该ChroP方法结合芯片和质谱剖析染色质的基因座特异性蛋白质组学风景

摘要

通过结合本地和交联染色质免疫沉淀高分辨率质谱，ChroP方法使解剖的组蛋白修饰，变体和非histonic协同作用的蛋白质在功能上不同的染色质域的复合蛋白质结构。

摘要

染色质是一种高动态核蛋白复合物由DNA和蛋白质，其控制各个DNA依赖性过程。在特定区域的染色质结构和功能是由组蛋白的翻译后修饰（hPTMs）和变体，染色质结合蛋白，包括转录因子，和DNA甲基化的局部富集调节。染色组合物中的不同的功能区的蛋白质组分析的方法已经被缺乏有效的协议，以丰富这些域在适当的纯度和量为后续的深入分析物的质谱（MS）到目前为止妨碍。我们在这里介绍了新设计的染色质蛋白组学策略，命名ChroP（CHRO晨报P roteomics），由此制备型染色质免疫沉淀是用来隔离不同的染色质区域，其特征在hPTMs方面，变体和共同相关联的非histonic蛋白质，是通过MS进行分析。我们说明他重新ChroP的转录沉默的异染色质区域的富集和分析，其标志是三甲基化的组蛋白H3赖氨酸9的存在成立。所取得的结果证明ChroP在彻底表征异蛋白质组，并证明它作为理解如何染色质的独特的蛋白质决定簇相互作用和协同效应，建立基因座的特定结构和功能结构的有力的分析策略的潜力。

引言

染色质是涉及为所有的DNA介导的过程主模板一个高度动态的核蛋白复合物。核小体是染色质的基本重复单元和由含各规范组蛋白H2A，H2B，H3和H4，在其周围147 bp的DNA被包裹^1,2两分子的蛋白质八聚体核心的。所有核心组蛋白的结构为球状结构域和一个灵活的N端“尾巴”突出了核小体之外。一种用于调节染色质结构和动力学的主要机制是基于共价键的翻译后修饰（翻译后修饰），其主要发生在N-末端组蛋白^3,4。组蛋白修饰可以通过改变高阶染色质结构，通过改变之间的组蛋白-DNA或核小体之间的接触，并从而控制DNA结合蛋白（ 顺机制）的可访问功能，或通过作为dockin克位点的调节蛋白，无论是作为单个单元，或者嵌入在多聚体复合物。这样调节蛋白可以发挥它们的功能以不同的方式：通过直接调节基因表达（ 即 TAF蛋白），或通过改变核小体定位（ 即染色质重塑复合物），或者通过修改其他组蛋白残基（ 即蛋白质具有甲基转移或乙酰基转移酶活性）（ 反式机制^）5。观察到在某些具体的染色质基因座不同的PTM模式群集导致了阐述这一假设在不同地点的不同修饰可协同作用以生成分子编码介导相关的DNA的功能状态。在“组蛋白密码假说”已经获得了很大的共识在多年，但它的实验验证已受困于技术限制^6,7。

质谱（MS）为基础的蛋白质组学已成为一个功能强大的工具来映射组蛋白修饰模式和表征染色质结合蛋白^8。 MS检测的变形作为肽的实验和理论质量之间的特定Δmass。在个人组蛋白的水平，微软提供了一个公正和全面的方法来映射翻译后修饰，允许其中^9-14新的修改和揭示interplays的检测。

