Imagerie à travers le cas de la nymphe<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Résumé

Ce document illustre l'utilisation d'un balayage rapide microscope confocal à un comportement cellulaire de l'image directement à travers la pupe. En laissant la coque de nymphose intacte, cette méthode permet l'observation et la mesure des processus dynamiques de cellule à un stade de développement de la drosophile qui est difficile à étudier directement.

Résumé

L'utilisation de longue date de la drosophile comme modèle pour la biologie cellulaire et de développement a donné une gamme d'outils. Ensemble, ces techniques ont permis l'analyse de cellules et de la biologie du développement à partir d'une variété d'angles méthodologiques. Imagerie en temps réel est une nouvelle méthode pour l'observation des processus dynamiques de cellule, telles que la division cellulaire ou de la motilité cellulaire. Après avoir isolé des mutations dans les protéines du cycle cellulaire putatifs non caractérisés, il est devenu essentiel d'observer la mitose in situ en utilisant l'imagerie en direct. La plupart des études d'imagerie en direct chez la drosophile ont porté sur les stades embryonnaires qui sont accessibles à la manipulation et l'observation en raison de leur petite taille et de clarté optique. Toutefois, dans ces phases du cycle cellulaire est inhabituel en ce qu'il manque une ou deux des phases de l'écart. En revanche, les cellules de l'aile des pupes de la drosophile ont un cycle cellulaire typique et subissent une période de mitose rapide couvrant environ 20 h de développement des pupes. Il est facile d'identify et isoler les nymphes de la scène appropriée pour attraper la mitose in situ. Montage pupes intact offrait la meilleure combinaison de traçabilité et de durabilité lors de l'imagerie, permettant des expériences de courir pendant plusieurs heures avec un impact minimal sur la cellule animale et la viabilité. La méthode permet l'observation de caractéristiques aussi petites ou plus petites que, voler chromosomes. Ajustement des réglages du microscope et les détails de montage, a permis l'extension de la préparation de visualiser la dynamique des membranes des cellules adjacentes et les protéines marquées par fluorescence tels que la tubuline. Cette méthode fonctionne pour toutes les protéines fluorescentes testé et peut capturer submicroniques caractéristiques d'échelle sur une variété d'échelles de temps. Bien que limitée à l'extérieur de 20 um de la nymphe avec un microscope confocal classique, cette approche à l'observation de protéines et dynamique cellulaires dans les tissus des pupes in vivo peut être généralement utile dans l'étude de la biologie cellulaire et de développement dans ces tissus.

Introduction

La mouche du vinaigre, Drosophila melanogaster, est un modèle bien établi pour étudier de nombreux aspects de la biologie. Recherche Drosophila a une riche histoire de l'expérimentation génétique qui permet des formes plus sophistiquées de manipulation de gènes dont l'expression, démontable et mutation. Avec l'avènement des étiquettes de protéines fluorescentes, ce répertoire a été élargi pour inclure des études sur des cellules et des protéines chez les animaux vivants. L'embryon de mouche est un excellent système pour les études qu'elle est petite et optiquement clair permettant profonde, haute résolution imagerie in vivo ^1-3. D'autres étapes du développement de la mouche se sont avérées moins docile, nécessitant anesthésie ^4, la dissection et de la culture à court terme ^{de 5,6,} ou la création de fenêtres de la cuticule pour l'imagerie ^7,8. Ces manipulations compromettent généralement le développement animal à long terme ou affectent l'animal de manière à limiter l'imagerie pour de courtes périodes.

