JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Yerli birleştirerek ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile kromatin imunopresipitasyon çapraz bağlanmasıyla, ChroP yaklaşım histon modifikasyonları, çeşitleri ve fonksiyonel olarak farklı kromatin etki de synergizing olmayan histonic proteinlerin kompozit proteomik mimarisini incelemek için olanak sağlar.

Özet

Kromatin çeşitli DNA-bağımlı işlemlerini denetleyen DNA ve proteinlerden oluşan bir derece dinamik Nukleoprotein karmaşıktır. Belirli bölgelerdeki kromatin yapısı ve fonksiyonu transkripsiyon faktörleri ve DNA da dahil olmak üzere metilasyon histon post-translasyonel modifikasyonlar (hPTMs) ve türevleri, kromatin bağlayıcı proteinler, lokal zenginleşmesi ile düzenlenir. Farklı fonksiyonel bölgelerde kromatin kompozisyon proteomik karakterizasyonu kadar kütle spektrometresi (MS) tarafından daha sonraki derinlemesine analiz için uygun saflıkta ve miktarda bu tür etki zenginleştirmek için verimli protokollerin olmaması engel olmuştur. Biz burada, hazırlayıcı Kromatin immüno-çökeltme, özellikleri, hPTMs açısından, varyantları ve co-ilişkili olmayan proteinler ayrı histonic kromatin bölgeleri izole etmek için kullanılır ve bu arada ChroP (Chro kaska roteomics P) olarak adlandırılan, yeni tasarlanmış kromatin proteomik strateji tarif MS ile analiz edilmiştir. Biz he göstermekhiston H3 lizin 9 arasında tri-metilasyon varlığı ile işaretlenir transkripsiyonel sessiz heterokromatik bölgelerin zenginleştirme ve analizi için ChroP kurulmasına re. Elde edilen sonuçlar iyice heterokromatinin proteomesini karakterize ve kromatin farklı protein belirleyicileri etkileşim ve lokus spesifik yapısal ve işlevsel yapılandırmaları kurmak synergize nasıl anlamak için güçlü analitik strateji olarak bunu kanıtlamak içinde ChroP potansiyelini göstermektedir.

Giriş

Kromatin bütün DNA dolayımlı süreçler için temel şablon olarak dahil olan bir yüksek dinamik bir nükleoprotein karmaşıktır. Nükleozom kromatin temel tekrarlanan birimi olan ve DNA 147 bp 1,2 sarılır etrafında her bir kanonik histon H2A, H2B, H3 ve H4, iki protein molekülü ihtiva eden bir oktamer çekirdek oluşur. Tüm çekirdek histon bir küresel etki ve nükleozom dışında çıkıntı esnek bir N-terminal "kuyruk" olarak yapılandırılmıştır. Kromatin yapısı ve dinamikleri düzenlenmesi için önemli mekanizmalardan biri esas olarak histon 3,4 N-uçlarının üzerinde meydana gelen kovalent bir post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) dayanmaktadır. Histon modifikasyonlar histon-DNA arasında veya nükleozom arasında temas değiştirerek, yüksek dereceli kromatin yapısını değiştirmeden ve böylece DNA-bağlayıcı proteinler (sis mekanizmaları) erişilebilirliğini kontrol edilmesi yoluyla işlev görebilir ya da dockin olarak hareket ederekdüzenleyici proteinler için, ya da tek bir birim ya da multimerik kompleksleri gömülü olarak g siteleri. Bu gibi düzenleyici proteinlerin farklı şekillerde işlev gösterebilir: doğrudan gen ifadesi (örneğin, TAF proteinleri) modüle edilmesiyle, ya da nükleozom konumlandırma (yani kromatin kompleksler yeniden) değiştirerek ya da başka bir histon artıkları (metil-transferaz ya da örneğin proteinler asetil-değiştirerek transferaz aktivitesi) (trans mekanizmaları) 5. Belirli kromatin loci farklı PTM desenler küme farklı sitelerde farklı modifikasyonlar yatan DNA'nın fonksiyonel durumunu aracılık moleküler kodu üretmek için sinerji olabilir hipotezin hazırlanmasına neden olduğunu gözlem. "Histon kodu hipotezi" yıllarda büyük uzlaşma kazanmıştır ancak deneysel doğrulama teknik sınırlamalar 6,7 ile geri düzenlenen olmuştur.

Kütle spektrometrisi (MS) bazlı bir proteomik olarak ortaya çıkmıştırgüçlü bir araç histon modifikasyonu desenleri haritasına ve kromatin-bağlayıcı proteinlerin 8 karakterize etmek. MS bir peptidin deneysel ve kuramsal kütle arasında belirli bir modifikasyonunu Δmass olarak tespit eder. Bireysel histonların seviyesinde, MS bunların 9-14 arasında yeni modifikasyon ve açığa etkileşimlere saptanmasını sağlayan, PTMS eşlemek için bir ilgili ve kapsamlı bir yöntem sağlar.