在最近几年，已经开发了多种策略来剖析染色质的蛋白质组合物，包括完整的有丝分裂染色体^15，可溶性HPTM结合蛋白^16-18的标识和特定染色质区域的分离和分析的表征（ 即端粒^）19,20。然而，组蛋白翻译后修饰，变体和染色质相关蛋白之间的位点特异性的协同作用的研究仍然是不完整。在这里，我们描述了一种新的方法，命名为ChroP（染色体晨报P ^{roteomics）21，}我们已经开发了能够有效表征功能不同的染色质域。这种方法适应染色质免疫沉淀技术（ChIP），在表观遗传学研究中使用一套行之有效的方案，为充实样品的有效质谱为基础的蛋白质组学分析。我们已经开发出两种不同的协议，这取决于所用的输入和由MS处理的问题染色质的类型;具体为：1）芯片消化MNase不固定本地染色质是用来净化单核和解剖合作关联hPTMs（N-ChroP）; 2）交联染色质碎片通过超声处理芯片采用的是与SILAC为主interactomics策略来描述所有共同丰富的染色质结合蛋白（X-ChroP）的组合。我们举例说明这里的N-和X-ChroP的丰富和研究异，采用H3K9me3为诱饵进行免疫沉淀步骤的结合。使用ChroP的可扩展研究无论是不同的区域染色质上，或变化过渡到一个不同的功能状态，在同一区域内的染色质组成，从而铺平了道路表观遗传学中的各种应用。

研究方案

1，细胞培养

1. 标准介质本土芯片
   1. 生长在补充有10％胎牛血清（FBS），1％谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素和10mM HEPES pH为7.5的Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）的HeLa细胞。
2. 交联沉淀SILAC标记
   1. 生长的HeLa细胞中SILAC DMEM培养基中，贫化赖氨酸和精氨酸的，补充有10％透析过的FBS，1％谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素，10mM的HEPES pH为7.5和任一的光L-赖氨酸（Lys 0）和L-精氨酸（精氨酸0）或它们的重对应，L-赖氨酸（Lys 8）和L-精氨酸（精氨酸10）（ 材料表），在终浓度为73毫克/升和42毫克/升，分别为。
   2. 细胞生长长达八代在SILAC培养基中，以确保完整的同位素编码的氨基酸掺入。通过细胞每两天，当它们达到1.0-1.5×10 ⁶细胞/ ml的密度，在交流播种它们oncentration的3×10 ⁵个细胞/ ml。
   3. 评估细胞生长和生存力在SILAC到中个体化从生理学会导致从SILAC培养基的组合物较差，任何可能的变更;要做到这一点：
      1. 目视检查细胞的标记在每天形貌的显微镜。
      2. 计数细胞SILAC成长与标准介质的细胞和情节的生长曲线。