ent "> Pour étudier de nouvelles mutations dans les gènes qui ressemblent à des régulateurs du cycle cellulaire, il est essentiel de trouver une préparation appropriée pour étudier le calendrier et la fidélité du cycle cellulaire. Comme la plupart des cycles de cellules embryonnaires sont tronqués (SM ou S-G2-M) et les mutants étudiés ne présentent pas de défauts jusqu'à ce que les étapes ultérieures, il est important d'observer le cycle cellulaire dans les tissus stade de pupe. cellules épithéliales de la pupe ont un cycle cellulaire G1-S-G2-M plus typiques et les nymphes de cette étape sont pas capable de mouvements musculaires ^9. Le point de départ initial pour les manipulations inclus toute pupes intact exprimer Histone2AV-GFP. Malgré l'apparente opacité de la pupe, cette préparation intacte s'est avérée excellente à long terme dans l'imagerie in vivo. Cette technique est simple assez que les chercheurs de premier cycle utilisent régulièrement pour étudier les aspects de la biologie cellulaire et de développement chez la drosophile et pourtant la résolution est assez fine pour permettre la discrimination des fonctionnalités à l'échelle du micromètre. Avec cette méthode, l'observation des événements au cours des heures, minutes ou secondes sont possibles simplement en ajustant les paramètres de séries chronologiques. Vidéos en utilisant bleu, des protéines fluorescentes vertes, jaunes, oranges, rouges et, ou des combinaisons de ceux-ci, ont été réalisés. Surtout, si les soins sont prises pour minimiser l'intensité du laser, même imagerie à long terme n'a pas d'effet sur le développement ou la viabilité des animaux.

Protocole

Une. Fly travail

1. Maintenir les mouches sur le milieu de semoule de maïs-agar-mélasse-levure standard à température ambiante ^10.
2. Pour croix, isoler vierges dans les 6 h de l'éclosion. Après avoir traversé les mâles du génotype désiré, changement vole vers de nouveaux flacons tous les 3-4 jours.

Remarque: Pour ces expériences, ligne Gal4 A9 a été utilisé pour diriger l'expression de transgènes dans l'aile. Fly stocks peuvent être obtenues auprès du centre de langue à Bloomington. Stocks utilisés dans ces expériences comprennent A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), Sco / CYO HsCre (Bl # 1092), SAMU-ChRFP-Tub (Bl # 25773), lollibow ^11.

2. Sélection et montage des pupes

1. Stade de nymphes, soit par la collecte comme prénymphes blanc (WPP) et les maintenir à 25 ° C jusqu'à ce qu'ils atteignent l'âge approprié ou en utilisant des critères morphologiques ^12.
2. Pour observer des divisions cellulaires, sélectionnez nymphe qui ont récemment subi une tête de retournement.Partir de ce moment jusqu'à ce que juste avant l'éclosion (à> 96 h), les nymphes sont immobiles permettant l'observation prolongée time-lapse.
3. Retirer les nymphes des flacons d'abord en les touchant avec un pinceau imbibé d'eau, en attendant une minute pour permettre à l'eau pour desserrer la colle et puis doucement les pousser sur le pinceau.
4. Lavez délicatement les nymphes sélectionné par les pousser avec un pinceau dans l'eau pour éliminer les particules adhésives de la glande et alimentaires salivaires.
5. Transférer les pupes propre à une boîte de Petri de 25 mm avec un fond de la lamelle couvre-objet (numéro 1 ½ lamelles couvre-objet).
6. Utilisation de fines bandes de pâte à modeler soit ou cire dentaire à titre de support, de sorte que les pupes monter le tissu d'intérêt est la plus proche de la lamelle.
   Note: Dans les études décrites ici, ailes de nymphose, les jambes, histoblastes abdominales ou dorsales notum ont été observés. En pratique, n'importe quel tissu dans 20 um de la surface de la coque de nymphose est observable.
7. Nymphes Orient avec soin afin que le tissue d'intérêt est parallèle à la surface de la lamelle de verre.
8. Une fois les nymphes sont montés, utilisez un pinceau pour transférer une fine couche de thiodiéthylèneglycol (TMD) à l'espace entre la nymphe et la lamelle.