Son yıllarda, bir dizi strateji sağlam mitotik kromozom 15, çözünür HPTM bağlayıcı proteinlerin 16-18 tanımlanmasında ve özel kromatin bölgelerin izolasyonu ve analiz karakterizasyonu dahil olmak üzere, kromatin proteomik bileşimini incelemek için geliştirilmiştir (örneğin telomer) 19,20. Ancak, histon PTMS, varyantları ve kromatin ile ilişkili proteinler arasındaki lokus spesifik sinerji soruşturma hala tamamlanmadı. Burada, biz (ChroP adında yeni bir yaklaşım, tarifBiz verimli, fonksiyonel olarak farklı kromatin alanları tanımlamak için gelişmiş olduğunu Chro matin P roteomics) 21. Bu yaklaşım, zenginleştirilmiş numunenin etkin MS-tabanlı proteomik analizi için Kromatin immüno-çökeltmesi (çip), epigenetik araştırmalarda kullanılan köklü bir protokol, uyum sağlar. Bu giriş ve MS ile ele alınan sorun olarak kullanılan kromatin türüne bağlı olarak, iki farklı protokol geliştirdik; özellikle: MNase ile sindirilmiş sabitlenmemiş yerli kromatin 1) yonga mono-nükleozom arındırmak ve ko-ilişkilendirme hPTMs (N-ChroP) incelemek için kullanılır; 2) sonikasyon ile parçalanır çapraz bağlantılı kromatin ChIP proteinleri (X-ChroP) bağlayıcı tüm eş zenginleştirmek kromatin karakterize etmek için bir SILAC bazlı interactomics stratejisi ile kombinasyon halinde kullanılır. Biz burada İmmünopresipitasyon adımlar için yem olarak H3K9me3 kullanarak, heterokromatine zenginleştirmek ve eğitim için N-ve X-ChroP kombinasyonunu göstermektedir. ChroP kullanılması uzatılabilirBöylece epigenetik çeşitli uygulamalara önünü, ayrı kromatin bölgeleri, ya da farklı bir işlevsel durumuna geçiş sırasında aynı bölge içinde kromatin bileşimindeki değişiklikleri ya çalışmak için.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1.. Hücre Kültürü

  1. Yerli ChIP için standart ortam
    1. ,% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 1 glutamin,% 1 Pen / Strep ve 10 mM HEPES pH 7.5 ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde HeLa hücreleri büyütün.
  2. ChIP çapraz bağlama için SILAC etiketleme
    1. ,% 10 diyaliz edilmiş FBS,% 1 glutamin,% 1 Pen / Strep, 10 mM HEPES, pH 7.5 ve ışık L-lisin (Lys 0) ve L-ya da takviye lizin ve arginin tükenmiş SILAC DMEM ortamı içinde HeLa hücreleri, büyütün arginin (Arg 0) ya da bunların ağır meslektaşları, L-lisin (Lys 8) ve L-arginin (Arg 10) (Tablo malzemeler), sırasıyla, 73 mg / L ve 42 mg / L arasında nihai konsantrasyonlarda.
    2. Tam izotop kodlu amino asitler dahil edilmesini sağlamak için SILAC ortam içinde sekiz nesiller için hücreleri büyümek. Bu AC onları tohumlama, 1.0-1.5 x 10 6 hücre / ml 'lik bir yoğunluğa ulaştığında, her iki günde bir hücreleri KATKISIoncentration 5 ila 10 x 3 hücre / ml.
    3. SILAC ortamın zayıf bileşiminden neden olabilir fizyoloji herhangi bir olası değişikliğe ayırt etmek için SILAC ortam içinde hücrelerin büyüme ve uygulanabilirliğini değerlendirmek; Bunu yapmak için:
      1. Görme hücreleri etiketleme sırasında her gün mikroskopla Morfoloji inceleyin.
      2. Standart ortamda karşı SILAC içinde gelişen hücrelerin hücreleri ve arsa büyüme eğrileri sayılır.

2.. Native Kromatin Immunoprecipitation (N-Chip)

