A Abordagem ChroP Combina chip e Espectrometria de Massa dissecar proteômica Paisagens Locus específicas da cromatina

Resumo

Ao combinar nativa e reticulação da cromatina imunoprecipitação com alta resolução de Espectrometria de Massa, ChroP abordagem permite a dissecar a arquitectura proteómica composto de histonas modificações, variantes e proteínas não-histonic sinergia na cromatina domínios funcionalmente distintos.

Resumo

Cromatina é um complexo de nucleoproteína altamente dinâmico feitos de DNA e proteínas que controla vários processos dependentes de DNA. A estrutura da cromatina e a função em regiões específicas é regulada pelo local de enriquecimento de histonas modificações pós-tradução (hPTMs) e variantes, proteínas de ligação da cromatina, incluindo factores de transcrição, e a metilação do DNA. A caracterização proteômica da composição da cromatina em regiões funcionais distintas até agora tem sido dificultada pela falta de protocolos eficientes para enriquecer tais domínios na pureza e quantidade adequada para a posterior análise em profundidade por Espectrometria de Massa (MS). Descrevemos aqui uma estratégia proteômica cromatina recém-concebido, chamado ChroP (Chro roteomics matin P), em que a cromatina imunoprecipitação preparativa é usado para isolar regiões de cromatina distintas cujas características, em termos de hPTMs, variantes e co-associados proteínas não histonic, são analisado através de EM. Nós ilustramos elere a criação de ChroP para o enriquecimento e análise das regiões heterocromáticas transcricionalmente silenciosos, marcado pela presença de tri-metilação da lisina 9 na histona H3. Os resultados obtidos demonstram que o potencial de ChroP no completamente caracterizar o proteoma heterocromatina e provar como uma estratégia de análise poderoso para a compreensão de como os determinantes de proteínas distintas da cromatina interagir e sinergizam para estabelecer configurações estruturais e funcionais específicas para um local.

Introdução

Cromatina é um complexo de nucleoproteína altamente dinâmico, que está envolvido como modelo principal para todos os processos mediados por ADN. O nucleossoma é a unidade básica repetida de cromatina e consiste de um núcleo octamérico proteico contendo duas moléculas de cada histona H2A canónica, H2B, H3 e H4, em torno dos quais 147 pb de ADN são enrolados ^1,2. Todas as histonas centrais são estruturados como um domínio globular e uma "cauda" N-terminal flexível que se projeta fora do nucleossomo. Um dos principais mecanismos de regulação da estrutura da cromatina e dinâmica é baseado no covalentes modificações pós-traducionais (PTMs), que ocorrem principalmente no terminal N das histonas ^3,4. Modificações de histonas pode funcionar tanto alterando a estrutura de ordem mais elevada da cromatina, alterando os contactos entre as histonas-ADN ou entre nucleossomas, e, assim, controlar a acessibilidade de proteínas de ligação de ADN (mecanismos cis), ou actuando como dockinsites de g para proteínas reguladoras, seja como unidades individuais ou incorporados em complexos multiméricas. Tais proteínas reguladoras podem exercer a sua função de diferentes maneiras: por modulando directamente a expressão do gene (ou seja, proteínas TAF), ou através da alteração do posicionamento nucleossoma (isto é, a remodelação da cromatina complexos) ou por modificação de outros resíduos de histonas (isto é, proteínas com metil-transferase, ou acetil- atividade transferase) (mecanismos de trans) ^5. A observação de que o aglomerado distinto padrões PTM cromatina em loci específicos conduziu à elaboração da hipótese de que diferentes modificações em locais distintos podem sinergizar a gerar um código molecular mediando o estado funcional do DNA subjacente. A "hipótese código de histonas" ganhou amplo consenso nos próximos anos, mas a sua verificação experimental foi retido por limitações técnicas ^6,7.

Proteoma com base em espectrometria de massa (MS) tem emergido como umpoderosa ferramenta para mapear padrões de modificação de histonas e caracterizar proteínas de ligação da cromatina ^8. MS detecta uma alteração como uma Δmass específica entre a massa experimental e teórica de um péptido. Ao nível das histonas individuais, MS fornece um método imparcial e abrangente para mapear PTMs, permitindo a detecção de novas modificações e interplays reveladoras entre eles ^9-14.

