Imaging Durch die Puppenhülle von<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Zusammenfassung

Dieses Papier zeigt die Verwendung eines schnellen konfokalen Mikroskop, um Bildzelle Verhalten direkt durch die Puppenhülle. Nach dem Verlassen der Puppenhülle intakt ist, erlaubt dieses Verfahren die Beobachtung und Messung von dynamischen Zellprozesse im Stadium der Drosophila-Entwicklung, die schwer direkt zu studieren.

Zusammenfassung

Der langjährige Einsatz von Drosophila als Modell für Zell-und Entwicklungsbiologie hat eine Reihe von Tools ergab. Gemeinsam haben diese Techniken Analyse von Zell-und Entwicklungsbiologie aus einer Vielzahl von methodischen Blickwinkeln ermöglicht. Echtzeit-Bildgebung ist eine neue Methode zur Beobachtung dynamischer Zellprozesse, wie Zellteilung oder Zellbeweglichkeit. Nachdem in uncharacterized mutmaßlichen Zellzyklus-Proteine ​​wurde es wichtig, Mitose in situ zu beobachten mit Live-Aufnahmen isoliert Mutationen. Die meisten Live-Imaging-Studien in Drosophila haben sich auf die embryonalen Stadien, die wegen ihrer geringen Größe und optische Klarheit zugänglich Manipulation und Beobachtung sind konzentriert. In diesen Phasen des Zellzyklus wird jedoch ungewöhnlich, dass es eine oder beide der Spalt Phasen fehlt. Im Gegensatz dazu haben Zellen des Puppen Flügel von Drosophila eine typische Zellzyklus und eine Zeit des schnellen Mitose sich über etwa 20 Stunden der Puppenentwicklung zu unterziehen. Es ist leicht zu iekb.html und zu isolieren, Puppen der geeigneten Stadium der Mitose in situ zu fangen. Montage intakt Puppen, sofern die beste Kombination aus Handhabbarkeit und Haltbarkeit während der Bildgebung, so dass Experimente für mehrere Stunden mit minimalen Auswirkungen auf Zell-und Tier Rentabilität führen. Das Verfahren ermöglicht die Beobachtung der Merkmale so klein wie oder kleiner als, fly-Chromosomen. Anpassung der Einstellungen des Mikroskops und die Details der Montage erlaubt Verlängerung der Herstellung von Membran Dynamik benachbarter Zellen und fluoreszenzmarkierte Proteine, wie Tubulin visualisieren. Diese Methode funktioniert für alle getesteten fluoreszierende Proteine ​​und Submikrometerbereich Funktionen über eine Vielzahl von Zeitskalen zu erfassen. Während an der äußeren 20 um der Puppe mit einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop beschränkt ist, kann dieser Ansatz zur Beobachtung Protein und Zelldynamik im Puppen Geweben in vivo allgemein bei der Untersuchung von Zell-und Entwicklungsbiologie in diesen Geweben nützlich sein.

Einleitung

Der Essig, Drosophila melanogaster, ist ein gut etabliertes Modell für die Untersuchung viele Aspekte der Biologie. Drosophila Forschung hat eine reiche Geschichte von genetischen Experimenten, die anspruchsvolle Formen der Genmanipulation einschließlich der Expression, Knockdown und Mutation ermöglicht. Mit dem Aufkommen des fluoreszierenden Proteins Etiketten, hat dieses Repertoire erweitert, um Untersuchungen von Zellen und Proteinen in lebenden Tieren umfassen. Die Fliegenembryo ist ein ausgezeichnetes System für solche Studien, wie sie ist klein und optisch klar so tief, hochauflösende Bildgebung in vivo ^03.01. Andere Stadien der Fliege Entwicklung haben sich als weniger gefügig, Betäubung ^4, Dissektion und Kurzzeitkultur ^5,6, oder die Erstellung von Fenstern in der Kutikula für die Bildgebung ^7,8 erfordern. Diese Manipulationen in der Regel Kompromisse Tier Entwicklung auf lange Sicht beeinflussen oder das Tier in einer Weise, die Bildgebung, um kurze Zeiträume zu begrenzen.