2，本机染色质免疫沉淀（N-CHIP）

1. 从培养细胞的细胞核的准备
   1. 用1-2×10 ⁸个未标记的HeLaS3每个实验的细胞。收获细胞，进行50×10 ⁶个细胞的等分试样在50毫升管中并离心分离，在340×g离心10分钟，在4℃，用冰冷的PBS冲洗。
   2. 每个重悬细胞沉淀于8ml裂解缓冲液（ 表1）并孵育10分钟，在4℃下在旋转的轮子。倒入约在蔗糖垫（ 表1）和离心机的水平转子，在3,270 xg离心20分钟，在4℃下，以细胞核从细胞质分离refully每个细胞裂解液。
   3. 弃上清，保持核颗粒和在冰冷的PBS洗两次他们通过离心，弃上清在每次洗涤。
2. 微球菌核酸酶（MNase）消化（小规模）和染色质消化后的质量控制
   1. 重新悬浮于1ml的消化缓冲液（ 表1）中洗涤沉淀的核;划分于500μl两等份，并保持在冰上。
   2. 测量的光密度（OD）在等分试样的260纳米，0.2％十二烷基硫酸钠（SDS）稀释1:200 注 ：OD = 1对应于染色质的DNA的大约50微克/毫升。通常情况下，从2×10 ⁸个细胞开始，OD是在40-60的范围内。
   3. 取核的1％，加MNase酶为0的最终浓度。酶ü005 /微升核和孵化在37℃不同时间流逝（0，10，20，40，60分钟）。
   4. 在每个时间点，收集4微升消化原子核，并添加1毫米EDTA停止MNase反应。置于冰上。
   5. 提取的DNA样品进行PCR纯化试剂盒以及它们洗脱在50μl的TE缓冲液（ 表1）。
   6. 取20微升的每个DNA样品，加入10微升缓冲液中（ 表1），并装载样品在1％（重量/体积）含溴化乙锭，用PCR标记的大小控制的琼脂糖凝胶。
   7. 检查消化评估由MNase孵化生产的染色质核小体的阶梯。
   8. 选择用于消化的最佳时间的基础上，单核小体在制备的患病率。通常情况下酶/微升核MNase消化的最佳时间是60分钟（ 图1B，左图 ）的0.005ü 注 ：digesti的最佳MNase浓度/时间上可能取决于所需的细胞类型和对核小体拉伸的大小来调节。
3. Large-scale/preparative MNase消化和可溶性染色质馏分回收
   1. 加至每个等分试样（参见2.2.1）5微升MNase，对应的酶/微升晶核0.005 U A的最终浓度;轻轻混匀，并在37℃下进行60分钟（或一般的用于优化的时间间隔，基于小规模试验）。
   2. 加入1毫摩尔EDTA以终止反应并保持在冰上。通过离心沉淀消化的原子核在7800×g离心4℃10分钟。转移上清液（级分S1），在一个新的管并储存于4℃ 注：S1中包含染色质的第一可溶性组分，其包括单核小体。加入蛋白酶抑制剂（ 表1）。
   3. 1毫升透析缓冲液（ 表1）仔细悬浮颗粒和透析过夜，4°C（CUT斯达康关闭透析管为3.5 kDa的），在3升透析缓冲液，用恒定的轻微搅拌。收集透析材料和离心机在7800×g离心10分钟，在4°C。转移上清液（S2分数）在一个新的Eppendorf管中并储存于4℃ 注：S2包括二至EPTA-核小体，取决于MNase消化程度。
4. 免疫染色前的质量控制
   1. 采取相应的等分试样以5微克S1和S2染色质级分（通过测量OD 260nm处的的NanoDrop系统定量）。用PCR纯化试剂盒提取DNA并洗脱在50μl的TE缓冲液（ 表1）。
   2. 取20微升S1和S2的DNA，用10微升上样缓冲液（ 表1）混合，并将它们加载于1％（W / V）琼脂糖凝胶。检查的质量和MNase消化由核小体阶梯目视检查的效率注：分数S1是高度富含单核，而组分S2主要含有聚核小体（ 图1B，右图 ）。
5. 染色质与抗体的孵育
   1. 储存在-20℃下50微升中一小部分用于后续的质谱分析。
   2. 加入1倍体积的ChIP稀释液（ 表1），以分数S1。
   3. 添加对感兴趣的HPTM（或蛋白质）的抗体;孵育过夜上的旋转轮在4℃ 注意：通常情况下，使用抗体的10微克至20微克为2×10 ⁸个细胞。抗体的量与起始细胞数目之间的最佳比例必须仔细设置个别情况，这取决于所用的样品内的诱饵HPTM /蛋白质的丰度和对抗体的效率。优化是实验性的基础上，进行下列测试：
      1. 比较的输入和流过（FT之间的利益HPTM /蛋白质的量，见2.7.2）通过Western印迹或质谱来验证该免疫沉淀富集的特定的染色质区域的显著比例注：这通常是实现当HPTM /蛋白诱饵的至少50％被耗尽在FT（ 图1C） 。
      2. 查所感兴趣的蛋白进行免疫沉淀检测的是在SDS-PAGE凝胶，这确保了材料的足够量的可用于MS的分析注：在对应于四个核心组蛋白在正确的化学计量比的条带的凝胶的存在表明完整的核小体被免疫沉淀的由N-ChroP（ 图1D）。缺乏适当的化学计量的，其实是反映一个部分中断/展开的​​核小体组成。
   4. 同时，准备了G蛋白偶联磁珠（见2.6）。
6. 平衡和阻塞的G蛋白偶联磁珠
   1. 平衡100微升蛋白G-偶联的磁珠浆料在封闭液（ 表1），洗涤三次，并过夜温育它们在4℃下在旋转的轮子注：以下的小珠的结合能力，使用100微升浆料供2-20微克抗体。
   2. 用封闭液，然后两次带芯片稀释液（ 表1）洗一次封锁的珠子。
7. 染色质的使用磁珠分离
   1. 加入100微升的封闭的珠至S1染色质样品孵育它们在旋转的轮在4℃下3小时。离心机在340×g离心1分钟以从技巧的盖降速样品。放在一个磁架沉淀的珠子。
   2. 将上清转移到一个新的Eppendorf管中。这是流过（FT），染色质即分数未结合的抗体。
   3. 洗珠4次洗涤缓冲液（ 表1）在每次洗涤（75，125和175 mM氯化钠）增加盐的浓度。
   4. 以洗脱免疫染色，孵育在30微升LDS样品缓冲液中，在70℃下补充有50mM的二硫苏糖醇（DTT）的5分钟的珠分离洗脱的蛋白质在4-12％的Bis-Tris丙烯酰胺的SDS-PAGE预制梯度凝胶染色和用胶体考马斯亮蓝染色试剂盒（ 图1D）的凝胶。

