Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Özet

Bu kağıdı doğrudan puparium aracılığıyla görüntü hücre davranışı hızlı bir tarama konfokal mikroskop kullanımını gösterir. Sağlam pupa davayı bırakarak, bu yöntem doğrudan çalışma zordur Drosophila bir gelişme aşamasında gözlem ve dinamik hücre süreçlerinin ölçülmesini sağlar.

Özet

Hücre ve gelişim biyolojisi için bir model olarak Drosophila uzun süredir devam eden kullanım araçları bir dizi vermiştir. Birlikte, bu teknikler metodolojik açılardan çeşitli hücre ve gelişim biyolojisi analizini sağlamıştır. Canlı görüntüleme, hücre bölünmesi ya da hücre hareketi gibi dinamik hücre süreçlerini, gözlem için gelişmekte olan bir yöntemdir. Canlı görüntüleme kullanarak yerinde mitoz gözlemlemek için gerekli oldu uncharacterized farazi hücre döngüsü proteinleri mutasyonlar izole olması. Drosophila en canlı görüntüleme çalışmaları nedeniyle küçük boyutu ve optik netlik manipülasyon ve gözlem için erişilebilir embriyonik aşamalarında odaklanmıştır. Bu boşluk fazlarının biri ya da her ikisi yoksun olmasıyla Ancak, bu aşamada, hücre döngüsü sıra dışıdır. Buna karşılık, Drosophila pupa kanadının hücreleri, tipik bir hücre döngüsü ve pupa gelişme, yaklaşık 20 saat süren hızlı bir mitoz bir süre geçer. Bu i kolaydentify ve yerinde mitoz yakalamak için uygun sahnenin pupa izole. Montaj sağlam pupa deneyleri, hücre ve hayvan canlılığı üzerinde minimum etki ile birkaç saat çalışmasına izin veren, görüntüleme sırasında tractability ve dayanıklılık en iyi kombinasyonu sağladı. Yöntem olarak küçük, ya da daha küçük, kromozom sinek gibi özellikleri gözlem sağlar. Mikroskop ayarları ve montaj detayları ayarlanması, preparasyonun dahili zar komşu hücrelerin dinamiklerini ve bu tübülin gibi flüoresan etiketli proteinlerin görselleştirmek bırakıldı. Bu yöntem test edilen tüm floresan proteinleri için çalışıyor ve zaman ölçekleri çeşitli üzerinden Mikronaltı ölçek özelliklerini yakalayabilir. Geleneksel bir konfokal mikroskop ile pupa dış 20 um ile sınırlı olsa da, in vivo pupa dokularda protein ve dinamikleri hücresel gözlem için bu yaklaşım, bu hücre ve dokularda gelişimsel biyoloji çalışmaya genel olarak yararlı olabilir.

Giriş

Sirke sineği, Drosophila melanogaster. Drosophila araştırma anlatım, demonte ve mutasyonunu içeren gen manipülasyonu sofistike formları sağlar genetik deney zengin bir geçmişe sahiptir biyoloji birçok yönleriyle inceleyerek için iyi kurulmuş bir modeldir. Floresan proteini etiket gelişiyle, bu repertuar yaşayan hayvanlar hücre ve proteinlerin çalışmaları kapsayacak şekilde genişletti. Sinek embriyo in vivo ^1-3 derin, yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan küçük ve optik net gibi çalışmalar için mükemmel bir sistemdir. Sinek gelişme diğer aşamaları anestezi ^4, diseksiyon ve kısa vadeli kültürünü ^5,6 veya ^7,8 görüntüleme için manikür pencerelerin oluşturulmasına gerektiren, daha az uysal olduğu kanıtlanmıştır. Bu manipülasyonlar, genellikle uzun vadede hayvan gelişimi uzlaşma ya da kısa süreler için görüntüleme sınırı şekillerde hayvan etkiler.