Nos últimos anos, um número de estratégias têm sido desenvolvidas para dissecar a composição proteoma da cromatina, incluindo a caracterização de cromossomas mitóticos intactos ^15, a identificação de proteínas de ligação solúveis hPTM ^16-18 e o isolamento e a análise das regiões de cromatina específicos (isto é, telômeros) ^19,20. No entanto, a investigação das sinergias específicas para um local entre PTMs de histonas, variantes e proteínas associadas à cromatina ainda está incompleta. Aqui, descrevemos uma nova abordagem, denominada ChroP (Chro roteomics matin P) ^21, que temos desenvolvido para caracterizar de forma eficiente domínios de cromatina funcionalmente distintas. Esta abordagem adapta imunoprecipitação da cromatina (ChIP), um protocolo bem estabelecida utilizada na investigação epigenética, para a análise do proteoma com base no MS eficiente da amostra enriquecida. Nós desenvolvemos dois protocolos diferentes, dependendo do tipo de cromatina usado como entrada e a pergunta dirigida por MS; em particular: 1) CHIP da cromatina nativa unfixed digerido com MNase é empregado para purificar mono-nucleossomos e dissecar os hPTMs co-associando (N-ChroP); 2) ChIP de cromatina reticulado fragmentadas por sonicação é usado em combinação com uma estratégia baseada no interactomics SILAC caracterizar todos cromatina co-enriquecendo proteínas (X-ChroP) de ligação. Nós ilustramos aqui a combinação de N-e X-ChroP para enriquecer e estudando heterochromatin, usando H3K9me3 como isca para as etapas de imunoprecipitação. O uso de ChroP pode ser estendidoestudar tanto regiões distintas sobre cromatina, ou alterações na composição da cromatina dentro da mesma região durante a transição para um estado funcional diferente, abrindo assim o caminho para diversas aplicações em epigenética.

Protocolo

1. Cultura celular

1. Médio padrão para Chip nativa
   1. Crescer as células HeLa em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de glutamina, 1% de Pen / Strep e 10 mM de HEPES pH 7,5.
2. Rotulagem SILAC para reticulação CHIP
   1. Crescer as células HeLa em meio DMEM, SILAC empobrecido de lisina e arginina, suplementado com 10% de FBS dialisado, glutamina a 1%, 1% de Pen / Strep, 10 mM de HEPES, pH 7,5 e, ou a luz L-lisina (Lys 0) e L- arginina (Arg 0) ou os seus homólogos pesados, L-lisina (Lys 8) e L-arginina (Arg 10) (Tabela Materiais), nas concentrações finais de 73 mg / L e 42 mg / L, respectivamente.
   2. Cultivar células para até oito gerações em meio SILAC para garantir ácidos aminados completos com código de incorporação de isótopos. Passa células a cada dois dias, quando atingem uma densidade de 1,0-1,5 x 10 ⁶ células / ml, semeando-a aconcentration de 3 x 10 ⁵ células / ml.
   3. Avaliar as células de crescimento e a viabilidade em meio SILAC individualizar qualquer alteração a partir de fisiologia que pode resultar a partir da composição mais pobre do meio SILAC; para fazer isso:
      1. Inspecione visualmente células morfologia ao microscópio todos os dias durante a marcação.
      2. Contagem de células e curvas de crescimento trama de células que crescem em SILAC contra médio padrão.