3，交联染色质免疫沉淀（X片）

1. 细胞与甲醛的交联
   1. 添加0.75％的甲醛以SILAC标记的细胞，短暂混合后，于室温下10分钟。通过加入125mM的甘氨酸淬灭甲醛孵育5分钟，在室温下进行。
   2. 分化的细胞以5×10 ⁷个等分试样;冲洗他们三次，用冰冷的PBS通过离心在430×g离心5分钟，在4℃，并在每次洗涤后弃去上清液。在最后一次洗涤，弃去上清液，并保留沉淀。注意：一旦细胞是交联的，可以将它们存储于-80℃，如果不是立即使用。
2. 原子核的准备
   1. 每个重悬细胞沉淀在10ml裂解缓冲液（ 表1）。孵育10分钟，在4℃下用旋转。离心机在430×g离心5分钟，在4℃下弃上清液;保持核颗粒。
   2. 重悬的每个核沉淀在10ml洗涤缓冲液（ 表1）。在室温下孵育，以一个旋转的轮子10分钟。
   3. 离心机在430×g离心5分钟，在4℃下弃上清液，收集颗粒。
   4. 每个重悬核颗粒在3毫升沉淀孵育缓冲液（ 表1）。置于冰上。
3. 染色质超声和质量控制
   1. 超声通道。romatin在200瓦（30秒的“开”和1分钟“关”周期），在冷却的Bioruptor，将其分解质注 ：循环和超声处理的时间间隔的数目依赖于细胞类型和核小体的平均长度舒展理想。典型地，超声处理30分钟是必要的，以产生300-500碱基对长度的DNA片段，对应二 - 和三 - 核小体。片段大小的选择取决于染色质结构域的受调查的类型。
   2. 取总输入的2％，由孵化反向交联，在65℃下至少1小时的沉淀孵育缓冲液中。通过PCR纯化试剂盒提取DNA，洗脱在50μlTE缓冲液，并载入DNA琼脂糖凝胶上检查染色质碎片。
4. 染色质与抗体的孵育
   1. 加1/10体积的10％的Triton X-100的超声处理的染色质。 12,000×g离心，在4℃下10分钟沉淀德业务收益指数。
   2. 除50微升染色输入从繁重的细胞，用于测试的SILAC氨基酸掺入水平标记的细胞和蛋白质分析。
   3. 选择的抗体添加到剩余的重链和轻标记的超声处理的染色质和孵育过夜，在4℃在旋转轮。在光通道，还添加了可溶性肽的过量倍。孵育过夜，在4℃下在旋转的轮子注：抗体的微克和细胞的起始材料之间的最佳条件的选择的情况下通过的情况下，如在2.5.3中讨论。在相对于所述抗体的可溶性肽的最佳过量倍摩尔浓度必须通过的情况下小心地滴定的情况。
5. 染色质的使用磁珠分离
   1. 平衡，并按照2.6中所述的步骤，并采用芯片孵育缓冲液阻断G蛋白偶联的磁珠。
   2. 加入100μl阻断乙EADS到染色质的样品，孵育在4℃旋转轮3小时离心机在340×g离心1分钟以从技巧的盖降速样品。放在一个磁架沉淀的珠子。上清液通过（FT）的流量，含有未结合核小体。洗涤珠子4次洗涤缓冲液（ 表1）而增加的盐浓度（2次洗涤在150mM和2，在300 mM氯化钠）。
   3. 在95℃下温育珠中加入30μlSDS-PAGE上样样品缓冲液（ 表1）和25分钟到两个洗脱和去交联的免疫沉淀的蛋白质。分离蛋白质的4-12％的Bis-Tris丙烯酰胺的SDS-PAGE预制凝胶（ 图3D）。

4，样品制备之前的MS

1. 在凝胶组蛋白由N-CHIP丰富的消化
   注意：在蛋白质的消化和肽的提取步骤照顾以减少角蛋白污染，与LC-MS/MS干扰，如前所述^22，23。
   1. 对应于该核心组蛋白条带（ 图1D）剪切凝胶切片。去色斑的凝胶片，用50％乙腈（ACN）在DDH _{2 O，}用100％乙腈交替收缩凝胶。重复直至凝胶块完全去染色，干他们在真空离心机。
   2. 加入D _6-乙酸酐1点09（体积/体积）中的1M碳酸氢铵（NH ₄ HCO _3）（典型的最终体积是60-100微升）和3微升醋酸钠（CH ₃ COONa），为催化剂。孵育3小时，在37℃强烈震动注 ：样品可能会产生的第一分钟气泡反应的组装后：它重要的是要谨慎处理和释放产生的气体，开盘时的管在孵化。
   3. 冲洗凝胶块数倍数w第i个NH ₄ HCO _3，替代用ACN的比例增加（从50％到100％），以完全消除署署长₆ -乙酸酐残留物。
   4. 收缩的凝胶片在100％ACN;干他们在真空离心机，以确保完全的脱水。再水合凝胶片，用冰冷的100纳克/微升的50mM NH ₄ HCO ₃的胰蛋白酶溶液并孵育过夜，37℃ 注 ：在使用氘代乙酸酐和胰蛋白酶消化赖氨酸的化学修饰的组合，生成一个“ARG- C相似的“在组蛋白^21,24的凝胶消化模式。
   5. 丢弃过量的溶液和50mM的NH ₄ HCO ₃的体积加至完全覆盖凝胶块;孵育过夜，在37°C
   6. 收集可溶性消化的肽在一个新的Eppendorf管中。冻干肽。重悬它们在0.5％乙酸acid/0.1％三氟乙酸（TFA）。脱盐和浓缩肽在反相上手工制作的微柱-C ₁₈ /碳“夹心”和离子交换色谱^{（SCX）（StageTip）25。}
   7. 通过把含有固定-C ₁₈ /炭（“三明治”）和SCX珠在200微升提示铁氟龙网状磁盘准备StageTip微柱。获得“三明治”通过装有活性炭滤芯第二尖的顶部加载了C ₁₈微柱注：在很短肽，未保留在C ₁₈的过滤器，通过在直接加载在流通碳提示，通常捕获它们。 SCX StageTips可以丰富具体的肽，例如H 3（3-8）肽，而不是通过反相色谱法有效地保留。
   8. 负载肽的50％到了C ₁₈ /炭“三明治StageTip”，50％到SCX StageTips。使用80％ACN/0.5％醋酸交流了C ₁₈ /炭提示他们洗脱id和从SCX提示，用5％氢氧化铵（NH ₄ OH）/ 30％甲醇中。冷冻干燥后，重悬肽在0.1％FA和用LC-MS/MS分析。
2. 胶内消化免疫纯化的蛋白质
   凝胶内消化的蛋白质进行如前所述的^22，有轻微的修改。
   1. 切10片（ 图3D）每个车道和1毫米³个小立方体每个切片。去色斑的凝胶片，用50mM NH _{4 HCO-3/50％}乙醇，并加入无水乙醇收缩凝胶。重复，直到凝胶完全去染。
   2. 添加还原缓冲液（ 表1）的凝胶片1小时，在56℃，随后在室温下45分钟，加入烷基化缓冲液（ 表1），在黑暗中。在真空离心洗干净并擦干凝胶块。
   3. 再水合的凝胶片，用冰冷的12.5毫微克/微升胰蛋白酶溶胶ution在50毫米的NH ₄ HCO ₃和在冰上孵育直至凝胶块完全补液。在去除多余的胰蛋白酶。
   4. 添加50mM的NH ₄ HCO ₃以完全覆盖凝胶片。孵育过夜，在37°C。
   5. 收集的液体部分。提取缓冲液（ 表1）添加到该凝胶块;孵育在强力搅拌下，在室温下10分钟。重复两次。
   6. 孵育凝胶片在乙腈10分钟，在强力搅拌。重复两次，汇聚各上清液。
   7. 冻干肽。重悬干燥的肽在0.5％乙酸acid/0.1％TFA。
   8. 脱盐和浓缩的肽在反相C ₁₈的StageTip，如所述^26,27。
   9. 从C ₁₈ StageTip用80％ACN/0.5％醋酸洗脱肽。通过在真空离心机蒸发除去有机溶剂和悬浮的肽在0.1％甲酸（通常为5-10及＃181，L），当准备将MS分析。