  1. Kültürlenen hücrelerden alınan çekirdekler hazırlanması
    1. Deneme başına 1-2 x 10 8 etiketsiz HeLaS3 hücreleri kullanır. Hasat hücreler, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 340 x g 'de 50 ml tüpler ve santrifüj içinde 50 x 10 6 hücre bir eş paym hazırlanması buz gibi soğuk PBS ile yıkayın.
    2. 8 ml Lizis Tamponu (Tablo 1) 'de her bir hücre pelletini ve dönen bir tekerlek üzerinde 4 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edilir. Ca dökünrefully her hücre sitoplazmadan çekirdek ayırmak için 4 ° C'de 20 dakika boyunca 3270 x g'de dışarı salınan bir rotor, bir sakroz yastığı (Tablo 1) ve santrifüj lizat.
    3. , Süpernatantlar atın nükleer pelet tutmak ve her yıkamada süpernatant atın, santrifüj ile buz gibi soğuk PBS içinde iki kez yıkayın.
  2. Micrococcal Nükleaz (MNase) sindirim (küçük ölçekli) ve sindirim sonra kromatinin kalite kontrol
    1. 1 ml Sindirim Tamponu (Tablo 1) 'de yıkanmış nükleer pelet yeniden süspanse edin; 500 ul iki bölüm olarak bölmek ve buz üzerinde tutun.
    2. Tümbölenin bir 260 nm'de optik yoğunluk (OD) ölçün,% 0.2 sodyum dodesil sülfat (SDS) içinde 1:200 seyreltilmiş Not:. OD = 1 kromatin DNA yaklaşık 50 ug / ml 'ye karşılık gelir. Tipik olarak, 2 x 10 hücre 8 başlayarak OD 40-60 aralığındadır.
    3. , Çekirdeklerin% 1 alın 0 nihai konsantrasyona MNase enzim ekleyin.005 U enzim / çekirdeklerinin ul ve farklı zaman geçerse (0, 10, 20, 40, 60 dakika) 37 ° C'de inkübe edin.
    4. Her zaman noktasında, sindirilmiş çekirdeklerin 4 ul toplamak ve MNase reaksiyonu durdurmak için 1 mM EDTA ekleyin. Buz üzerinde tutmak.
    5. PCR saflaştırma kiti ile DNA örnekleri ekstrakte edin ve 50 ul TE tamponu (Tablo 1) bunları elüt edilmesi.
    6. , Her bir DNA numunesi 20 ul alın Tamponu (Tablo 1) 10 ul ekle yükleme ve% 1 örnekleri yük (ağırlık / hacim) bir boyut kontrol olarak PCR bir işaretleyici ile Etidyum Bromür içeren agaroz jel.
    7. MNase inkübasyon tarafından üretilen kromatin nucleosome merdiveni değerlendiren sindirim edin.
    8. Hazırlanmasında mono-nükleozomlann yaygınlığı dayalı, sindirim için en uygun zamanı seçin. . Tipik MNase sindirim uygun zaman 60 dakika (Şekil 1B, sol panel) olan çekirdeklerin enzim / ul 0.005 U Not: digesti en uygun MNase konsantrasyon / zamanistenen hücre türüne ve nükleozom gerilme boyutuna bağlı olarak ayarlanabilir.
  3. Large-scale/preparative MNase sindirim ve eriyebilir kromatin fraksiyonlarının geri
    1. Her eş payın ekle çekirdeklerin enzim / ul 0.005 U bir son konsantrasyona tekabül eden, 5 ul MNase (2.2.1); yavaşça karıştırın ve (küçük ölçekli testine göre optimize edilmiş bir zaman aralığı için ya da genel olarak,) 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Reaksiyonu durdurmak ve buz üzerinde tutmak için 1 mM EDTA ekleyin. 10 dakika boyunca 4 ° C'de 7800 x g santrifüjleme ile sindirilmiş çekirdek Pelet. Yeni bir tüp içinde süpernatantlar (fraksiyon S1) aktarın ve 4 ° C Not saklamak: S1 mono-nükleozom içeren kromatin birinci çözünür fraksiyonu içerir. Proteaz inhibitörleri (Tablo 1) ekleyin.
    3. Dikkatlice tekrar süspansiyon 1 ml diyaliz tamponu (Tablo 1) de pelet ve 4 ° C, (c C'da gece boyunca diyalizeDiyaliz tüpün kapalı ut) 3.5 kDa iken, sabit hafif karıştırma ile 3 L Diyaliz Tampon içinde. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 7800 x g'de santrifüj diyaliz edilmiş malzeme ve toplamak Yeni bir Eppendorf tüp süpernatant (S2 fraksiyonu) aktarın ve 4 ° C Not saklamak: S2 içermektedir MNase sindirim derecesine bağlı EPTA-nükleozomlann, di-için.
