التصوير من خلال حالة العذراء من<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

Summary

يوضح هذه الورقة استخدام المجهر متحد البؤر المسح السريع إلى سلوك الخلية صورة مباشرة من خلال puparium. من خلال ترك حالة العذراء سليمة، وهذا الأسلوب يسمح للمراقبة وقياس العمليات الحيوية في الخلية مرحلة من مراحل التنمية ذبابة الفاكهة التي يصعب دراسة مباشرة.

Abstract

استخدام منذ فترة طويلة من ذبابة الفاكهة نموذجا لخلية والبيولوجيا التطورية قد حقق مجموعة من الأدوات. معا، وقد مكنت هذه التقنيات تحليل الخلية والبيولوجيا التطورية من مجموعة متنوعة من الزوايا المنهجية. التصوير الحي هو أسلوب الناشئة لمراقبة عمليات الخلية الحيوية، مثل انقسام الخلية أو الخلايا المنوية على الحركة. بعد أن الطفرات معزولة في uncharacterized المفترضة البروتينات دورة الخلية أصبح من الضروري أن نلاحظ الانقسام في الموقع باستخدام التصوير الحي. وقد ركزت معظم الدراسات التصوير الحي في ذبابة الفاكهة على المراحل الجنينية التي يمكن الوصول إليها للتلاعب والمراقبة بسبب صغر حجمها وضوح بصري. ومع ذلك، في هذه المراحل دورة الخلية غير عادي من حيث أنه يفتقر إلى واحدة من مراحل الفجوة أو كليهما. على النقيض من ذلك، خلايا الجناح العذراء ذبابة الفاكهة لديها دورة الخلية النموذجية والخضوع لفترة من الانقسام السريع الذي يمتد حوالي 20 ساعة للتنمية العذراء. فمن السهل أن طdentify وعزل الشرانق من المرحلة المناسبة للقبض على الانقسام في الموقع. قدمت تصاعد الشرانق سليمة أفضل مزيج من معرفة منشأ والمتانة أثناء التصوير، مما يسمح للتجارب لتشغيل لعدة ساعات مع تأثير ضئيل على الخلايا الحيوانية وقدرتها على البقاء. الأسلوب يسمح للمراقبة من الميزات صغيرة مثل، أو أصغر من، ويطير الكروموسومات. تعديل إعدادات المجهر وتفاصيل تصاعد مستمر، ويسمح بتمديد إعداد تصور ديناميات غشاء الخلايا المجاورة والبروتينات fluorescently المسمى مثل تويولين. يعمل هذا الأسلوب لجميع البروتينات الفلورية اختبارها ويمكن التقاط ملامح نطاق submicron على مجموعة متنوعة من النطاقات الزمنية. بينما تقتصر على 20 ميكرومتر الخارجي للخادرة مع المجهر متحد البؤر التقليدية، قد يكون هذا النهج لمراقبة البروتين وديناميات الخلوية في أنسجة العذراء في الجسم الحي مفيدة عموما في دراسة الخلية والبيولوجيا التطورية في هذه الأنسجة.

Introduction

ذبابة الخل، ذبابة الفاكهة السوداء البطن، هو نموذج راسخة لدراسة جوانب كثيرة من علم الأحياء. البحوث ذبابة الفاكهة لديها تاريخ غني من التجارب الجينية التي تسمح أشكال متطورة من التلاعب الجيني بما في ذلك التعبير، ضربة قاضية والطفرة. مع ظهور علامات بروتين فلوري، وسعت هذه الدراسات لتشمل ذخيرة من الخلايا والبروتينات في الحيوانات الحية. الجنين ذبابة هو نظام ممتاز لمثل هذه الدراسات كما هو واضح بصريا الصغيرة والسماح العميق، وارتفاع القرار التصوير في الجسم الحي ^1-3. وقد أثبتت المراحل الأخرى للتنمية ذبابة إلى أن تكون أقل لين العريكة، والتي تتطلب تخدير ^4، تشريح والثقافة على المدى القصير ^5،6، أو إنشاء النوافذ في إهاب للتصوير ^7،8. هذه المناورات عادة تنازلات التنمية الحيوانية على المدى الطويل أو تؤثر على الحيوانات في الطرق التي تحد من التصوير لفترات قصيرة.