En embriyonik hücre siklusu kesiliyor yana hücre siklus düzenleyicileri benzer genlerinde mutasyon roman incelemek için ent "> bu. hücre döngüsünün zamanlaması ve sadakat incelemek için uygun bir hazırlık bulmak için gerekli olan (SM veya S-G2-M) ve çalışma kapsamında mutantlar ileriki evrelere kadar, bu pupa aşaması dokularda hücre döngüsünü gözlemlemek için önemli kusurları görünmüyor. pupa epitel hücreleri daha tipik bir G1-S-G2-M hücre döngüsü ve bu aşamada pupa olan var kas hareketleri ⁹ yeteneğine sahip değildir. manipülasyonlar için başlangıç ​​noktası pupa davanın belirgin donukluk rağmen Histone2AV-GFP ifade bozulmamış bütün pupa. dahil, bu bozulmamış hazırlık vivo görüntüleme uzun vadede mükemmel olduğunu kanıtladı. Bu teknik basittir lisans araştırmacılar rutin Drosophila hücre ve gelişim biyolojisi yönlerini incelemek için kullanabilirsiniz ve henüz çözünürlük mikrometre ölçekli özellikleri ayrımcılığı sağlayacak kadar gayet yeterli. Bu yöntemle, saat, dakika veya saniye içinde olayların gözlemleri sadece zaman serisi parametrelerini ayarlayarak mümkündür. Mavi, yeşil, sarı, turuncu ve kırmızı floresan proteinleri, veya bunların kombinasyonları kullanılarak Videolar yapılmıştır. Önemli olarak, eğer bakım hatta uzun süreli görüntüleme hayvanların geliştirme veya canlılığı üzerinde bir etkisi yoktur, lazer yoğunluğu en aza indirmek için alınır.

Protokol

1.. Çalışma Fly

1. Oda sıcaklığında ¹⁰ standart mısır unu-agar-pekmez-maya ortamda sinekler koruyun.
2. Haçlar için, eclosion 6 saat içinde bakireler izole. Istenen genotip erkeklere geçtikten sonra, değişim her 3-4 günde yeni şişelere uçar.

Not: Bu deneyler için, Gal4 hat A9 kanat transgenlerin anlatımını sürmek için kullanılmıştır. Fly stokları Bloomington stok merkezinden elde edilebilir. Bu deneylerde kullanılan Hisse A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), SCO / cyo HsCre (Bl # 1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl # 25773), ^11, lollibow içerir.

2. Seçimi ve Pupa ve montajı

1. Sahne pupa ya beyaz prepupa (RES) olarak toplanması ve bunların uygun yaşa gelinceye kadar 25 ° C'de tutarak veya morfolojik kriterlere ^12. kullanarak.
2. Hücre bölünmeleri, son zamanlarda baş tersine çevrilmesi uğramıştır seçeneğini pupa gözlemlemek için.Bu zaman kadar sadece eclosion (en> 96 saat) önce, pupa hareketsiz uzun time-lapse gözlem izin vardır.
3. Önce su fırça üzerine onları dürterek yavaşça yapışkan gevşetmek ve izin için bir dakika bekleyen, su ile nemlendirilmiş bir fırça ile onlara dokunarak flakonlarından pupa çıkarın.
4. Yavaşça tükürük bezi yapıştırıcı ve gıda parçacıkları uzaklaştırmak için su içinde bir boya fırçası ile dürtüyordu seçilir pupa yıkayın.
5. Bir lamel altındaki (sayı 1 ½ lamelleri) ile bir 25 mm Petri kabı temiz pupa aktarın.
6. Ilgilenilen doku lamel en yakın olan, böylece bir destek olarak modelleme kil ya da diş balmumu ya da ince şeritler kullanılarak, pupa monte edin.
   Not: Burada anlatılan çalışmalarda, pupa kanatlar, bacaklar, karın histoblasts veya dorsal notum gözlenmiştir. Uygulamada, pupa durumda yüzeyinin 20 mikron olan bir doku gözlemlenebilir.
7. Orient pupa dikkatlice böylece tissuilgi e cam lamel yüzeyine paralel.
8. Pupa monte edildikten sonra, pupa ve lamel arasındaki boşluğa tiodietilen glikol (TDG) ince bir tabaka aktarmak için bir fırça kullanın.

Not: TDG, yüzeye dağılımını azaltır yağın kırılma indeksi ile eşleşir ve oksijen doku ¹³ nüfuz sağlar. Bu hücre davranışlar hızlı durmasına neden olan, oksijenin dokulara mahrum eğilimi gibi yağlar kullanılması tavsiye edilmez.