  4. Immunoprecipitation önce kromatin Kalite Kontrol
    1. (A NanoDrop sisteminde 260 nm'de OD ölçülmesiyle) S1 ve S2 kromatin fraksiyonların 5 ug tekabül eden bir kısım al. PCR saflaştırma kiti ile ekstrakte DNA ve 50 ul TE tamponu (Tablo 1) elute.
    2. S1 ve S2 DNA 20 ul alın Tamponu (Tablo 1) 10 ul yükleme ile karıştırın ve (ağ / hac) agaroz jeli üzerinde% 1 yükleyin. Kalite ve nukleosomlar merdivenin görsel muayene ile MNase sindirim verimliliğini kontrol edin Not:. Kesir S1 yüksek olduğunufraksiyon S2 ağırlıklı poli-nükleozom (Şekil 1B, sağ panel) içermekle birlikte, mono-nükleozom zenginleştirilmiş.
  5. Antikor ile kuluçkalama kromatin
    1. -20 ° C'de daha sonra Kütle Spektrometre analizi için S1 fraksiyonun 50 ul saklayın.
    2. Fraksiyon S1 ChIP Seyreltme Tamponu (Tablo 1) 1 hacim.
    3. Ilgilenilen HPTM (veya protein) karşı antikor ekleyin; 4 ° C Not dönen bir tekerlek üzerinde bir gece boyunca inkübe edilir: Tipik olarak, 2 x 10 8 hücreleri için 10 ug antikor 20 ug için kullanın. Antikor miktarı ve başlangıç ​​hücre sayısı arasındaki en uygun oranı dikkatle numune içindeki yem olarak kullanılan HPTM / protein bolluğu ve antikor verimi ile ilgili olarak, duruma göre ayarlanması gerekir. Optimizasyon aşağıdaki testlere dayanarak, deneysel:
      1. Giriş ve akış-through (FT arasındaki çıkar HPTM / protein miktarını karşılaştırmak,immüno özel kromatin bölgenin önemli bir bölümünü zenginleştiren doğrulamak için Western Blot veya MS ile 2.7.2) bkz Not:. HPTM / protein yem en az% 50, FT (Şekil 1C) olarak tükendiği zaman bu genellikle elde edilir .
      2. Ilgilenilen imüno protein malzemesinin yeterli bir miktarı MS analizi için kullanılabilir olmasını sağlar SDS-PAGE jeli üzerinde tespit edilebilir olup olmadığını kontrol Not:. Doğru stoikiometride dört çekirdek histon karşılık gelen bantların jeli üzerinde varlığı dokunulmamış nükleozom N-ChroP (Şekil 1D) ile immunopresipite edilmiş olduğunu gösterir. Uygun stoikiometrinin eksikliği nükleozom açılımı kısmi bir bozulma / göstergesidir aslında.
    4. Buna paralel olarak, (2.6), protein G-bağlanmış manyetik taneler hazırlamak.
  6. Dengeleme ve protein G-bağlanmış manyetik boncuk bloke
    1. Için bulamacın 100 ul kullanımı, boncuk bağlama kapasitesi şunlardır:. Protein 100 ul dengeye G-bağlanmış manyetik boncuk Çözelti (Tablo 1), üç kez yıkama ve dönen bir tekerlek üzerinde 4 ° C'de gece boyunca kuluçka Not Engelleme çamur antikorun 2-20 ug.
    2. ChIP Seyreltme Tamponu (Tablo 1) ile iki kez daha sonra bloke etme çözeltisi ile bir kez bloke boncuk yıkayın.
  7. Manyetik boncuklar kullanılarak kromatin izolasyonu
    1. S1 kromatin örnek bloke boncuklarının 100 ul ilave edin ve 3 saat boyunca 4 ° C'de dönen bir tekerlek üzerinde inkübe. Ipuçları kapaktan numune aşağı spin 1 dakika boyunca 340 x g'de santrifüj. Boncuk pelet için manyetik bir rafa koyun.
    2. Yeni bir Eppendorf tüpüne süpernatantı aktarın. Bu (FT) boyunca akış, antikora bağlanmayan kromatin yani fraksiyonudur.
    3. Boncuklar dört yıkayınHer yıkamadan (75, 125 ve 175 mM NaCl) ile tuz yoğunluğunu yükselterek Tamponu (Tablo 1) yıkama kez.
    4. Imüno kromatin elüte etmek için, 70 ° C'de 5 dakika boyunca 50 mM ditiyotreitol (DTT) ile desteklenmiş LDS Sample Buffer 30 ul, boncuk inkübe ,% 4-12 Bis-Tris akrilamid SDS-PAGE prekast gradyan jeli üzerinde elüt proteinleri ayırın ve Kolloidal Coomassie boyama kiti (Şekil 1D) ile jel leke.