ent "> Um neue Mutationen in Genen, die Zellzyklusregulatoren ähneln studieren, war es wichtig, eine angemessene Vorbereitung auf das Timing und die Treue des Zellzyklus zu studieren finden. Da die meisten embryonalen Zellzyklen verkürzt sind (SM oder S-G2-M) und die Mutanten unter-Studie nicht zeigen, bis Mängel späteren Stadien, war es wichtig, den Zellzyklus in Puppenstadium Gewebe zu beobachten. Epithelzellen in der Puppe haben eine typische G1-S-G2-M Zellzyklus und Puppen dieser Stufe sind nicht in der Lage Muskelbewegungen ^9. Der Anfangspunkt für Manipulationen enthalten intakte ganze Puppen-GFP exprimieren Histone2AV. Trotz der scheinbaren Opazität des Puppenhülle erwies sich diese intakt Zubereitung hervorragende langfristige in-vivo-Bildgebung zu sein. Diese Technik ist einfach genug, dass Bachelor-Forscher nutzen es regelmäßig, um Aspekte der Zell-und Entwicklungsbiologie in Drosophila zu untersuchen und doch ist die Auflösung fein genug, um die Diskriminierung von Mikrometerskala Funktionen ermöglichen. Mit diesem Verfahren sind Beobachtungen von Veranstaltungen über Stunden, Minuten oder Sekunden einfach durch Einstellen Zeitreihen-Parameter möglich. Videos mit blau, grün, gelb, orange und rot fluoreszierende Proteine ​​oder Kombinationen von diesen, durchgeführt wurden. Wichtig ist, dass, wenn darauf geachtet werden, um die Laserintensität zu minimieren, auch langfristige Bildgebung hat keine Wirkung auf die Entwicklung oder die Lebensfähigkeit der Tiere.

Protokoll

1. Fly Arbeits

1. Pflegen Fliegen auf Standard-Maismehl-Agar-Melasse-Hefe-Medium bei Raumtemperatur ^10.
2. Für Kreuze, zu isolieren Jungfrauen innerhalb von 6 h Schlüpfen. Nach der Überfahrt auf die Männer des gewünschten Genotyp, fliegt Wechsel zu neuen Fläschchen alle 3-4 Tage.

Hinweis: Für diese Experimente Gal4 Linie A9 wurde verwendet, um die Expression der Transgene in den Flügel zu fahren. Fly-Aktien aus dem Aktien Zentrum in Bloomington erhalten werden. Aktien in diesen Experimenten verwendet werden, umfassen A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), Sco / Cyo HsCre (Bl # 1092), FH-ChRFP-Tub (Bl # 25773), ¹¹ lollibow.

2. Auswahl und Montage der Puppen

1. Bühnen Puppen entweder als weiße prepupae (WPP) Sammeln sie und halten sie bei 25 ° C, bis sie das entsprechende Alter erreichen oder durch Verwendung von morphologischen Kriterien ^12.
2. Um Zellteilungen, wählen Puppe, die vor kurzem Kopf Eversion unterzogen wurden, zu beobachten.Von dieser Zeit bis kurz vor dem Schlüpfen (bei> 96 Stunden), sind Puppen unbeweglich und erhöht so die Zeitraffer-Beobachtung.
3. Entfernen Puppen aus den Fläschchen, die sie zuerst berühren mit einem Pinsel mit Wasser befeuchtet, wartet auf eine Minute, damit das Wasser, um den Klebstoff vorsichtig lockern und dann stupste sie auf den Pinsel.
4. Vorsichtig waschen ausgewählt Puppen durch Stoßen sie mit einem Pinsel in Wasser, um die Speicheldrüse Klebstoff und Speisereste zu entfernen.
5. Übertragen sauber Puppen auf ein 25 mm Petrischale mit einem Deckglas unten (Nummer 1 ½ Deckgläser).
6. Mit dünnen Streifen von entweder Knete oder Dentalwachs als Träger montieren Puppen so dass das Gewebe in der Umgebung ist in der Nähe des Deckglases.
   Hinweis: Bei den hier beschriebenen Untersuchungen, Puppen Flügel, Beine, Bauch-oder Rücken histoblasts Notum beobachtet. In der Praxis ist jedes Gewebe innerhalb von 20 um die Oberfläche der Puppenhülle zu beobachten.
7. Orient Puppen sorgfältig, so dass die tissue von Interesse ist parallel zu der Deckglas Oberfläche.
8. Sobald Puppen montiert sind, verwenden Sie einen Pinsel, um eine dünne Schicht Thiodiethylenglykol (TDG) in den Raum zwischen der Puppe und dem Deckglas übertragen.