5，LC-MS分析

1. 液相色谱分析
   1. 装在15厘米的石英发射器（75微米内径350微米外径）分析柱，使用反相（RP）：C _18，在甲醇中为3μm树脂，在一个恒定的氦压力（50巴），使用炸弹装载装置，如前面描述的^28。
   2. 耦合装发射器（C ₁₈反相柱）直接连接到HPLC上的6端口阀通过一个20厘米长（25微米内径）的出口熔融二氧化硅不使用预柱或分流装置。
   3. 加载用C ₁₈反相柱的消化肽在流量500升/分钟流动相A（0.1％FA / 5％乙腈在DDH ₂ O）的。
   4. 样品装载之后，使用以下梯度分离的肽：
      1. 适用0-40％流动相B（0.1％FA/99％ACN在DDH ₂ O），在250升/分钟以上90分钟，然后40-60％的梯度在10分钟和60〜80％在5分钟内，肽从组蛋白衍生的洗脱（参见图2）。
      2. 应用0-36％流动相B，在250升/分钟以上120分钟，随后的36-60％梯度，10分钟和60〜80％在5分钟内，肽从免疫纯化蛋白质衍生的洗脱（参见图3）。
2. 使用LTQ-FT-ICR-超质谱质谱分析
   1. 工作在数据依赖采集（DDA）模式，以MS和MSMS收购之间自动切换。 MS全扫描谱从200-1,650获得的，通常是在m / z范围中，获取与分辨率R = 100,000，400 M / Z。五（初到）最强的离子使用的是碰撞诱导解离（CID）在目标值5000隔离碎片的线性离子阱。
   2. 使用表2 FO列出的参数r中的“调整”收购文件。
   3. 定的标准采集设置，如表2所列。