3.. Çapraz Kromatin Immunoprecipitation (X-Chip)

  1. Formaldehid ile çapraz bağlanması hücrelerin
    1. Kısa bir süre karıştırılır ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir, SILAC etiketli hücreler% 0.75 formaldehit ekleyin. 125 mM glisin eklenerek formaldehit söndürün ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
    2. 5 x 10 7 tümbölenler hücreleri bölmek; 430 'de santrifüj ile onları buz gibi soğuk PBS ile üç kez yıkayın5 4 ° C'de minimum ve her yıkamadan sonra süpernatantlar atılması için xg. Son yıkamadan anda, süpernatant atmak ve pelet tutun. Not: hücreler çapraz bağlanmış kez hemen kullanılmazsa, bunlar, -80 ° C'de saklanabilir.
  2. Çekirdekler hazırlık
    1. 10 ml Lizis Tamponu (Tablo 1) 'de her bir hücre pelletini. Rotasyon ile 4 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 430 x g'de santrifüje Süpernatantlar atın; nükleer pelet tutmak.
    2. Tamponu (Tablo 1) yıkama 10 ml her bir nükleer pelet tekrar. Dönen bir tekerlek üzerinde 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    3. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 430 x g'de santrifüje Süpernatantlar atın ve pelet toplamak.
    4. 3 ml ChIP İnkübasyon tamponu (Tablo 1) 'de her bir nükleer pelet yeniden süspanse edin. Buz üzerinde tutmak.
  3. Kromatin Sonication ve kalite kontrol
    1. Sonicate ch. 200 W, soğutulmuş Bioruptor in ("kapalı" ve 1 dakika "on" 30 saniye döngüleri), kromatin parçalara en romatin Not: döngüleri ve sonikasyon aralıklarının sayısı, hücre türüne ve nükleozomal ortalama uzunluğuna bağlıdır İstenilen germek. Tipik olarak, 30 dakika sonikasyon di-ve tri-nükleozom karşılık gelen uzunluklarda 300-500 bp'lik DNA parçalarını üretmek için gereklidir. Fragmanlar boyutunun seçimi araştırılmaktadır kromatin etki tipine bağlıdır.
    2. ChIP inkübasyon tamponu içinde 1 saat arasında, en az 65 ° C'de inkübasyon yoluyla çapraz bağlanma, ters toplam girişine% 2 al. , PCR saflaştırma kiti ile ekstrakte DNA 50 ul TE tamponu içinde elüte ve parçalanma kromatin kontrol etmek için agaroz jel üzerinde DNA yükleyin.
  4. Antikor ile kuluçkalama kromatin
    1. Sonike kromatin% 10 Triton X-100 içinde 1/10 hacim. Pelet haline getirmek üzere, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12,000 x g'de santrifüjleyin debris.
    2. Etiketli hücrelerde SILAC amino asitlerin dahil edilmesi seviyesinin test etmek için ve protein profil ağır hücrelerden kromatin giriş 50 ul kaydedin.
    3. Kalan ağır ve hafif etiketli sonike kromatin için tercih edilen bir antikor ekleyin ve dönen bir tekerlek üzerinde 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. Işık kanal olarak, aynı zamanda, çözünür peptidin bir kat fazla ekleyin. Dönen bir tekerlek üzerinde 4 ° C'de gece boyunca inkübe Notlar:. 2.5.3 olarak tartışıldığı gibi antikor ug ve hücrelerin başlangıç ​​malzemesi arasındaki en uygun durum, her bir durum seçilir. Antikora ilişkin olarak çözünür peptidin optimum fazla kat molarite dikkatli bir şekilde duruma göre titre edilmelidir.
  5. Manyetik boncuklar kullanılarak kromatin izolasyonu
    1. Dengelenmeye ve 2.6 açıklanan adımları izleyerek ve ChIP Kuluçka Tampon kullanarak protein G-çiftli manyetik boncuk engellemek.
    2. Engellenen b 100 ul ekleyinkromatin örnekler ve 4 ° C'de 3 saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe EADS Ipuçları kapaktan numune aşağı spin 1 dakika boyunca 340 x g'de santrifüj. Boncuk pelet için manyetik bir rafa koyun. Yüzer ilişkisiz nükleozom içeren, (FT) üzerinden akışıdır. Yıkama artan tuz konsantrasyonuna (iki 150 mM'de yıkama ve 300 mM NaCl'de iki) ile Tamponu (Tablo 1) yıkama dört kez boncuk.
    3. Elüe ve de çapraz imüno proteinleri hem de 95 ° C 'de 30 ul SDS-PAGE yükleme Numune Tamponu (Tablo 1)' de ve 25 dakika boyunca boncuk inkübe edin. Ayrı proteinler% 4-12 Bis-Tris akrilamid SDS-PAGE pre-kast jel (Şekil 3D).