Hinweis: TDG reduziert die Oberflächenstreuung, dem Brechungsindex von Öl und Sauerstoff ermöglicht, um das Gewebe ¹³ zu durchdringen. Verwendung von Ölen ist nicht zu empfehlen, da sie dazu neigen, die Gewebe mit Sauerstoff zu entziehen, was eine schnelle Einstellung der Zellverhalten.

3. Imaging

Hinweis: Für die Bildgebung, dürfte wesentlich zu sein als die Konfokalität entfernt die meisten der Verdunkelung Hintergrund durch intensive Beleuchtung der Puppenhülle verursacht ein konfokales Mikroskop.

1. Anpassen der Einstellungen auf der konfokalen, um die Auswirkungen der Beleuchtung auf Puppenentwicklung und Lebensfähigkeit zu minimieren. Um dies zu tun, ein Gleichgewicht zwischen der Intensität der Anregung und der Empfindlichkeit der Kollektion. Eine typische Konfiguration für die Bildgebung witen der Leica SP5 verwendet die Resonanzscanner (8000 Hz), Laserleistung auf 2% (10% Lichtdurchlässigkeit von 20% Leistung), Lochkamera-Set bis 120 um und Zeilenmittelung auf 8 gesetzt. Einstellungen werden abhängig von experimentellen Bedingungen variieren.

Hinweis: Um zu beheben Feinwaage verfügt 40X und 63X Ölimmersionslinsen (0,1 mm Arbeitsabstand) wurden ebenfalls erfolgreich in diesem Verfahren verwendet, obwohl sie die Schärfentiefe zu begrenzen.

4. Analyse

Um Rahmen zu analysieren, z-Stapel oder Filme importieren die Datendateien auf Fidschi, die effektive Werkzeuge für die Anzeige, Messung und Ändern von Dateien für die Präsentation ¹⁴ hat. Zum Beispiel Zeit, um die Mitose zu vervollständigen wurde mit der Sampling-Intervall und multidimensionale Bild-Browser, um durch Rahmen Schritt, während Sie eine Zelle aus, um Prophase Telophase gemessen. x-, y-und z-Abmessungen mit dem Messinstrument gemessen werden. Detaillierte Anweisungen auf der Software und ihre Verwendungsiehe: http://fiji.sc/Fiji.

Ergebnisse

Zellen in mehrreihigen Epithelien, wie die Entwicklung von Drosophila Auge oder der ventrikulären Schicht des Entwicklungswirbel zentralen Nervensystems, zu unterziehen Atombewegungen bezeichnet interkinetic Kern Migration in der Zeit mit dem Zellzyklus. DNA-Replikation auftritt, wenn Kerne sind an oder nahe der Basisfläche und Zellen Mitose eintreten, wenn die Kerne der apikalen Oberfläche ^15,16 erreichen. Die Puppen Flügel Zellen bilden eine sich schnell teilenden Monoschicht Epithel während d...

Diskussion

Um sichtbar zu machen, zu messen und zu quantifizieren Merkmale des teilenden Zellen, erforderliche Entwicklung eines einfachen Vorbereitung für die Beobachtung der Mitose in der lebenden Puppen Flügel der Drosophila mittels konfokaler Analyse His2AvGFP exprimierenden Zellen. Diese Methode wurde verwendet, um zu dokumentieren, dass der Zellzyklus in der Puppen Flügel trägt starke Ähnlichkeiten mit Zyklen in mehrreihigen Epithelien in dieser Kerne Umzug in die apikale Oberfläche des Epithels, wo sie Mitose...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly stuff fly pad	Genesee Scientific	59-114	for fly anesthetization
CO2 gas	Airgas South	CD50	For fly anesthetization
Regulator	Airgas South		CO2 regulator
Fly vials	Genesee Scientific	32-113RLBF	Fly culture
Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773)	Bloomington Stock Center
Glass bottom dishes #1 1/2	WillCo Wells BV		For microscopy
Thiodiethylene Glycol	Fluka	88559	mountant
Modeling clay	art supply store		Support to position pupae against
Paintbrushes	art supply store		To manipulate flies
Fine Forceps, Inox #5	Fine Science Tools	11252-20	Dumont #5
computer	any		8 Gb RAM for image/movie analysis
Fiji software		Free ware http://fiji.sc/Fiji	Image analysis software
Confocal microscope			Any fast scanning confocal should be sufficient
20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses	any		For imaging tissue, cellular, and subcellular features
Immersion oil (nonfluorescent)
Stereomicroscope	any		For fly manipulation