가합니다.005 U 효소 / 핵 ㎕의 서로 다른 시간 경과 (0, 10, 20, 40, 60 분), 37 ° C에서 알을 품다.
   4. 각 시점에서, 소화 핵의 4 μl를 수집하고 MNase의 반응을 정지 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가합니다. 얼음에 보관하십시오.
   5. PCR 정제 키트에 의해 DNA 샘플을 추출하고 50 ㎕의 TE 버퍼 (표 1)에서 그들을 용출.
   6. 각 DNA 샘플의 20 μl를 가지고 버퍼 (표 1)로드 10 μl를 추가하고 1 %의 샘플을로드 (w / v)의 크기 제어와 같은 PCR 마커와 에티 디움 브로마이드를 포함하는 아가로 오스 겔.
   7. MNase 배양에 의해 생성 된 염색질 뉴 클레오 사다리를 평가하는 소화를 확인합니다.
   8. 준비 모노 뉴 클레오 솜의 보급에 따라, 소화를위한 최적의 시간을 선택합니다. . 일반적으로 MNase 소화의 최적 시간은 60 분 (그림 1B, 왼쪽 패널)는 핵의 효소 / μL의 0.005 U에 대한 참고 : digesti의 최적 MNase 농도 / 시간에 것은 원하는 세포 유형과 뉴 클레오 스트레치의 크기에 따라 조절 될 수있다.
3. Large-scale/preparative MNase 소화 및 가용성 염색질 분수 복구
   1. 각 분취 액에 추가 핵 효소 / μL 0.005 U의 최종 농도에 대응하는, 5 μL의 MNase (2.2.1 참조); 부드럽게 혼합 (작은 규모의 테스트를 기반으로 최적화 된 시간 간격 또는 일반적으로) 60 분 동안 37 ° C에서 알을 품다.
   2. 반응을 중지하고 얼음에 계속 1 ㎜ EDTA를 추가합니다. 10 분 동안 4 ° C에서 7,800 XG에서 원심 분리하여 소화 핵 펠렛. 새로운 튜브에 상층 액 (분수 S1)을 전송하고 4 ° C. 주에서 보관 : S1은 모노 뉴 클레오를 포함 염색질의 첫 번째 가용성 분획을 포함하고 있습니다. 단백질 분해 효소 억제제 (표 1)를 추가합니다.
   3. 조심스럽게 재현 탁 1 ㎖ 투석 버퍼 (표 1)의 펠릿과 4 ° C (C에서 하룻밤 dialyze투석 관의 오프 유타) 3.5 kDa의입니다, 일정한 온화한 교반하면서 3 L 투석 버퍼에서. 4 ℃에서 10 분 동안 7,800 XG에서 투석 재료와 원심 분리기를 수집 새로운 에펜 도르프 튜브에 뜨는 (S2 분율)를 전송하고 4 ° C. 주에서 보관 : S2 포함한다 MNase 소화 정도에 따라 epta-뉴 클레오, 디 -에.
4. 면역 전에 염색질의 품질 관리
   1. (NanoDrop 시스템에서 260 nm에서 OD를 측정하여 정량화) S1과 S2 염색질 분수의 5 μg에 해당하는 나누어지는 가져 가라. PCR 정제 키트에 의해 DNA를 추출하고 50 ㎕의 TE 버퍼 (표 1)에서 용출.
   2. , S1과 S2 DNA 20 ㎕을 버퍼 (표 1)로드 10 μL와 혼합 (w / v) 아가로 오스 겔 1 %에 그들을로드합니다. 품질과 뉴 클레오 사다리의 육안 검사로 MNase 소화의 효율성을 확인합니다 :. 분수 S1은 높게일부 S2는 주로 폴리 뉴 클레오 솜 (그림 1B, 오른쪽 패널)를 포함하는 동안, 모노 뉴 클레오 충실.