6，数据分析

1. 标记的组蛋白修饰共同富含染色质结构域自由量化
   1. 所采集的原始文件转换为使用Raw2msm软件（1.10版^）29 MGF文件。
   2. 搜索用吉祥物守护进程（2.2.2版本），设置在表3中所述的参数组蛋白修饰。
   3. 在吉祥物输出肽列表，删除肽得分低于15或超过5假定的翻译后修饰²⁹ 注：对于每一个单一的肽的ID，选择具有最高的吉祥物得分的肽，并过滤掉所有其他多余的肽相同的ID 。
   4. 构建提取离子色谱图（XIC）对应于每一个修饰肽前体每一个，BAS版上的m / z值，使用QualBrowser。计算出的曲线（AUC）为每个峰（ 图2A）下的面积。
   5. 验证包含使用QualBrowser（ 图2B）的MS / MS谱的目视检查修改每个所识别的肽。
   6. 计算的相对丰度为每个修饰肽。计算在所述芯片编材料的每个修改的相对富集注：相对丰度被计算为超过AUC的相同肽的所有修饰和未修饰形式的总和每个特定修饰的肽的AUC之间的比率，而相对富集在该芯片在输入（ 图2C）的特异性修饰的相对丰度的比值。
2. 蛋白质的定量蛋白质组学分析合作相关的染色质域之内
   1. 对于蛋白质鉴定和定量使用MaxQuant包上（http://www。maxquant.org ^/）30。配置内置的搜索引擎“仙女座”使用AndromedaConfig.exe ³¹和设置在表3中列出的搜索参数。
3. 掺入 ​​试验
   1. 估计重氨基酸掺入程度分为重标记的染色质蛋白的输入，使用MaxQuant软件，如下所示：
      1. 设置在6.2描述，但禁用重新量化选项的参数。
      2. 计算比例掺入采用以下公式来非冗余肽比率： 注册（％）=比（H / L）/比（H / L）+ 1×100（ 图3B）注：只接受，如果掺入> 95 ％。

结果

染色质免疫沉淀法是用于分析沿基因组中的蛋白或组蛋白修饰的定位一个强大的技术。在蛋白质组学当量，芯片随后基于MS的蛋白质组学识别定性和定量的hPTMs，组蛋白变体与染色质结合蛋白是与感兴趣的修饰或蛋白免疫沉淀一起，作为“诱饵”。在N-ChroP方法中，在图1A中，原生芯片，其中染色质消化MNase（ 图1B）所述，作为输入到从散装染色质独特的功能域净化。消化染...

讨论

我们最近已描述ChroP，定量策略染色质中的蛋白质组分的大规模表征。 ChroP结合的表观遗传领域使用两种互补的方法，芯片和质谱，从自己的优势中获利，克服各自的局限性。沉淀耦合到深度测序技术（ChIP-SEQ）允许的组蛋白修饰在核小体少³⁵的分辨率的全基因组的映射。虽然便于其敏感性，基于抗体的测定是在自己有能力区分类似的修改和解剖的组蛋白密码³⁶组合方面的限制。另?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Lonza	BE12-614F
FBS	Invitrogen	10270-106
SILAC DMEM	M-Medical	FA30E15086
Dialyzed FBS	Invitrogen	26400-044
Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine)	Sigma Aldrich	L8662
Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine)	Sigma Aldrich	A6969
Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine)	Sigma Aldrich	68041
Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine)	Sigma Aldrich	608033
Micrococcal Nuclease	Roche	10 107 921 001
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 132 001
Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length	Spectrumlabs	132720
QIAquick PCR purification kit	QIAGEN	28104
Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade	Abcam	ab8898
Histone H3 peptide tri-methyl K9	Abcam	ab1773
Dynabeads Protein G	Invitrogen	100.04D
NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0335BOX
Colloidal Blue Staining Kit	Invitrogen	LC6025
LDS Sample Buffer	Invitrogen	NP0007
Formaldheyde	Sigma Aldrich	F8775
Aceti anhydride-d6	Sigma Aldrich	175641-1G
[header]
Formic Acid	Sigma Aldrich	94318-50ML-F
Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline	Sigma Aldrich	I6125
DL-Dithiothreitol	Sigma Aldrich	43815
Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg)	Promega	V5113
Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5	Microcolumn Srl	FS360-75-8-N-5-C15
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% C	Dr. Maisch GmbH	r13.aq.
Carbon extraction disk, 47 mm	Agilent Technologies	12145040
Cation extraction disk	Agilent Technologies	66889-U