通过影像学的蛹壳<em&gt;果蝇</em

摘要

本文演示了如何使用直接通过蛹壳快速扫描共聚焦显微镜对细胞图像的行为。将其留在蛹壳完好无损，此方法允许观察和动态细胞过程的测量在果蝇发育的阶段，是很难直接学习。

摘要

长期以来利用果蝇作为模型细胞和发育生物学取得了一系列工具。总之，这些技术已成功地从各种方法论的角度细胞和发育生物学的分析。实时成像是动态观察细胞过程，如细胞分裂或细胞运动的一个新兴的方法。经分离的突变未知推测细胞周期蛋白成为必不可少使用实时成像，观察有丝分裂原位 。在果蝇中最实时成像研究都集中在那些由于它们的小尺寸和光学清晰度访问操作和观察的萌芽阶段。然而，在这些阶段的细胞周期是不寻常的，因为它缺少一个间隙阶段或两者。相比之下， 果蝇蛹翼的细胞具有典型的细胞周期并经过一段快速的有丝分裂横跨约20小时，蛹的发展。很容易我找出并隔离适当阶段蛹赶在有丝分裂原 。安装完好蛹成像过程中提供易处理性和耐用性的最佳组合，使实验来进行数小时对细胞和动物存活率的影响降至最低。该方法允许观测的特征一样小，或小于飞染色体。的显微镜设置和安装的细节调整，允许延长制剂的可视化相邻小区的膜动力学和荧光标记的蛋白，如微管蛋白。此方法适用于所有测试的荧光蛋白，可以在各种时间尺度的把握亚微米尺度特征。虽然仅限于外20微米的蛹与传统的共聚焦显微镜，这种方法观察蛋白质和细胞动力学在蛹体内的组织一般可有用细胞和发育生物学在这些组织的研究。

引言

醋蝇， 果蝇 ，是一种行之有效的模型用于研究生物学的许多方面。 果蝇的研究具有遗传实验的丰富的历史，使基因操作的复杂形式，包括表达，敲除和基因突变。同的荧光蛋白标记的出现，这个曲目已经扩大到包括细胞和蛋白质的研究在活的动物。在果蝇胚胎是一个很好的系统，这样的研究，因为它是小，光学透明的，允许深，高分辨率成像在体内 ^1-3。飞发展的其他阶段已被证明是易于处理的少，需要麻醉^4，解剖和短期培养^5,6或增设在角质层成像^7,8窗口。这些操作通常是妥协的动物发展的长期或影响动物的方式，限制了成像时间很短。

ENT“>为了研究新的突变基因中像细胞周期调控，有必要找到一个适当的准备，以研究细胞周期的时序和保真度。由于大多数胚胎细胞周期截断（SM或S-G2-M）和所研究的突变体没有表现出缺陷，直到后期，观察细胞周期中蛹期的组织是很重要的。上皮细胞在蛹有一个更典型的G1-S-G2-M期细胞周期和现阶段的蛹是不能够肌肉运动^9。初始起点操作包含完整的整体蛹表达Histone2AV-GFP。尽管蛹壳的表观不透明度，这完好制剂被证明是优良的长期的体内成像，这种技术是简单以至于本科生科研人员经常使用它来 ​​研究细胞和发育生物学果蝇的方面，但分辨率是好的足以让的微米尺度特征歧视。用这种方法，过小时，分钟或秒事件的观察是可能简单地通过调节时间序列的参数。使用蓝色，绿色，黄色，橙色，和红色荧光蛋白，或这些的组合的视频，已经作出。重要的是，如果小心，尽量减少激光强度，甚至长期成像对发展的动物或生存没有影响。

研究方案

1。飞工作

1. 保持苍蝇在室温下^10个标准玉米面-琼脂糖蜜酵母培养基。
2. 对于十字架，隔离在6小时羽化的处女。穿越到所需基因型的男性后，改变飞行到新瓶每3-4天。

注：对于这些实验，Gal4的线A9被用来驱动转基因的表达在边路。飞股份与股票中心布卢明顿获得。在这些实验中使用的股票包括A9-GAL4（BL＃8761），His2Av-GFP（BL＃5941），在sco / CYO HsCre（BL＃1092），UAS-ChRFP-浴池（BL＃25773），lollibow ^11。

2。选择和蛹的安装

1. 蛹阶段无论是通过收集它们作为白色预蛹（WPP），保证它们在25℃，直至达到适当的年龄或使用形态学标准^12。
2. 观察细胞分裂，选择蛹最近经历头外翻。从这时起，直到刚刚羽化（在> 96小时）之前，蛹是不动的，允许延长时间推移观察。
3. 先接触他们用沾有水的画笔，等待一分钟，让水松粘合，然后轻轻地督促他们到画笔从瓶中取出蛹。
4. 轻轻地用刺戳它们与在水中的画笔除去唾液腺粘合剂和食物颗粒洗选定蛹。
5. 转让清洁蛹到25毫米培养皿盖玻片底（数量1个半盖玻片）。
6. 采用细条或者橡皮泥或牙科用蜡作为支撑的，安装蛹，让感兴趣的组织是最接近盖玻片。
   注意：在这里描述的研究，蛹翅膀，脚，腹部histoblasts或背侧notum已经观察到。在实践中，在20微米蛹壳的表面上的任何组织的观察。
7. 东方蛹小心，这样的布甲电子商务的兴趣是平行于玻璃盖玻片表面。
8. 一旦蛹安装，使用画笔来一层薄薄的硫代二甘醇（TDG）的转移到蛹和盖玻片之间的空间。

注意：TDG减少表面散射，石油的折射率相匹配，并允许氧气渗入组织^13。使用油不建议，因为他们往往​​剥夺氧气的组织，引起细胞行为的迅速停止。

3。成像

注意：对于成像，共焦显微镜很可能是必要的，因为在共焦除去大部分遮蔽背景所造成的蛹壳的强烈照明。

1. 调整的共聚焦设置以最小化照明对蛹发育和存活的影响。要做到这一点，罢工的激励强度和收集的敏感性之间的平衡。成像无线的典型配置第徕卡SP5中使用的共振扫描器（8000赫兹），激光功率设定为2％（20％的功率的10％透射率），针孔设定为120微米，行平均设置为8。设置将取决于实验条件而变化。

注意：要解决精细尺度特征40X和63X油浸镜头（0.1毫米的工作距离）也已成功应用于这种方法，虽然他们限制焦深。

4。分析

为了分析框架，Z-堆栈或电影导入数据文件到斐济，其中有有效的工具来查看，测量和修改文件简报^14。例如时间完成有丝分裂使用采样间隔和多维图像浏览器来浏览帧一边看从前期的细胞，以末期进行测定。 x轴，y-和z-维度可使用测量工具来测量。有关软件及其使用的详细说明见：http://fiji.sc/Fiji。

结果

细胞的假复层上皮，如显影果蝇眼睛，或显影脊椎动物中枢神经系统的心室层，经历核运动，称为interkinetic核迁移，在时间上与细胞周期。当核是在或接近基底表面和细胞进入有丝分裂时细胞核到达顶端面^15,16发生DNA的复制。在头外翻后的前几个小时，蛹翼细胞形成一个快速分裂的单层上皮。收集在XYZT模式的数据从早期蛹翼，采取每节2微米以1分钟的间隔。在所得到的3D电影有丝分?...

讨论

可视化，测量和量化分裂细胞的功能，用于通过His2AvGFP表达细胞共聚焦分析的方法观察有丝分裂的果蝇蛹生活机翼的简单准备所需的开发。这种方法被用来记录该细胞周期中的蛹翼熊强的相似性对细胞周期的假复层上皮细胞中的细胞核转移到他们进入有丝分裂的上皮细胞的顶面。以下末期，核回落到上皮细胞层。因此，这种单层，显然不分层上皮细胞，显示的单元格的限制interkinetic核迁移?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly stuff fly pad	Genesee Scientific	59-114	for fly anesthetization
CO2 gas	Airgas South	CD50	For fly anesthetization
Regulator	Airgas South		CO2 regulator
Fly vials	Genesee Scientific	32-113RLBF	Fly culture
Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773)	Bloomington Stock Center
Glass bottom dishes #1 1/2	WillCo Wells BV		For microscopy
Thiodiethylene Glycol	Fluka	88559	mountant
Modeling clay	art supply store		Support to position pupae against
Paintbrushes	art supply store		To manipulate flies
Fine Forceps, Inox #5	Fine Science Tools	11252-20	Dumont #5
computer	any		8 Gb RAM for image/movie analysis
Fiji software		Free ware http://fiji.sc/Fiji	Image analysis software
Confocal microscope			Any fast scanning confocal should be sufficient
20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses	any		For imaging tissue, cellular, and subcellular features
Immersion oil (nonfluorescent)
Stereomicroscope	any		For fly manipulation