2. Native imunoprecipitação da cromatina (N-chip)

1. Preparação Núcleos de células cultivadas
   1. Use 1-2 x 10 ⁸ células não marcadas HeLaS3 por experimento. Células colheita, fazem parte alíquota de 50 x 10 ^{6 de} células em tubos de 50 ml e centrifugar a 340 xg durante 10 min a 4 ° C, lavá-las com PBS gelado.
   2. Ressuspender a cada sedimento de células em 8 ml de tampão de lise (Tabela 1) e incubar durante 10 min a 4 ° C sobre uma roda rotativa. Despeje carefully cada lisado celular sobre uma almofada de sacarose (Tabela 1) e de centrifugação num rotor basculante para fora, a 3.270 x g durante 20 min a 4 ° C, para separar os núcleos a partir do citoplasma.
   3. Descarte sobrenadante, mantenha pelotas nucleares e lavá-los duas vezes em PBS gelado por centrifugação, elimine o sobrenadante em cada lavagem.
2. Micrococo Nuclease (MNase) digestão (pequena escala) e controle de qualidade da cromatina após a digestão
   1. Ressuspender o sedimento nuclear lavadas em 1 ml de tampão de digestão (Tabela 1); dividir em duas alíquotas de 500 ul e manter em gelo.
   2. Medir a densidade óptica (DO) a 260 nm de uma alíquota, diluiu-se 1:200 em 0,2% de dodecil sulfato de sódio (SDS) Nota:. OD = 1 corresponde a cerca de 50 ug / ml de ADN de cromatina. Tipicamente, a partir de 2 x 10 ⁸ células, o OD está no intervalo de 40-60.
   3. Tomar 1% de núcleos, adicionar enzima MNase para uma concentração final de 0.005 U de enzima / mL de núcleos e incubar a 37 ° C durante lapsos de tempo diferentes (0, 10, 20, 40, 60 min).
   4. Em cada ponto de tempo, recolhe 4 ul de núcleos digeridos e adicionar EDTA a 1 mM, para parar a reacção MNase. Mantenha no gelo.
   5. Extrair amostras de DNA por kit de purificação PCR e elui-las em 50 ul de tampão TE (Tabela 1).
   6. Tomar 20 ul de cada amostra de DNA, adicionar 10 ul de tampão de carregar (Tabela 1) e carregar as amostras com 1% (w / v) de gel de agarose contendo brometo de etídio, com o marcador de PCR tal como um controlo de tamanho.
   7. Verifique a digestão avaliar a escada nucleossoma cromatina produzido por MNase incubação.
   8. Escolher o momento óptimo para a digestão, com base na prevalência de mono-nucleossomas na preparação. . Tipicamente para 0.005 U de enzima / mL de núcleos de o tempo óptimo de digestão MNase é 60 minutos (Figura 1B, painel esquerdo) Nota: O MNase óptima concentração / tempo de digestino pode ser ajustada dependendo do tipo de célula desejado e do tamanho de nucleossomas estiramento.
3. Digestão e recuperação de frações de cromatina solúveis Large-scale/preparative MNase
   1. Adicionar a cada alíquota (ver 2.2.1) 5 ul MNase, correspondente a uma concentração final de 0,005 U de enzima / mL de núcleos; misturar gentilmente e incubar a 37 ° C durante 60 minutos (ou, em geral, para o intervalo de tempo optimizado, com base no teste em pequena escala).
   2. Adicionar EDTA 1 mM para parar a reacção e manter em gelo. Sedimentar os núcleos digeridos por centrifugação a 7800 xg, a 4 ° C durante 10 min. Transfira os sobrenadantes (fracção S1) em um novo tubo e armazenar a 4 ° C. Nota: S1 contém a primeira fracção solúvel de cromatina, compreendendo mono-nucleossomas. Adicionar os inibidores da protease (Tabela 1).
   3. Pelotas ressuspender cuidadosamente em 1 ml de tampão de diálise (Tabela 1) e diálise durante a noite a 4 ° C (cut fora do tubo de diálise é de 3,5 kDa), em 3 L Diálise Buffer, com agitação leve constante. Recolher o material dialisado e centrifugar a 7800 x g durante 10 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante (fracção S2) em um novo tubo Eppendorf e armazenar a 4 ° C. Nota: S2 compreende di-EPTA-nucleossomas, dependendo do grau de digestão MNase.
4. Controle de Qualidade da cromatina antes de imunoprecipitação
   1. Tomar uma aliquota correspondente a 5 ng de S1 e S2 fracções de cromatina (quantificado através da medição da densidade óptica a 260 nm em um sistema NanoDrop). Extrair DNA por kit de purificação PCR e eluir em 50 ul de tampão TE (Tabela 1).
   2. Tomar 20 ul de S1 e S2 de ADN, misturar com 10 mL carregando Buffer (Quadro 1) e carregá-los em 1% (w / v) em gel de agarose. Verifique a qualidade e eficiência da digestão MNase por inspeção visual da escada nucleossomos Nota:. Fração S1 é altamenteenriquecida em mono nucleossomos, enquanto fração S2 contém principalmente poli-nucleossomos (Figura 1B, do painel à direita).
5. A incubação com anticorpo de cromatina
   1. Armazenar a -20 ° C 50 ul da fração S1 para posterior análise Espectrometria de Massa.
   2. Adicionar 1 volume de ChIP tampão de diluição (Tabela 1) a fracção de S1.
   3. Adicionar o anticorpo contra o hPTM (ou proteína) de interesse; incubar durante a noite sobre uma roda rotativa, a 4 ° C. Nota: Tipicamente, utilizar 10 ug a 20 ug de anticorpo por 2 x 10 ⁸ células. A relação óptima entre a quantidade de anticorpo e o número inicial de células deve ser cuidadosamente definido caso a caso, dependendo da abundância do hPTM / proteína usada como isco dentro da amostra e para a eficácia do anticorpo. Optimização é experimental, com base nos ensaios seguintes:
      1. Compare a quantidade de hPTM / proteína de interesse entre a entrada ea flow-through (FT,ver 2.7.2) por Western Blot ou MS para verificar que a imunoprecipitação enriquece uma proporção significativa da cromatina região específica Nota:. Isto é geralmente conseguido quando pelo menos 50% do isco hPTM / proteína é esgotada no FT (Figura 1C) .
      2. Verificar que a proteína de interesse é imunoprecipitada detectável em gel de SDS-PAGE, o que garante que uma quantidade suficiente de material está disponível para a análise MS Nota:. A presença no gel das bandas correspondentes aos quatro histonas centrais na estequiometria correcta indica que o nucleossoma intacto foi imunoprecipitada por N-ChroP (Figura 1D). Falta de estequiometria adequada é de fato indicativo de uma ruptura parcial / desdobramento do nucleossomo.
   4. Em paralelo, preparar as acoplados à proteína-G esferas magnéticas (ver 2.6).
6. A equilibração e bloqueio acoplados à proteína G-esferas magnéticas
   1. Equilibrar 100 ul de proteína G-esferas magnéticas acopladas empastar em Solução de Bloqueio (Tabela 1), lavagem três vezes e incubando-os durante a noite a 4 ° C, numa roda rotativa Nota:. Seguindo a capacidade de ligação de grânulos, uso de 100 ul de suspensão durante 2-20 ug de anticorpo.
   2. Lave as contas bloqueadas, uma vez com solução de bloqueio e, em seguida, duas vezes com Tampão de Diluição ChIP (Tabela 1).
7. Isolamento de cromatina utilizando contas magnéticas
   1. Adicionar 100 ul de contas bloqueadas para a amostra cromatina S1 e incubar sobre uma roda rotativa, a 4 ° C durante 3 hr. Centrifugar a 340 xg por 1 min para girar a amostra da tampa das dicas. Coloque em um rack magnético para agregar as contas.
   2. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de Eppendorf. Este é o fluxo através da (FT), ou seja, a fracção da cromatina que não se ligou ao anticorpo.
   3. Lavar as pérolas quatrovezes em Tampão de Lavagem (Tabela 1), aumentando a concentração de sal em cada lavagem (75, 125 e 175 mM de NaCl).
   4. Para eluir a cromatina imunoprecipitada, incubar as pérolas em 30 ul de tampão de amostra LDS, suplementadas com 50 mM de ditiotreitol (DTT) durante 5 min a 70 ° C. Separam-se as proteínas eluídas em 4-12% Bis-Tris acrilamida SDS-PAGE pré-fundido em gel com gradiente e mancha do gel com o kit de coloração de Coomassie coloidal (Figura 1D).