5. 항체와 염색질의 배양
   1. -20 ° C 이후의 질량 분석 분석을위한 S1 분율의 50 μL에 보관하십시오.
   2. 분수 S1에 칩 희석 버퍼 (표 1)의 1 볼륨을 추가합니다.
   3. 관심 hPTM (또는 단백질)에 대한 항체를 추가; 4 ° C. 주에서 회전하는 바퀴에 밤새 품어 : 일반적으로, 2 × 10 ⁸ 세포를 10 μg 항체 ㎍의 20을 사용합니다. 항체의 양과 시작 세포 수 사이의 최적의 비율은주의 깊게 샘플 내에서 미끼로 사용 hPTM / 단백질의 풍요 로움과 항체의 효율에 따라 사례별로 설정해야합니다. 최적화는 다음의 시험에 기초하여, 실험적 :
      1. 입력과 흐름을 통해 (FT 사이에 관심의 hPTM / 단백질의 양을 비교,면역은 특정 염색질 영역의 상당 부분을 풍요롭게하는지 확인 서양의 얼룩이나 MS에 의해 2.7.2)를 참조하십시오 참고 :. hPTM / 단백질 먹이의 50 % 이상이 FT (그림 1C)에 남아 있던 경우는 일반적으로 달성 .
      2. 관심의 면역 침강 단백질 물질의 충분한 양의 MS 분석에 사용할 수 있음을 보장 SDS-PAGE 젤에 감지 할 수 있는지 확인합니다 :. 정확한 화학 양론에있는 4 개의 코어 히스톤에 대응하는 밴드의 겔의 존재를 본래 뉴 클레오는 N-ChroP (그림 1D)에 의해 면역 침전되었음을 나타냅니다. 적절한 화학 양론의 부족은 뉴 클레오의 전개 부분 중단 / 나타내는 사실입니다.
   4. 병렬 (2.6 참조) 단백질 G-결합 자석 구슬을 준비합니다.
6. 평형 및 단백질 G-결합 자석 구슬의 차단
   1. 슬러리의 100 μl를 사용하여 구슬의 결합 용량 다음과 같습니다. 단백질 100 μl를 평형 G 결합 자석 구슬 솔루션 (표 1), 세 번 세척하고 회전하는 바퀴에 4 ° C에서 하룻밤을 배양 주를 차단 슬러리 항체의 2-20 μg.
   2. 칩 희석 버퍼 (표 1)로 두 번 다음 솔루션을 차단하고 한 번 차단 된 구슬을 씻으십시오.
7. 자석 구슬을 사용하여 염색질의 분리
   1. S1 염색질 샘플 차단 구슬 100 μl를 첨가하고 3 시간 동안 4 ° C에서 회전 휠을 ​​품어. 팁의 뚜껑에서 샘플을 스핀 다운 1 분 340 XG에 원심 분리기. 구슬을 펠렛 자기 랙에 넣습니다.
   2. 새로운 에펜 도르프 튜브에 뜨는을 전송합니다. 이 (FT)를 통해 흐름, 항체에 결합하지 않은 염색질, 즉 분수입니다.
   3. 비즈 네 세척각 세척 (75, 125, 175 mM의 염화나트륨)의 소금 농도를 증가 버퍼 (표 1) 세척의 배.
   4. 면역 침강 염색질을 용출, 70 ℃에서 5 분 동안 50 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT) 보충 LDS 샘플 버퍼 30 μL에서 구슬을 품어 4-12% 비스 - 트리스 아크릴 아미드 SDS-PAGE 프리 캐스트 그라데이션 젤에 용출 된 단백질을 분리하고 콜로이드 쿠마시 염색 키트 (그림 1D)와 젤을 얼룩.

3. 가교 염색질 면역 침전 (X-칩)

1. 포름 알데히드와 세포의 가교
   1. 간략하게 혼합하고 실온에서 10 분 동안 품어 SILAC 표지 세포에 0.75 %의 포름 알데히드를 추가합니다. 125 mM의 글리신을 첨가하여 포름 알데히드를 켄 칭하고 실온에서 5 분 동안 배양한다.
   2. 5 × ⁷ 분량 씩 세포를 나눈다; (430)에서 원심 분리하여 그들에게 얼음처럼 차가운 PBS로 3 회 씻어5 4 ° C에서 최소 각 세척 후 상층 액을 폐기하기위한 XG. 마지막 세척에서, 상층 액을 버리고 침전물을 유지합니다. 참고 : 세포가 가교가되면 바로 사용하지 않을 경우, 그들은, -80 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. 핵 준비
   1. 10 ml의 용해 완충액 (표 1)에서 각 세포 펠렛을 재현 탁. 회전 4 ° C에서 10 분 동안 품어. 4 ℃에서 5 분 430 XG에 원심 분리기 상층 액을 버리고; 핵 펠렛을 유지합니다.
   2. 버퍼 (표 1) 세탁기 10 ㎖에 각각 핵 펠렛을 Resuspend. 회전 휠을 ​​10 분 동안 실온에서 배양한다.
   3. 4 ℃에서 5 분 430 XG에 원심 분리기 상층 액을 버리고 알약을 수집합니다.
   4. 3 ㎖ 칩 보육 버퍼 (표 1)에 각각 핵 펠렛을 Resuspend. 얼음에 보관하십시오.
3. 염색질의 초음파 및 품질 관리
   1. 초음파 처리 채널. 200 W 냉각 Bioruptor 소재 ( "off"1 분 "on"30 초주기), 염색질 단편에서 romatin 참고 : 사이클 및 초음파 간격의 수는 세포 분류에 및 뉴 클레오의 평균 길이에 달려 원하는 스트레칭. 전형적으로, 초음파의 30 분간은 디 - 및 트리 - 뉴 클레오에 대응하는 길이의 300 ~ 500 염기쌍의 DNA 단편을 생성하는 것이 필요하다. 조각의 크기 선택은 조사에서 염색질 도메인의 종류에 따라 다릅니다.
   2. 칩 보육 버퍼에 1 시간의 최소 65 ° C에서 배양 가교 역, 전체 입력의 2 %를 가져 가라. , PCR 정제 키트에 의해 DNA를 추출 50 μL TE 버퍼에 용출 및 염색질 조각을 확인하는 아가로 오스 겔에서 DNA를로드합니다.
4. 항체와 염색질의 배양
   1. 초음파 염색질 10 % 트리톤 X-100 1 / 10 볼륨을 추가합니다. 펠렛 4 ° C에서 10 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기 드BRIS.
   2. 라는 세포에서 SILAC 아미노산의 결합 수준을 테스트하기 위해 단백질 프로파일 링 무거운 세포에서 염색질 입력 50 μl를 저장합니다.
   3. 나머지 무겁고 가벼운 표시 초음파 염색질의 선택의 항체를 추가하고 회전하는 바퀴에 4 ° C에서 밤새 품어. 광 채널에서, 또한 수용성 펩티드의 과잉 배를 추가합니다. 회전하는 바퀴에 4 ° C에서 밤새 품어 주 :. 2.5.3에서 논의 항체의 μg과 세포의 원료 사이의 최적의 조건은, 케이스에 케이스를 선택한다. 항체와 관련있는 수용성 펩타이드의 최적 초과 배의 몰 농도는 조심스럽게 케이스에 케이스를 적정해야합니다.
5. 자석 구슬을 사용하여 염색질의 분리
   1. 평형 및 2.6에 기술 된 절차에 따라 칩 인큐베이션 완충액을 사용하여 G-단백질 결합 된 자성 비드를 차단.
   2. 차단 B 100 μl를 추가합니다염색질 샘플 및 4 ℃에서 3 시간 동안 회전 바퀴에 품어 EADS 팁의 뚜껑에서 샘플을 스핀 다운 1 분 340 XG에 원심 분리기. 구슬을 펠렛 자기 랙에 넣습니다. 상등액 바운드 뉴 클레오 함유 (FT)를 통해 흐름이다. 세척이 증가하고 염 농도 (두 개의 150 ㎜로 세척 및 300 mM의 NaCl을 두)와 버퍼 (표 1) 세척 4 회를 구슬로 장식한다.
   3. 용출 및 탈 가교 면역 침강 단백질에 모두 95 ° C에서 30 μL SDS-PAGE 로딩 샘플 버퍼 (표 1)에서 25 분 동안 구슬을 품어. 분리 된 단백질 4-12% 비스 - 트리스 아크릴 아미드 SDS-PAGE 사전 캐스트 젤 (그림 3D)에 대한 것입니다.

이전에 MS에 4. 샘플 준비

1. 인 - 젤 N-칩에서 풍부한 히스톤의 소화
   참고 : 단백질 소화와 펩타이드 추출 단계를 돌봐 동안이전 ^{(22), (23)을} 한 바와 같이, LC-MS/MS 방해 각질 오염을 최소화.
   1. 컷 젤 슬라이스 핵심 히스톤 밴드 (그림 1D)에 해당. 젤을 축소하는 100 % ACN과 교류, DDH ₂ O의 50 % 아세토 니트릴 (ACN)와 젤 조각을 드 얼룩. 젤 조각이 완전히 해제 스테인드 될 때까지 반복하여 진공 원심 분리기를 건조.
   2. D ₆ - 아세트산을 추가 무수 1시 9분 (V / V) 1 M 중탄산 암모늄의 (NH ₄ HCO ₃₎ (일반적으로 최종 부피가 60 ~ 100 ㎕의 경우) 및 촉매 등 3 μL 아세트산 나트륨 (CH ₃ COONa를). 강한 흔들림 37 ° C에서 3 시간 동안 품어 주 :. 샘플은 반응의 조립 후 첫 번째 분의 거품을 생성 할 수 있습니다 : 그것은 중요한주의 처리하고 발생하는 가스, 수시로 개방 튜브를 해제 배양시.
   3. 여러 번 승 젤 조각을 씻어i 번째 NH ₄ HCO _3, 완전 _D-6 아세트산 무수물 잔기를 해소하기 위해 증가 백분율 (50 %부터 100 %까지)에서 ACN으로 대체.
   4. 100 % ACN에서 젤 조각을 축소; 완전한 드 수분을 보장하기 위해 진공 원심 분리기를 건조. 중수 소화 무수 초산과 트립신 소화를 이용하여 라이신의 화학적 변형의 조합을 생성하는 "아르 게 : 얼음처럼 차가운 100 NG / 50mM의 NH ₄ HCO ₃ 트립신 솔루션 μL와 37 ° C. 주에서 밤새 품어로 다시 수화 젤 조각 히스톤 ^{21, 24의} 젤 소화 패턴에 "C 언어.
   5. 여분의 용액을 버리고 완전히 젤 조각을 커버하는 50 mM NH ₄ HCO _3의 볼륨을 추가; 37 ℃에서 하룻밤 배양
   6. 새로운 에펜 도르프 튜브에 용해 소화 펩티드를 수집합니다. 펩티드를 냉동 건조. 0.5 % 아세트산 acid/0.1 %의 트리 플루오로 아세트산 (TFA)에 그들에 resuspend. 탈염 및 농축역상 손으로 만든 마이크로 컬럼에 C ₁₈ / 탄소 "샌드위치"와 이온 교환 크로마토 그래피 (SCX) (StageTip) ²⁵ 펩티드.
   7. 200 ㎕의 팁에 고정 C ₁₈ / 탄소 ( "샌드위치")와 SCX 비즈를 포함하는 테플론 섬유주 디스크를 넣어 StageTip 마이크로 컬럼을 준비합니다. 탄소 필터와 함께로드 두 번째 팁의 상단에 C ₁₈ 마이크로 칼럼을로드하여 "샌드위치"를 얻 참고 :. C ₍₁₈₎ 필터에 유지되지 않습니다 매우 짧은 펩티드를 직접에로드 된 흐름을 통해 전달 일반적으로 비디오를 캡처 탄소 팁. SCX의 StageTips은 H3와 같은 특정 펩타이드를 효율적으로 역상 크로마토 그래피로 유지되지 않습니다 (3-8) 펩타이드를 풍부하게 할 수 있습니다.
   8. SCX StageTips 상 C ₁₈ / 탄소 "샌드위치 StageTip"50 % 상에로드 펩티드의 50 %. 80 % ACN/0.5 %의 초산 교류를 사용하여 C ₁₈ / 탄소 끝에서 그들을 용출ID 및 5 % 수산화 암모늄으로 SCX 팁 (NH ₄ OH) / 30 % 메탄올에서. 0.1 % FA의 동결 건조에 resuspend 펩티드 후 LC-MS/MS로 분석 할 수 있습니다.
2. immunopurified 단백질에서 젤 소화
   단백질 중 겔 소화는 사소한 수정으로, 상술 한 바와 같이 ²² 행한다.
   1. 열 조각 (그림 3D)의 각 레인 1 내지 ³ mm의 작은 큐브의 각 조각을 잘라. 50 mM의 NH ₄ HCO _{50분의 3} % 에탄올 겔 조각을 드 얼룩과 젤을 축소 무수 에탄올을 추가합니다. 젤이 완전히 드 스테인드 때까지 반복합니다.
   2. 어둠 속에서 실온에서 45 분 동안 알킬화 완충액 (표 1)을 첨가하여 56 ° C에서 1 시간 용 젤 조각에 환원 완충액 (표 1)을 추가한다. 진공 원심 분리기에 젤 조각을 세척하고 건조.
   3. 얼음처럼 차가운 12.5 NG / μL 트립신 졸 겔 조각을 재수50 mM의 NH ₄ HCO _3의 ution 겔 조각의 완전 재수까지 얼음에 품어. 초과 트립신을 제거합니다.
   4. 완전히 젤 조각을 커버하는 50 mM NH ₄ HCO _3을 추가합니다. 37 ℃에서 하룻밤 배양한다
   5. 액체 부분을 수집합니다. 겔 조각으로 추출 완충액 (표 1)을 추가; 실온에서 10 분간 강하게 교반하면서 배양한다. 두 번 반복합니다.
   6. 강한 교반과 함께 10 분 동안 ACN에서 젤 조각을 품어. 두 번 반복하고 모든 상층 액을 풀.
   7. 펩티드를 냉동 건조. 0.5 % 아세트산 acid/0.1 %의 TFA에서 건조 펩티드를 Resuspend.
   8. 탈염 및 ^{(26, 27)을} 한 바와 같이, 역상 C ₁₈ StageTip에 펩티드를 집중한다.
   9. 80 % ACN/0.5 %의 아세트산을 사용하여 C ₁₈ StageTip로부터 펩타이드를 용출한다. 진공 원심 분리기에 증발시켜 유기 용매를 제거하고 0.1 % FA (일반적으로 5 ~ 10 &에 펩티드를 재현 탁# 181, L), 때 MS 분석 주시기 바랍니다.

5. LC-MS 분석

1. 액체 크로마토 그래피 분석
   1. 를 사용하여 일정한 헬륨 압력 (50 줄)의 역상을 (RP) C _(18), 메탄올 3 μm의 수지를 사용하여, 15cm 용융 실리카 이미 터 (75 μm의 내경, 350 μm의 외경)의 분석 컬럼 팩 폭탄 로더 장치, 이전에 설명한 바와 같이 ^28.
   2. 부부는 직접 20 cm 길이 (25 μm의 내경)를 통해 HPLC의 6 포트 밸브의 콘센트에 포장 된 에미 터 (C ₁₈ RP 열) 전 열 또는 분할 장치를 사용하지 않고 실리카를 융합.
   3. 500 NL / 분 이동상 A (DDH 0.1 % FA / 5 % ACN ₂ O)의 흐름에 C ₁₈ RP 열에서 소화 펩티드를 넣습니다.
   4. 샘플을 로딩 한 후, 다음의 구배를 사용하여 펩티드를 분리 :
      1. 0-40% 이동상 B (0.1 % FA/99의 %의 ACN 적용250 NL / 분 DDH ₂ O)에서 히스톤에서 파생 된 펩타이드의 용출에 대한 5 분 이상 10 분 60 - 80 %에서 40 % ~ 60 %의 농도 구배 90 분 (2)를 참조하십시오.
      2. immunopurified 단백질에서 파생 된 펩타이드의 용출에 대한 5 분 이상 10 분 60 - 80 % (3 참조) 36-60%의 기울기에 따라 250 NL / 분 120 분에 0-36% 이동상 B를 적용합니다.
2. LTQ-FT-ICR-울트라 질량 분석기를 사용하여 질량 분석 분석
   1. 자동으로 MS와 MSMS 수집 사이를 전환 할 수있는 데이터에 의존하는 수집 (DDA) 모드에서 작동합니다. MS 전체 검색 스펙트럼이 200-1,650에서 일반적으로 M / Z의 범위, 취득, 400m / Z에서 해상도 R = 10 만에 취득. 오 (top5에) 가장 강렬한 이온은 5000의 목표 값에 충돌 유발 분해 (CID)를 사용하여 선형 이온 트랩에서 조각에 격리됩니다.
   2. 표 2 FO에 나열된 매개 변수를 사용하여R "조정"인수 파일.
   3. 표 2에 나열된 규격 취득 설정을 설정합니다.

6. 데이터 분석

1. 염색질 영역에서의 협력 강화 히스톤 수정 무료 정량화 레이블
   1. 획득 한 RAW 파일은 Raw2msm 소프트웨어 (버전 1.10) ^29를 사용하여 MGF 파일을 변환합니다.
   2. 표 3에 기재된 파라미터를 설정, 마스코트 Deamon를 (버전 2.2.2)를 사용하여 히스톤 수정 검색.
   3. 마스코트 출력 펩타이드 목록에서 15보다 낮은 점수 또는 5 개 이상 추정 PTMS ⁽²⁹⁾ 펩티드를 제거 참고 :. 각각의 단일 펩타이드 ID의 경우, 가장 높은 마스코트 점수 펩타이드를 선택하고 같은 ID를 가진 다른 모든 중복 펩티드를 필터링 .
   4. BAS, 모든 수정 된 펩타이드에 해당하는 각각의 전구체의 추출 이온 크로마토 그램 (XIC)를 구축QualBrowser을 사용하여 M / Z 값에 ED. 각 피크 (그림 2A)의 곡선 (AUC)에서 지역을 계산합니다.
   5. QualBrowser (그림 2B)를 사용하여 MS / MS 스펙트럼의 육안 검사에 의해 수정을 포함하는 각각의 식별 된 펩티드의 유효성을 검사합니다.
   6. 수정 된 각 펩타이드의 상대적인 풍요 로움을 계산합니다. 칩 혼성 재료의 각 변형의 상대적인 농축을 계산합니다 :. 상대 풍부 동일한 펩타이드의 모든 수정과 수정되지 않은 형태의 AUC의 합을 통해 각각의 특정 변형 된 펩타이드의 AUC의 비율로 계산되는 반면, 상대적으로 입력 (도 2c)을 통해 칩의 특정 변형의 상대적인 풍부함의 비율로 농축.
2. 단백질의 정량 프로테오믹스 분석 염색질 도메인 내에서 공동으로 관련
   1. 단백질 식별 및 정량화 MaxQuant 패키지를 사용(http://www. maxquant.org /) ^30. AndromedaConfig.exe ^(31)를 사용하여 기본 검색 엔진 "안드로메다"를 구성하고 표 3에 검색 매개 변수를 설정합니다.
3. 설립 테스트
   1. 다음과 같이, MaxQuant 소프트웨어를 사용하여, 헤비 - 표지 염색질 입력 내의 단백질로 헤비 아미노산의 혼입 정도를 개산 :
      1. 6.2에서 설명하지만, 다시 양을 옵션을 비활성화로 매개 변수를 설정합니다.
      2. 법인의 비 중복 펩타이드 비율로 다음과 같은 공식을 적용하는 비율을 계산한다. 법인 (%) = 비 (H / L) / 비 (H / L) + 1 × 100 (그림 3B)를 참고 : 동의하는 경우에만 설립> 95 %.

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결과

크로 마틴 면역 게놈 따라 단백질이나 히스톤 변형의 현지화를 프로파일 링하는 데 사용하는 강력한 기술이다. 프로테오믹스 동등한에서, 칩, 관심의 수정이나 단백질과 함께 면역 침강 "미끼"로 사용되는 정 성적 및 정량적으로 hPTMs, 히스톤 변형 및 염색질 결합 단백질을 식별하는 MS 기반 프로테오믹스옵니다. N-ChroP 접근 방식에서, 염색질이 MNase (그림 1B)로 분해되는 ?...

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토론

우리는 최근 ChroP, 염색질의 단백질 성분의 대규모 특성화 양적 전략을 설명 하였다. ChroP는 성적인 분야에서 사용되는 두 개의 보완적인 접근 방식, 칩과 MS, 자신의 강점에서 이익과 각각의 한계를 극복을 결합한다. 깊은 시퀀싱 (칩 - 시퀀서)에 결합 된 칩은 몇 가지 뉴 클레오 솜 ^(35)의 해상도에서 히스톤 수정의 게놈 전체의 매핑을 할 수 있습니다. 자신의 감성에 유리하지만, 항체 기반?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Lonza	BE12-614F
FBS	Invitrogen	10270-106
SILAC DMEM	M-Medical	FA30E15086
Dialyzed FBS	Invitrogen	26400-044
Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine)	Sigma Aldrich	L8662
Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine)	Sigma Aldrich	A6969
Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine)	Sigma Aldrich	68041
Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine)	Sigma Aldrich	608033
Micrococcal Nuclease	Roche	10 107 921 001
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 132 001
Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length	Spectrumlabs	132720
QIAquick PCR purification kit	QIAGEN	28104
Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade	Abcam	ab8898
Histone H3 peptide tri-methyl K9	Abcam	ab1773
Dynabeads Protein G	Invitrogen	100.04D
NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0335BOX
Colloidal Blue Staining Kit	Invitrogen	LC6025
LDS Sample Buffer	Invitrogen	NP0007
Formaldheyde	Sigma Aldrich	F8775
Aceti anhydride-d6	Sigma Aldrich	175641-1G
[header]
Formic Acid	Sigma Aldrich	94318-50ML-F
Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline	Sigma Aldrich	I6125
DL-Dithiothreitol	Sigma Aldrich	43815
Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg)	Promega	V5113
Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5	Microcolumn Srl	FS360-75-8-N-5-C15
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% C	Dr. Maisch GmbH	r13.aq.
Carbon extraction disk, 47 mm	Agilent Technologies	12145040
Cation extraction disk	Agilent Technologies	66889-U