Önceki MS 4. Numune Hazırlama

  1. In-Gel N-çipinden zenginleştirilmiş histonların sindirim
    Not: Protein sindirimi ve peptid çıkarma adımlar ilgilenir sırasındaDaha önce 22, 23 tarif edildiği gibi, LC-MS/MS ile müdahale keratin kirletmesini en aza indirmek için.
    1. Kesim jel dilimleri çekirdek histon bantları (Şekil 1D) tekabül. Jel küçültmek için% 100 ACN ile sırayla değişen, GKD 2 O içinde% 50 asetonitril (ACN) ile jel parçaları De-leke. Jeller adet tamamen de-lekeli kadar tekrarlayın ve bir vakum santrifüj onları kurutun.
    2. D6-asetik anhidrid ekleme 01:09 (v / v) 1 M amonyum bikarbonat içinde (NH4 HCO 3) (tipik olarak 60-100 ul son hacim) ve katalizör olarak 3 ul sodyum asetat (CH3 COONa). Güçlü çalkalama ile 37 ° C'de 3 saat boyunca inkübe Not:. Örnek reaksiyonun montaj sonrası ilk dakikada kabarcıklar oluşturabilir: önemli dikkatle ele almak ve üretilen gaz, zaman zaman açıklığını serbest bırakmak için borular inkübasyon sırasında.
    3. Birkaç kez w jel parçaları durulayınIth NH4 HCO 3, tamamen D6-asetik anhidrit kalıntılarını ortadan kaldırmak için artan bir yüzde (% 50 ila% 100) olarak ACN ile alternatif.
    4. 100% ACN içinde jel parçaları shrink; komple de-hidrasyon sağlamak için bir vakum santrifüj içinde kurutun. Dötere asetik anhidrit ve tripsin sindirim kullanılarak lisin kimyasal modifikasyon kombinasyonu üreten bir "Arg-: buz gibi soğuk 100 ng / 50 mM NH4 HCO 3 ul tripsin solüsyonu ve 37 ° C de bir gece boyunca inkübe Not ile yeniden hidrat jel parçaları Histonların 21,24 jel sindirim desen "gibi C.
    5. Fazla solüsyonu atın ve jel parçaları tamamen kapsayacak şekilde 50 mM NH4 HCO3 bir hacim eklemek; 37 ° C de bir gece inkübe
    6. Yeni bir Eppendorf tüpü içinde çözünür sindirilmiş peptitleri toplamak. Peptidler lyophilize. ,% 0.5 asetik acid/0.1% trifloroasetik asit (TFA) bunları yeniden süspanse edin. Desalt ve konsantrebir ters faz el yapımı microcolumns on C18 / Carbon "sandviç" ve iyon değişim kromatografisi (SCX) (StageTip) 25 üzerinde peptitler.
    7. 200 ul ipuçları hareketsiz C 18 / Karbon ("sandviç") ve SCX boncuklar içeren teflon ağ örgüsü diskleri koyarak StageTip microcolumns hazırlayın. Karbon filtre ile yüklü bir ikinci ucunun üzerine C18 mikrokolonlu yüklenerek "sandviç" elde edilir Not:. C18 filtre üzerinde tutulan olmayan çok kısa peptidler, direkt olarak yüklenen akış yoluyla geçmesi genellikle onları yakalar Karbon İpucu. SCX StageTips örneğin H3 gibi belirli peptidler, etkin bir şekilde ters faz kromatografi ile tutulmayan (3-8) peptidi, zenginleştirebilir.
    8. SCX StageTips üzerine C18 / Carbon "sandviç StageTip" ve% 50 üzerine yük peptidlerin 50%. % 80 ACN/0.5% asetik ac kullanarak C 18 / Karbon İpuçları onları Zehirid ve% 5 amonyum hidroksit ile SCX ipuçları (NH4 OH) /% 30 metanol dan. % 0.1 FA liyofilleme tekrar süspansiyon peptidler sonra ve LC-MS/MS ile analiz.
  2. Proteinlerin immüno içinde jelde Sindirim
    Proteinlerin In jelde sindirim küçük değişiklikler ile, daha önce tarif edildiği gibi, 22 gerçekleştirilir.
    1. On dilimleri (Şekil 3D) her şeritli ve 1 mm 3 küçük küpler her dilim kesti. 50 mM NH4 HCO 3/50% etanol ile jel parçaları De-leke ve jeller küçültmek için mutlak etanol ekleyin. Jeller tamamen de-lekeli kadar tekrarlayın.
    2. Karanlıkta, oda sıcaklığında 45 dakika boyunca alkilleme tampon maddesi (Tablo 1) ilave edildi ve ardından 56 ° C de 1 saat karıştırıldı, jel parçaları indirgeme tamponu (Tablo 1) ekleyin. Vakum santrifüjde jel parçaları yıkayın ve kurutun.
    3. Buz soğukluğunda 12.5 ng / ml tripsin sol jel parçaları ile rehidrate50 mM NH4 HCO 3'te ution ve jel parçaları tam bir tekrar nemlendirme kadar buz üzerinde inkübe edilir. Fazla tripsin çıkarın.
    4. Jel parçaları tamamen kapsayacak şekilde 50 mM NH4 HCO3 ekleyin. 37 ° C de bir gece inkübe
    5. Sıvı kısmını toplayın. Jel parçaları için ekstraksiyon tamponu (Tablo 1) ilave et; Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kuvvetli çalkalama ile inkübe edin. Iki kez tekrarlayın.
    6. Kuvvetli çalkalama ile, 10 dakika boyunca ACN içinde jel parçaları inkübe edin. Iki kez tekrarlayın ve tüm Süpernatantlar havuz.
    7. Peptidler liyofilize edilir. ,% 0.5 asetik acid/0.1% TFA içinde kurutulmuştur peptidler yeniden süspanse edin.
    8. Tuzunun giderilmesi ve 26, 27 tarif edildiği gibi, bir ters faz C18 StageTip üzerindeki peptitler konsantre.
    9. % 80 ACN/0.5% asetik asit kullanılarak C 18 StageTip peptidler Zehir. Bir vakum santrifüj içinde buharlaştırarak organik çözücünün çıkması ve% 0.1 FA (tipik olarak 5-10 ve en peptidleri tekrar süspansiyon# 181; l), ne zaman MS analizi için hazır.