3. Reticulação imunoprecipitação da cromatina (X-chip)

1. A reticulação das células com formaldeído
   1. Adicionar 0,75% de formaldeído para células marcadas com SILAC, misturar brevemente e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. Extingue-se o formaldeído por adição de glicina 125 mM e incuba-se durante 5 minutos à temperatura ambiente.
   2. Dividir as células em 5 x 10 ⁷ alíquotas; lavar três vezes com PBS gelado por centrifugação a 430xg por 5 min a 4 ° C e descartando o sobrenadante depois de cada lavagem. Na última lavagem, elimine o sobrenadante e manter o sedimento. Observação: Uma vez que as células são reticuladas, elas podem ser armazenadas à temperatura de -80 ° C, se não for usado imediatamente.
2. Preparação Núcleos
   1. Ressuspender a cada sedimento celular em 10 ml de tampão de lise (Tabela 1). Incubar durante 10 min a 4 ° C com rotação. Centrifugar a 430 xg durante 5 min a 4 ° C. Rejeitar o sobrenadante; manter peletes nucleares.
   2. Ressuspender a cada pelete nuclear em 10 ml de tampão de lavagem (Tabela 1). Incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos numa roda rotativa.
   3. Centrifugar a 430 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e recolher os sedimentos.
   4. Ressuspender cada peletes nucleares em 3 ml de Tampão de Incubação ChIP (Tabela 1). Mantenha no gelo.
3. Sonicação cromatina e controle de qualidade
   1. Sonicate ch. romatin a 200 W (ciclos de 30 segundos "on" e 1 min "off"), em um Bioruptor arrefecido, para fragmentar cromatina Nota: o número de ciclos de sonicação e intervalos depende do tipo de célula e da duração média das nucleossomal esticar desejado. Tipicamente, 30 minutos de sonicação são necessários para gerar fragmentos de ADN de 300-500 pb de comprimento, correspondendo a tri-nucleossomas di-e. A escolha do tamanho de fragmentos depende do tipo de domínio cromatina sob investigação.
   2. Tome 2% da quantidade total, reverter a reticulação por incubação a 65 ° C durante um mínimo de 1 hora em ChIP Tampão de Incubação. Extrair o ADN por kit de purificação de PCR, eluir em 50 ul de tampão TE e carregar o DNA em gel de agarose para verificar a fragmentação da cromatina.
4. A incubação com anticorpo de cromatina
   1. Adicionar 1/10 volume de 10% de Triton X-100 a cromatina sonicado. Centrifugar a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar debris.
   2. Economize 50 l de entrada a partir de células da cromatina pesados ​​para testar o nível de incorporação de aminoácidos SILAC em células marcadas e para criação de perfis de proteínas.
   3. Adicionar o anticorpo de escolha para a cromatina pesada e leve restante marcado sonicada e incubar durante a noite a 4 ° C sobre a roda de rotação. No canal de luz, adicionar também uma dobra em excesso do péptido solúvel. Incubar durante a noite a 4 ° C sobre uma roda rotativa Notas:. A condição ideal entre o ug de anticorpo e o material de partida de células é escolhido caso a caso, conforme discutido em 2.5.3. O excesso de molaridade vezes óptima do péptido solúvel em relação ao anticorpo deve ser cuidadosamente titulada caso a caso.
5. Isolamento de cromatina utilizando contas magnéticas
   1. Equilibrar e bloquear acoplados à proteína-G esferas magnéticas, seguindo os passos descritos em 2.6 e usando o chip Incubação Buffer.
   2. Adicionar 100 ul de bloqueado beads para as amostras de cromatina e incubar numa roda rotativa durante 3 horas a 4 ° C. Centrifugar a 340 xg por 1 min para girar a amostra da tampa das dicas. Coloque em um rack magnético para agregar as contas. O sobrenadante é o fluxo através da (FT), contendo nucleossomas desacoplado. Lavar contas quatro vezes em Tampão de Lavagem (Tabela 1) com o aumento da concentração de sal (duas lavagens a 150 mm e dois de NaCl 300 mM).
   3. Incubar grânulos em 30 ul de SDS-PAGE Carregando Tampão de amostra (Tabela 1) e durante 25 min a 95 ° C para ambos eluir e des-de reticulação das proteínas imunoprecipitadas. Proteínas separadas em 4-12% Bis-Tris acrilamida SDS-PAGE géis pré-moldados (Figura 3D).

4. Preparação de Amostras Antes MS

1. Em Gel digestão de histonas enriquecidos de N-chip
   Nota: Durante a digestão de proteínas e de extração de peptídeo etapas cuidarpara minimizar as contaminações de queratina que interferem com a LC-MS/MS, como anteriormente descrito ^{22, 23.}
   1. Cortar fatias de gel correspondentes para as histonas centrais bandas (Figura 1D). De-manchar as peças de gel com 50% de acetonitrila (ACN) em DDH ₂ O, alternando-se com 100% de ACN para diminuir o gel. Repita até geles peças são completamente de-coradas e secá-las em uma centrífuga de vácuo.
   2. Adicionar _D-6, anidrido acético 01:09 (v / v) em 1 M de bicarbonato de amónio (NH ₄ HCO ₃₎ (tipicamente o volume final é de 60-100 ul) e 3 ul de acetato de sódio _(CH3 COONa), como catalisador. Incubar durante 3 horas a 37 ° C, com forte agitação Nota:. A amostra pode gerar bolhas nos primeiros minutos após a montagem da reação: é importante para lidar com cautela e liberar o gás gerado, abrindo de vez em quando os tubos durante a incubação.
   3. Lavar os pedaços de gel várias vezes wom NH ₄ HCO _3, alternam com ACN a percentagem crescente (de 50% a 100%), de modo a eliminar completamente os resíduos de _D-6 anidrido acético.
   4. Encolher os pedaços de gel em 100% ACN; secá-las em uma centrífuga de vácuo para garantir a completa de-hidratação. Pedaços de gel re-hidratado com gelado de 100 ng / mL em 50 mM de solução de tripsina de NH ₄ HCO ₃ e incubar durante a noite a 37 ° C. Nota: A combinação de modificação química de lisinas utilizando anidrido acético deuterado e digestão com tripsina gera um "Arg- C, como "em gel padrão de digestão das histonas ^21,24.
   5. Descartar o excesso de solução e adicionar um volume de 50 mM NH ₄ HCO ₃ a cobrir completamente os pedaços de gel; incubar durante a noite a 37 ° C.
   6. Recolhe péptidos digeridos solúveis em um novo tubo de Eppendorf. Liofiliza péptidos. Ressuspender los em 0,5% de ácido acético acid/0.1% de ácido trifluoroacético (TFA). Dessalinizar e concentrarpeptídeos em uma fase reversa C ₁₈ / Carbono "sanduíche" e cromatografia de troca iônica (SCX) em microcolunas feitos à mão (StageTip) ^25.
   7. Prepare os microcolunas StageTip colocando discos meshworks Teflon contendo C imobilizado ₁₈ / Carbono ("sandwich") e contas em SCX de 200 dicas mL. Obter a "sanduíche", de carregar a C ₁₈ Microcoluna no topo de uma segunda ponta de filtro carregado com carbono Nota:. Os péptidos muito curtos, que não são retidos no filtro de C _18, passar o fluxo de passagem, que é carregada directamente na Dica de carbono, que normalmente capta-los. StageTips SCX pode enriquecer péptidos específicos, tais como H3 (3-8) peptídicas, não eficazmente retida por meio de cromatografia de fase inversa.
   8. Carga de 50% de peptídeos para o C ₁₈ / Carbono "StageTip sanduíche" e 50% para SCX StageTips. Eluir-los das pontas C ₁₈ / carbono, utilizando 80% ACN/0.5% ac acéticoID e do Tips SCX com hidróxido de amónio a 5% (NH ₄ OH) / 30% metanol. Depois de peptídeos liofilização, ressuspender em 0,1% FA e analisar por LC-MS/MS.
2. No gel de digestão de proteínas imunopurificados
   No gel de digestão das proteínas é levada a cabo como anteriormente descrito ^22, com pequenas modificações.
   1. Corte cada pista em dez fatias (Figura 3D) e cada fatia em pequenos cubos de 1 milímetro ^3. De-manchar as peças de gel com 50 mM NH ₄ HCO ₃ etanol / 50% e adicionar etanol absoluto a encolher os géis. Repetir até que os géis são completamente de-coradas.
   2. Adicionar tampão de redução (tabela 1) para os pedaços de gel durante 1 hora a 56 ° C, seguido pela adição de tampão de alquilação (Tabela 1) durante 45 minutos à temperatura ambiente, no escuro. Lavar e secar as peças em gel centrífuga de vácuo.
   3. Reidratar os pedaços de gel com gelado de 12,5 ng / mL sol tripsinauição em 50 mM NH ₄ HCO ₃ e incubar em gelo até a reidratação completa dos pedaços do gel. Retirar tripsina em excesso.
   4. Adicionar 50 mM NH ₄ HCO ₃ a cobrir completamente os pedaços de gel. Incubar durante a noite a 37 ° C.
   5. Colete a parte líquida. Adicionar o tampão de extracção (Tabela 1) para os pedaços de gel; incubar com forte agitação durante 10 minutos à temperatura ambiente. Repita duas vezes.
   6. Incubar os pedaços de gel em ACN por 10 min, com forte agitação. Repita duas vezes e reunir todos os sobrenadantes.
   7. Liofilizar os peptídeos. Ressuspender péptidos secos em 0,5% de ácido acético acid/0.1% TFA.
   8. Dessalgar e concentrar péptidos em fase reversa C ₁₈ StageTip, como descrito ^{26, 27.}
   9. Eluir peptídeos a partir do C ₁₈ StageTip usando 80% ACN/0.5% de ácido acético. Remover o solvente orgânico por evaporação numa centrífuga de vácuo e ressuspender os péptidos em 0,1% de FA (tipicamente 5-10 &# 181; l), quando estiver pronto para a análise MS.

5. LC-MS Análise

1. A análise por cromatografia líquida
   1. Encher a coluna analítica em 15 centímetros fundido emissor de sílica (75 um de diâmetro interno, diâmetro externo 350 um), utilizando-se em fase reversa (RP) C _18, 3 mM de resina em metanol, a uma pressão constante de hélio (50 bar), utilizando um dispositivo bomba-loader, como descrito anteriormente ^28.
   2. Par o emissor embalado (coluna C ₁₈ RP) directamente para a saída da válvula de 6 portas de HPLC através de um (25 um de diâmetro interno) de comprimento de 20 cm de sílica fundida, sem o uso de pré-coluna ou dispositivo de divisão.
   3. Carregar os peptídeos digeridos em coluna C ₁₈ RP no fluxo de 500 nl / min, a fase A móvel (0,1% de FA / 5% de ACN em _ddH2O).
   4. Após o carregamento da amostra, separar os péptidos com as seguintes gradientes:
      1. Aplicar 0-40% de fase móvel B (0,1% FA/99% ACNem _ddH2O) em 250 nl / min, mais de 90 min seguido por um gradiente de 40-60% em 10 minutos e 60-80% ao longo de 5 min, por eluição de péptidos derivados a partir de histonas (ver 2).
      2. Aplicar 0-36% de fase móvel B a 250 nl / min durante 120 minutos, seguido de um gradiente de 36-60% em 10 minutos e 60-80% ao longo de 5 min, por eluição de péptidos derivados de proteínas imunopurificada (ver 3).
2. Análise Espectrometria de Massa usando LTQ-FT-ICR-Ultra espectrômetro de massa
   1. Atuar de aquisição dependente do modo de dados (DDA) para alternar automaticamente entre MS e aquisição MSMS. MS espectros de varrimento total são adquiridos, geralmente na faixa de m / z de 200-1,650, é adquirida com a resolução R = 100.000 a 400 m / z. Os cinco (Top5) íons mais intensos são isolados para a fragmentação no ion trap linear usando uma dissociação induzida por colisão (CID), com um valor-alvo de 5.000.
   2. Use os parâmetros listados na Tabela 2 for o arquivo de aquisição "Sintonia".
   3. Defina as configurações de aquisição padrão conforme a lista na tabela 2.