3. Görüntüleme

Not: görüntüleme için, konfokal mikroskop confocality pupa durumda yoğun aydınlatma neden obscuring arka çoğunu çıkarır gibi önemli olması muhtemeldir.

1. Pupa gelişimi ve canlılığı üzerindeki aydınlatma etkisini en aza indirmek için konfokal ayarlarını. Bunu yapmak için, uyarma yoğunluğu ve toplama duyarlılığı arasında bir denge. Görüntüleme wi için tipik bir yapılandırmaLeica SP5 rezonans tarayıcı (8,000 Hz),% 2 olarak ayarlanmış lazer gücü (% 20 güç,% 10 geçirgenlik), 120 um iğne deliği grubu, ve hat 8 için kullanılan kurulu ortalama th. Ayarlar deney koşullarına bağlı olarak değişecektir.

Not: ince ölçek onlar odak derinliğini sınırlamak olsa da başarılı, bu yöntem kullanılmıştır 40X ve 63X Petrol daldırma lens (0,1 mm çalışma mesafesi) bulunmaktadır gidermek için.

4. Analiz

Çerçeveleri analiz etmek için, z-yığınları ya da film, izleme, ölçme ve sunum ¹⁴ için dosyaları değiştirmek için etkili araçlar vardır FIJI, veri dosyalarını içe. Örneğin mitoz tamamlamak için zamanı telofaz için profazın bir hücreyi izlerken kare ilerlemek için örnekleme aralığı ve çok boyutlu görüntü tarayıcı kullanılarak ölçüldü. x-, y-ve z-boyutları ölçme aracı kullanılarak ölçülebilir. Yazılım ve kullanımı hakkında ayrıntılı talimatlar içinbkz: http://fiji.sc/Fiji.

Sonuçlar

Gibi gelişmekte olan Drosophila göz, omurgalı ya da gelişmekte olan merkezi sinir sistemi içinde, ventriküler tabaka olarak yalancı epitel hücreler, nükleer hareketleri geçmesi, hücre döngüsü ile zaman içinde, interkinetic nükleer göç adlandırılır. Çekirdekler bazal yüzeyinde veya yakınında ve çekirdekler apikal yüzeye ^15,16 ulaştığınızda hücrelerin mitoz girdiğinde DNA replikasyonu oluşur. Pupa kanat hücreler kafa eversiyonu sonra ilk birkaç saat boyunca bir hız...

Tartışmalar

Bölünen hücrelerin özellikleri, His2AvGFP ifade eden hücrelerin konfokal analizi ile Drosophila canlı pupa kanadında mitoz gözlemlemek için basit bir hazırlama gerekli geliştirme, görselleştirmek ölçmek ve ölçmek için. Bu yöntem, pupa kanadında hücre döngüsü onlar mitoz girmek epitelin apikal yüzeyine o çekirdekler hareket yalancı epiteliada döngüleri hücre güçlü benzerlikler taşıdığını belgelemek için kullanılmıştır. Telofaz ardından, çekirdekler geri epitel tabaka...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly stuff fly pad	Genesee Scientific	59-114	for fly anesthetization
CO2 gas	Airgas South	CD50	For fly anesthetization
Regulator	Airgas South		CO2 regulator
Fly vials	Genesee Scientific	32-113RLBF	Fly culture
Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773)	Bloomington Stock Center
Glass bottom dishes #1 1/2	WillCo Wells BV		For microscopy
Thiodiethylene Glycol	Fluka	88559	mountant
Modeling clay	art supply store		Support to position pupae against
Paintbrushes	art supply store		To manipulate flies
Fine Forceps, Inox #5	Fine Science Tools	11252-20	Dumont #5
computer	any		8 Gb RAM for image/movie analysis
Fiji software		Free ware http://fiji.sc/Fiji	Image analysis software
Confocal microscope			Any fast scanning confocal should be sufficient
20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses	any		For imaging tissue, cellular, and subcellular features
Immersion oil (nonfluorescent)
Stereomicroscope	any		For fly manipulation