5. LC-MS analizi

  1. Sıvı kromatografi analizi
    1. Bir kullanılarak sabit bir helyum basıncı (50 bar) ters-fazlı (RP) C 18, 3 um, metanol reçine kullanılarak, bir 15 cm kaynaşık silika yayıcı (75 mm iç çapı, dış çapı 350 mikron) 'de analitik sütun paketleme bomba-yükleyici cihaz, daha önce 28 açıklandığı gibi.
    2. Çift doğrudan bir 20-cm uzunluk (25 mm iç çap) ile HPLC 6-bağlantı valfinin çıkışına paketlenmiş yayıcı (C 18 RP kolonu) ön sütun veya bölünmüş cihazı kullanmadan silis kaynaşık.
    3. 500 nl / dak Mobil faz A (GKD içinde% 0.1 FA /% 5 ACN 2 O) akış da C18 RP sütunu sindirilmiş peptidler yerleştirin.
    4. Numune yükleme sonra aşağıdaki gradyanları kullanılarak peptidlerin ayrılması:
      1. % 0-40 mobil faz B (% 0.1 FA/99% ACN uygula250 nl / dk 'da GKD 2 O) histonlann türeyen peptidlerin, yıkama için, 5 dakika boyunca, 10 dakika ve 60-80,% 40-60,% gradyanı, ardından 90 dakika boyunca (2) görüyoruz.
      2. İmmüno proteinlerinden türetilen peptidlerin, yıkama için, 5 dakika boyunca, 10 dakika ve% 60-80, (3 e bakınız),% 36-60 gradyanı, ardından 250 nl / dakika, 120 dakika boyunca% 0-36 at mobil faz B uygulanır.
  2. LTQ-FT-ICR-Ultra kütle spektrometresi kullanarak Kütle Spektrometre analizi
    1. Otomatik olarak MS ve MSMS edinimi arasında geçiş yapmak için bir veri bağımlı iktisabı (DDA) modunda çalıştırın. MS tam tarama spektrumları 200-1,650 tipik m / z aralığında, elde edilen, 400 m / z de çözünürlüğü R = 100,000 ile elde edilir. Beş (Top5) en yoğun iyonları 5000 bir hedef değeri bir çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) kullanarak lineer iyon kapanı parçalanma için izole edilir.
    2. Tablo 2 fo listelenen parametreleri kullanınr "Tuning" satın alma dosyası.
    3. Tablo 2'de listelenen standart satın alma ayarlarını ayarlayın.