6. Análise de Dados

1. Rotular quantificação livre de modificações de histonas co-enriquecidas em domínios de cromatina
   1. Converta os arquivos brutos adquiridos para arquivos MGF usando software Raw2msm (versão 1.10) ^29.
   2. Procure nas modificações de histonas usando Mascote Deamon (versão 2.2.2), estabelecendo os parâmetros descritos na Tabela 3.
   3. Na lista de peptídeo saída Mascote, remover peptídeos com pontuação inferior a 15 anos ou com mais de 5 PTMs putativos ²⁹ Nota:. Para cada ID único peptídeo, selecione o peptídeo com a maior pontuação da mascote e filtrar todos os outros peptídeos redundantes com o mesmo ID .
   4. Construa os cromatogramas de íons extraídos (XIC) para cada precursor correspondente a cada peptídeos modificados, based sobre o valor de m / z, utilizando o QualBrowser. Calcula-se a área sob a curva (AUC) para cada pico (Figura 2A).
   5. Validar cada peptídeos identificados contendo modificações por inspeção visual dos espectros MS / MS usando o QualBrowser (Figura 2B).
   6. Calcular a abundância relativa de cada péptido modificado. Calcular o enriquecimento relativo de cada modificação no material de aparas-ed Nota:. Abundância relativa é calculado como a razão entre a AUC de cada peptídeo modificado específica sobre a soma de AUC de todas as formas do mesmo péptido modificados e não modificados, enquanto que em relação enriquecimento como a razão entre a abundância relativa de modificação específica no chip através da entrada (Figura 2C).
2. Análise proteômica quantitativa de proteínas co-associado dentro de domínios de cromatina
   1. Para a identificação e quantificação de proteínas de utilizar o pacote MaxQuant(Http://www. Maxquant.org /) ^30. Configure o mecanismo de busca embutido "Andromeda" usando o AndromedaConfig.exe ³¹ e definir os parâmetros de pesquisa listados na Tabela 3.
3. Teste de Incorporação
   1. Estimar o grau de incorporação de aminoácidos em proteínas pesados ​​na entrada da cromatina pesada marcado, utilizando software MaxQuant, como se segue:
      1. Defina os parâmetros conforme descrito no ponto 6.2, mas desabilitar a opção de re-quantificar.
      2. Calcular a percentagem de incorporação de aplicar a seguinte fórmula para proporções de peptídeos não redundantes:. Incorporação (%) = relação (H / L) / proporção (H / L) + 1 × 100 (Figura 3B) Nota: Aceitar apenas se incorporação> 95 %.

Resultados

Imunoprecipitação da cromatina é uma técnica poderosa usada para perfilar a localização de uma proteína ou de uma modificação da histona ao longo do genoma. Em um equivalente proteômica, chip é seguido por proteômica baseados em MS para identificar qualitativa e quantitativamente os hPTMs, variantes de histonas e proteínas de ligação da cromatina que são imuno juntamente com a modificação ou a proteína de interesse, usado como "isca". Na abordagem de N-ChroP, descrito na Figura 1A,

Discussão

Descrevemos recentemente ChroP, uma estratégia para a caracterização quantitativa em grande escala de componentes proteicos de cromatina. ChroP combina duas abordagens complementares utilizados no campo epigenética, chip e MS, lucrar com os seus pontos fortes e superar suas respectivas limitações. CHIP acoplado ao seqüenciamento de profundidade (CHIP-Seq) permite o mapeamento do genoma de modificações de histonas na resolução de alguns nucleossomos ^35. Embora vantajosa para a sua sensibilidade, os ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Lonza	BE12-614F
FBS	Invitrogen	10270-106
SILAC DMEM	M-Medical	FA30E15086
Dialyzed FBS	Invitrogen	26400-044
Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine)	Sigma Aldrich	L8662
Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine)	Sigma Aldrich	A6969
Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine)	Sigma Aldrich	68041
Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine)	Sigma Aldrich	608033
Micrococcal Nuclease	Roche	10 107 921 001
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 132 001
Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length	Spectrumlabs	132720
QIAquick PCR purification kit	QIAGEN	28104
Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade	Abcam	ab8898
Histone H3 peptide tri-methyl K9	Abcam	ab1773
Dynabeads Protein G	Invitrogen	100.04D
NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0335BOX
Colloidal Blue Staining Kit	Invitrogen	LC6025
LDS Sample Buffer	Invitrogen	NP0007
Formaldheyde	Sigma Aldrich	F8775
Aceti anhydride-d6	Sigma Aldrich	175641-1G
[header]
Formic Acid	Sigma Aldrich	94318-50ML-F
Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline	Sigma Aldrich	I6125
DL-Dithiothreitol	Sigma Aldrich	43815
Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg)	Promega	V5113
Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5	Microcolumn Srl	FS360-75-8-N-5-C15
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% C	Dr. Maisch GmbH	r13.aq.
Carbon extraction disk, 47 mm	Agilent Technologies	12145040
Cation extraction disk	Agilent Technologies	66889-U