الأنف والحنجرة "> دراسة الطفرات في الجينات الرواية التي تشبه المنظمين دورة الخلية، كان من الضروري العثور على إعداد المناسب لدراسة توقيت والإخلاص من دورة الخلية. منذ يتم اقتطاع معظم دورات الخلايا الجنينية (SM أو S-G2-M) والمسوخ قيد الدراسة لا تظهر العيوب حتى مراحل لاحقة، كان من المهم أن نلاحظ دورة الخلية في الأنسجة مرحلة العذراء. الخلايا الظهارية في خادرة لها دورة الخلية G1-S-G2-M أكثر نموذجية والشرانق من هذه المرحلة هي غير قادرة على حركات العضلات ^9. تضمنت نقطة الانطلاق الأولي للتلاعب الشرانق كلها سليمة معربا عن Histone2AV-GFP. وعلى الرغم من التعتيم على ما يبدو من حالة العذراء، وثبت هذا التحضير سليمة لتكون ممتازة على المدى الطويل في مجال التصوير الجسم الحي. هذه التقنية بسيطة يكفي أن الباحثين الجامعيين بشكل روتيني استخدامها لدراسة جوانب الخلية والبيولوجيا التطورية في ذبابة الفاكهة وبعد هذا القرار على ما يرام بما يكفي للسماح التمييز من الميزات مقياس ميكرومتر. مع هذا الأسلوب، والملاحظات من الأحداث على مدى الساعات والدقائق أو الثواني من الممكن ببساطة من خلال تعديل معايير السلاسل الزمنية. أشرطة الفيديو باستخدام الأزرق والأخضر والأصفر والبرتقالي، والأحمر البروتينات الفلورية، أو مزيج من هذه، بذلت. الأهم من ذلك، إذا أخذ الرعاية للحد من كثافة الليزر، حتى التصوير على المدى الطويل ليس له تأثير على التنمية أو بقاء الحيوانات.

Protocol

1. يطير العمل

1. الحفاظ على الذباب على مستوى متوسطة دقيق الذرة، دبس أجار الخميرة في درجة حرارة الغرفة ^10.
2. لالصلبان، وعزل العذارى في غضون 6 ساعة من eclosion. بعد عبور إلى الذكور من النمط الجيني المطلوب، والذباب تغيير في قارورة جديدة كل 3-4 أيام.

ملاحظة: للحصول على هذه التجارب، تم استخدام خط GAL4 A9 لدفع التعبير عن الجينات المحورة في الجناح. ويمكن الحصول على الأسهم تطير من مركز الأسهم في بلومنجتون. الأسهم المستخدمة في هذه التجارب تشمل A9-GAL4 (أز # 8761)، His2Av-GFP (أز # 5941)، اسكتلندا / CYO HsCre (أز # 1092)، UAS-ChRFP-حوض (أز # 25773)، lollibow ^11.

2. اختيار وتركيب شرانق

1. مرحلة الشرانق إما عن طريق جمعها كما prepupae الأبيض (WPP) وابقائها عند 25 درجة مئوية حتى بلوغهم سن مناسبة أو باستخدام معايير مورفولوجية ^12.
2. لمراقبة انقسامات الخلية، حدد خادرة التي خضعت مؤخرا رئيس انقلاب للخارج.من هذا الوقت حتى قبل eclosion (في> 96 ساعة)، الشرانق يتم السماح متحرك المراقبة الموسعة مرور الزمن.
3. إزالة الشرانق من القنينات عن طريق لمس الأولى لهم مع الفرشاة مبللة بالماء، والانتظار لمدة دقيقة للسماح للمياه لتخفيف لاصقة ثم بلطف والحث لهم على الفرشاة.
4. غسل بلطف الشرانق التي اختارتها والحث عليها مع الفرشاة في الماء لإزالة اللاصق الغدة اللعابية والغذاء الجسيمات.
5. نقل الشرانق نظيفة إلى طبق بتري 25 ملم مع قاع ساترة (رقم 1 ½ coverslips).
6. باستخدام شرائح رقيقة إما الصلصال أو الشمع الأسنان كوسيلة لدعم، جبل الشرانق بحيث الأنسجة من الاهتمام هو الأقرب إلى ساترة.
   ملاحظة: في الدراسات وصفها هنا، وقد لوحظ أجنحة العذراء والساقين والبطن histoblasts أو الظهرية notum. في الممارسة العملية، أي نوع من الأنسجة في غضون 20 ميكرون من سطح حالة العذراء هو ملاحظتها.
7. الشرانق توجيه بعناية بحيث TISSU(ه) من الفائدة موازية لسطح الزجاج ساترة.
8. مرة واحدة هي التي شنت الشرانق، واستخدام الفرشاة لنقل طبقة رقيقة من thiodiethylene غليكول (المعنية بنقل البضائع الخطرة) إلى الفضاء بين خادرة وساترة.

ملاحظة: TDG يقلل نثر السطح، يطابق معامل الانكسار من النفط، ويسمح الأكسجين إلى أنسجة تتخلل ^13. لا ينصح استخدام الزيوت، كما أنها تميل إلى حرمان الأنسجة من الأوكسجين، مما تسبب في وقف السريع للسلوكيات الخلية.

3. التصوير

ملاحظة: للحصول على التصوير، ومن المرجح أن يكون أساسيا كما confocality يزيل معظم خلفية التعتيم الناجمة عن الإضاءة الشديدة من حالة العذراء المجهر متحد البؤر.

1. ضبط الإعدادات على متحد البؤر للحد من تأثير الإضاءة على التنمية العذراء وقدرتها على البقاء. للقيام بذلك، تحقق التوازن بين شدة الإثارة وحساسية المجموعة. تكوين نموذجي للواي التصويرال لايكا SP5 استخدام الماسح الضوئي الرنانة (8،000 هرتز)، قوة الليزر لتعيين 2٪ (10٪ النفاذية للسلطة 20٪)، ومجموعة ذات الثقب إلى 120 ميكرون، وتعيين خط المتوسط ​​إلى 8. سوف تختلف اعتمادا على إعدادات الظروف التجريبية.

ملاحظة: لحل يتميز نطاق وغرامة 40X 63X العدسات والغمر النفط (0.1 ملم مسافة العمل) كما استخدمت بنجاح في هذه الطريقة، على الرغم من أنها تحد من عمق التركيز.

4. تحليل

لتحليل الأطر، ض المداخن أو الأفلام استيراد ملفات البيانات إلى فيجي، والتي لديها أدوات فعالة للعرض، وقياس، وتعديل ملفات للعرض ^14. على سبيل المثال تم قياس الوقت لاستكمال الانقسام باستخدام الفاصل الزمني أخذ العينات ومتعددة الأبعاد ومتصفح الصور إلى الخطوة من خلال الأطر بينما يراقب خلية من الطور الأول إلى الطور النهائي. س، ويمكن قياس أبعاد ض ص، وباستخدام أداة القياس. للحصول على تعليمات مفصلة عن البرنامج واستخدامهانظر: http://fiji.sc/Fiji.

النتائج

الخلايا في ظهائر كاذب، مثل ذبابة الفاكهة النامية العين، أو طبقة البطين للنظام العصبي المركزي الفقاريات النامية، الخضوع الحركات النووية، ووصف الهجرة النووية interkinetic، في الوقت المناسب مع دورة الخلية. يحدث تكرار الحمض النووي عندما نوى هي عند أو بالقرب من سطح ا?...

Discussion

لتصور، وقياس، وتحديد ملامح تقسيم الخلايا، والتنمية المطلوبة لإعداد بسيطة لمراقبة الانقسام في الجناح العذراء تعيش ذبابة الفاكهة عن طريق تحليل متحد البؤر من His2AvGFP معربا عن الخلايا. وقد استخدم هذا الأسلوب لتوثيق أن دورة الخلية في الجناح العذراء تحمل أوجه التشابه ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly stuff fly pad	Genesee Scientific	59-114	for fly anesthetization
CO2 gas	Airgas South	CD50	For fly anesthetization
Regulator	Airgas South		CO2 regulator
Fly vials	Genesee Scientific	32-113RLBF	Fly culture
Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773)	Bloomington Stock Center
Glass bottom dishes #1 1/2	WillCo Wells BV		For microscopy
Thiodiethylene Glycol	Fluka	88559	mountant
Modeling clay	art supply store		Support to position pupae against
Paintbrushes	art supply store		To manipulate flies
Fine Forceps, Inox #5	Fine Science Tools	11252-20	Dumont #5
computer	any		8 Gb RAM for image/movie analysis
Fiji software		Free ware http://fiji.sc/Fiji	Image analysis software
Confocal microscope			Any fast scanning confocal should be sufficient
20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses	any		For imaging tissue, cellular, and subcellular features
Immersion oil (nonfluorescent)
Stereomicroscope	any		For fly manipulation