Remarque: TMD réduit la diffusion de surface, correspond à l'indice de réfraction de l'huile, et permet à l'oxygène de pénétrer le tissu ^13. L'utilisation des huiles n'est pas recommandé, car ils ont tendance à priver les tissus de l'oxygène, ce qui provoque la cessation rapide des comportements cellulaires.

3. Imagerie

Remarque: Pour l'imagerie, un microscope confocal est susceptible d'être essentiel que le confocalité supprime la plupart des fond d'obscurcissement causé par un éclairage intense de la coque de nymphose.

1. Réglez les paramètres sur la confocale à minimiser l'impact de l'éclairage sur le développement des pupes et la viabilité. Pour ce faire, trouver un équilibre entre l'intensité de l'excitation et de la sensibilité de la collecte. Une configuration typique pour l'imagerie wie le Leica SP5 utilisé le scanner de résonance (8000 Hz), la puissance du laser fixé à 2% (10% de transmission de puissance de 20%), ensemble sténopé à 120 um, et la ligne VITESSE réglée à 8. Paramètres peuvent varier en fonction des conditions expérimentales.

Remarque: Pour résoudre échelle fine dispose 40X et 63X lentilles à immersion d'huile (0,1 mm de distance de travail) ont également été utilisés avec succès dans cette méthode, même si elles limitent la profondeur de champ.

4. Analyse

Pour analyser les trames, z-piles ou des films importer les fichiers de données à FIDJI, qui dispose d'outils efficaces pour la visualisation, la mesure et la modification des fichiers de présentation ^14. Par exemple le temps de compléter la mitose a été mesurée en utilisant l'intervalle d'échantillonnage et le navigateur d'image multidimensionnelle de l'étape à travers les cadres tout en regardant une cellule de la prophase à la télophase. x, y, et z dimensions peuvent être mesurées à l'aide de l'outil de mesure. Pour obtenir des instructions détaillées sur le logiciel et son utilisationvoir: http://fiji.sc/Fiji.

Résultats

Les cellules de l'épithélium pseudo-stratifié, telles que le développement de l'œil de Drosophila, ou de la couche du ventricule du système nerveux central des vertébrés en développement, subissent des mouvements nucléaires, appelée migration nucléaire interkinetic, dans le temps avec le cycle cellulaire. réplication de l'ADN se produit lorsque les noyaux sont au niveau ou près de la surface de la base et les cellules entrent en mitose lorsque les noyaux atteignent la surface apicale <...

Discussion

Pour visualiser, mesurer et quantifier les caractéristiques des cellules en division, le développement nécessaire d'une préparation simple pour l'observation de la mitose dans l'aile pupe vie de la drosophile par des moyens d'analyse confocale de cellules exprimant His2AvGFP. Cette méthode a été utilisée pour documenter que le cycle cellulaire dans l'aile pupe porte de fortes similitudes avec la cellule cycles dans l'épithélium pseudo-stratifié en ce que les noyaux passage à ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly stuff fly pad	Genesee Scientific	59-114	for fly anesthetization
CO2 gas	Airgas South	CD50	For fly anesthetization
Regulator	Airgas South		CO2 regulator
Fly vials	Genesee Scientific	32-113RLBF	Fly culture
Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773)	Bloomington Stock Center
Glass bottom dishes #1 1/2	WillCo Wells BV		For microscopy
Thiodiethylene Glycol	Fluka	88559	mountant
Modeling clay	art supply store		Support to position pupae against
Paintbrushes	art supply store		To manipulate flies
Fine Forceps, Inox #5	Fine Science Tools	11252-20	Dumont #5
computer	any		8 Gb RAM for image/movie analysis
Fiji software		Free ware http://fiji.sc/Fiji	Image analysis software
Confocal microscope			Any fast scanning confocal should be sufficient
20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses	any		For imaging tissue, cellular, and subcellular features
Immersion oil (nonfluorescent)
Stereomicroscope	any		For fly manipulation