6.. Veri Analizi

  1. Kromatin etki eş zenginleştirilmiş histon modifikasyonları ücretsiz miktarının Etiket
    1. Edinilen ham dosyaları Raw2msm yazılımı (sürüm 1.10) 29 kullanılarak mgf'den dosyalarına dönüştürebilirsiniz.
    2. Tablo 3'te açıklanan parametreleri ayarlayarak, Maskot DEAMON (versiyon 2.2.2) kullanılarak histon modifikasyonları arayın.
    3. Maskot çıkış peptid listesinde, 15 daha düşük puan ile veya 5'ten fazla farazi FTM 29 ile peptitler kaldırın Not:., Tek tek her peptid ID, yüksek Maskot puana sahip peptid seçmek ve aynı kimliği ile tüm diğer gereksiz peptidler süzmek .
    4. Bas, her değiştirilmiş peptitlere karşılık gelen her bir ön için ekstre edilmiş iyon kromatogramları (XIC) ConstructQualBrowser kullanarak m / z değeri ile ilgili ed. Her bir tepe (Şekil 2A) için eğri (AUC) altındaki alanı hesaplanır.
    5. QualBrowser (Şekil 2B) kullanılarak MS / MS spektrumları, görsel muayene ile değişiklik içeren her bir tespit peptidler doğrulama.
    6. Her bir tadil edilmiş peptid için göreli bolluk hesaplayın. Yonga ed malzemede, her değişiklik nispi zenginleştirme hesaplayın Not:. Göreli bolluk, aynı peptidin tüm modifiye edilmiş ve modifiye edilmemiş formları AUC toplamı üzerinden her belirli tadil edilmiş peptidin AUC arasında bir oran olarak hesaplanır ise göreli Giriş (Şekil 2C) üzerindeki çip spesifik bir modifikasyon itibarıyla nispi bolluk bir oranı olarak zenginleştirme.
  2. Proteinlerin Kantitatif proteomik analizi kromatin alanları içinde co-ilişkili
    1. Proteinler için tanımlama ve miktar MaxQuant paketini kullanabilirsiniz(Http://www. Maxquant.org /) 30. AndromedaConfig.exe 31 kullanılarak yerleşik arama motoru "Andromeda" yapılandırın ve Tablo 3'te listelenen arama parametrelerini ayarlayabilirsiniz.
  3. Ortaklığın testi
    1. Aşağıdaki gibi, MaxQuant yazılımı kullanılarak, ağır-etiketli kromatin giriş protein içine ağır amino asitlerin dahil edilmesi derecesini tahmin:
      1. 6.2 'de açıklanan ancak yeniden ölçmek seçeneğini devre dışı bırakma gibi parametreleri ayarlayın.
      2. Birleşme olmayan gereksiz peptid oranları aşağıdaki formül uygulanarak yüzdesini hesaplayın:. Ortaklığın (%) = oranı (H / L) / oranı (H / L) + 1 × 100 (Şekil 3B) Not: Kabul sadece şirketleşme> 95 %.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Kromatin immüno genomu boyunca bir protein veya bir histon modifikasyonunun lokalizasyonu profil için kullanılan güçlü bir tekniktir. Bir proteomik eşdeğer olarak, çip, ilgilenilen değiştirilmesi veya protein ile birlikte imüno "yem" olarak kullanılan nicel ve nitel olarak hPTMs, histon varyantları ve kromatin bağlayıcı proteinleri belirlemek için MS tabanlı proteomik izlemektedir. N-ChroP yaklaşımda, kromatin MNase (Şekil 1 B) ile sindirilmiş edildiği Şekil 1A...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Yakın zamanda ChroP, kromatin protein bileşenlerinin büyük ölçekli karakterizasyon için nicel bir strateji tarif edilmiştir. ChroP epigenetik alanında kullanılan iki tamamlayıcı yaklaşımlar, Chip ve MS, güçlerini istifade ve kendi sınırlarını aşma birleştirir. Derin dizileme (ChIP-Seq) birleştiğinde ChIP birkaç nükleozomların 35 çözünürlükte histon modifikasyonları genom haritalama sağlar. Duyarlılık için avantajlı olsa da, antikor-bazlı deneyler benzer değişiklikler a...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Bu araştırma aslında Mol Cell Proteomics yayınlandı. Soldi M. ve Kromatin Fonksiyonel Alanlar Bonaldi T. Proteomic İncelenmesi Farklı Heterokromatin Bileşenler MCP arasında Roman birlikteliğini ortaya çıkarır. 2013; 64-80: 12. © Biyokimya ve Moleküler Biyoloji için American Society. Biz yazının eleştirel okuma için Roberta Noberini (Teknoloji ve Ieo İtalyan Enstitüsü, İtalya) teşekkür ederim. TB iş Giovanni Armenise-Harvard Vakfı Kariyer Geliştirme Programı, Kanser Araştırma ve İtalyan Sağlık Bakanlığı için İtalyan Derneği hibe tarafından desteklenmektedir. MS çalışma Firc burs ile desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM LonzaBE12-614F
FBSInvitrogen10270-106
SILAC DMEMM-MedicalFA30E15086
Dialyzed FBSInvitrogen26400-044
Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine)Sigma AldrichL8662
Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine)Sigma AldrichA6969
Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine)Sigma Aldrich68041
Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine)Sigma Aldrich608033
Micrococcal NucleaseRoche10 107 921 001
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail TabletsRoche04 693 132 001
Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot lengthSpectrumlabs132720
QIAquick PCR purification kitQIAGEN28104
Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP gradeAbcamab8898
Histone H3 peptide tri-methyl K9 Abcamab1773
Dynabeads Protein GInvitrogen100.04D
NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel InvitrogenNP0335BOX
Colloidal Blue Staining KitInvitrogenLC6025
LDS Sample BufferInvitrogenNP0007
FormaldheydeSigma AldrichF8775
Aceti anhydride-d6Sigma Aldrich175641-1G
[header]
Formic AcidSigma Aldrich94318-50ML-F
Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystallineSigma AldrichI6125
DL-DithiothreitolSigma Aldrich43815
Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg)PromegaV5113
Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5Microcolumn SrlFS360-75-8-N-5-C15
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% CDr. Maisch GmbHr13.aq.
Carbon extraction disk, 47 mmAgilent Technologies12145040
Cation extraction diskAgilent Technologies66889-U

Referanslar

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  3. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  4. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
  5. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  6. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
  7. Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
  8. Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
  9. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
  10. Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
  11. Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
  12. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
  13. Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
  14. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
  15. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
  16. Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
  17. Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
  18. Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
  19. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  20. Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
  21. Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
  22. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
  23. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
  24. Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
  25. Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
  26. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
  27. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
  28. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
  29. Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
  30. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
  31. Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
  32. Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
  33. Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
  34. Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
  35. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
  36. Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
  37. Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
  38. Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
  39. Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
  40. Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 86kromatinhiston translasyon sonras modifikasyonlar hPTMsepigenetikk tle spektrometresiproteomiksSILACkromatin immunopresipitasyonhiston varyantlarchromatomehPTMs apraz g r meler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır