Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

العصبية السلف الانقسام هو معلمة الحرجة من تكوين الخلايا العصبية. ويستند جزء كبير من فهمنا لالعصبية السلف الانقسام على تحليل الأنسجة الثابتة. تصوير حي في شرائح المخ الجنينية هي تقنية متعددة لتقييم الانقسام مع القرار الزماني والمكاني عالية في بيئة تسيطر عليها.

Abstract

على الرغم من مدة قصيرة، الانقسام هو عملية متعددة الخطوات المعقدة والديناميكية الأساسية لتطوير القدرات للأجهزة بما في ذلك الدماغ. في القشرة الدماغية النامية، الانقسام الشاذ من الأسلاف العصبية يمكن أن يسبب تشوهات في حجم الدماغ ووظيفته. وبالتالي، هناك حاجة ماسة لأدوات لفهم الآليات العصبية السلف من الانقسام. التنمية القشرية في القوارض هو نموذج متميز لدراسة هذه العملية. يتم فحص العصبية السلف الانقسام عادة في أقسام الدماغ ثابتة. وهذا البروتوكول يصف بالتفصيل نهجا لتصوير حي من الانقسام في فيفو السابقين شرائح الدماغ الجنينية. سنقوم بشرح الخطوات الحاسمة لهذا الإجراء، والتي تشمل: استخراج الدماغ، الدماغ التضمين، باجتزاء vibratome من شرائح الدماغ، وتلطيخ وزراعة شرائح، والوقت الفاصل بين التصوير. وسوف نقوم بعد ذلك التظاهر وتصف بالتفصيل كيفية إجراء تحليل بعد الحيازة من الانقسام. ندرج نتائج ممثل الابام هذا الاختبار باستخدام الصبغة Syto11 الحيوية، الفئران المعدلة وراثيا (هيستون H2B-EGFP وcentrin-EGFP)، والتثقيب الكهربائي في الرحم (mCherry-α-تويولين). سوف نناقش كيف أن هذا الإجراء يمكن أن يكون أفضل الأمثل وكيف يمكن تعديلها لدراسة التنظيم الجيني للالانقسام. تصوير حي من الانقسام في شرائح الدماغ هو نهج مرن لتقييم أثر من العمر، وعلم التشريح، واضطراب وراثي في ​​بيئة تسيطر عليها، وإلى توليد كمية كبيرة من البيانات مع القرار الزماني والمكاني عالية. وبالتالي هذا البروتوكول سوف تكمل الأدوات الموجودة لتحليل العصبية السلف الانقسام.

Introduction

الهدف العام من هذا البروتوكول هو لوصف كيفية إجراء التصوير الحي من العصبية السلف الانقسام في شرائح المخ الجنينية. باستخدام التصوير حية من شرائح الدماغ في الثقافة، هذا البروتوكول يوفر طريقة بسيطة لفحص جوانب متعددة من الانقسام في الأسلاف العصبية في بيئة مشابهة للغاية للبيئة في الجسم الحي. ويمكن تطبيقه لأدمغة الحيوانات و / أو متحولة العقول التي تم التلاعب بها في الرحم مع التثقيب الكهربائي) 1-5. هذه التقنية هي أيضا مثالية لاختبار تأثير كلاء الدوائية على الانقسام السلائف العصبية '، ببساطة عن طريق إضافة وكيل لثقافة المتوسط. باختصار، هذه المادة سوف تجعل بروتوكول تحديا تقنيا للوصول إلى أولئك الذين يدرسون تكوين الخلايا العصبية.

أثناء تكوين الخلايا العصبية، متميزة السكان السلف العصبية الخضوع الانقسامات دقيقة لتوليد الخلايا العصبية التي تسهم في نهاية المطاف إلى الطبقات القشرية ستة من الكبار القشرة المخية الحديثة 6-8. في التنمية القشرية في وقت مبكر، ويوسع تجمع السلائف العصبية الظهارية العصبية كما (NE) انقسام الخلايا بشكل متناظر على تجديد الذات. خلايا NE ثم تحويلها إلى خلايا الدبقية شعاعي (RGCs). في البداية RGCs تقسيم متناظر لإنتاج نوعين من RGCs جديدة، ولكن خلال الجزء الأكبر من تكوين الخلايا العصبية، الوسيلة الرئيسية لتقسيم RGCs 'غير متناظرة. في التقسيم غير المتماثلة، 1 RGC يثير RGC جديدة وإما الخلايا العصبية بعد الإنقسامية، أو السلف أكثر تخصصا (إما السلائف العصبية القصيرة (SNP)، وهو الدبقية شعاعي الخارجي (ORG)، أو السلف المتوسطة (INP) 2،3،7،9. INPS، تعدد الأشكال، ويمكن بعد ذلك ORGs توليد الخلايا العصبية في البطين الفرعية، البطين، والمناطق القاعدية من القشرة، على التوالي، وبالتالي فإن انقسام الخلايا من الأسلاف هو عملية أساسية لتوليد الخلايا العصبية لل القشرة المخية الحديثة.

تشير العديد من الدراسات إلى وجود علاقة بين الصفات الإنقسامية محددة من RGCs ومصير الخلايا الوليدة. حيدر وآخرون. وتاكاهاشي وآخرون.قد أظهرت أن RGC مدة الإنقسامية دورة الخلية وزيادة طول والعائدات تكوين الخلايا العصبية، وردد وهو الاكتشاف في متابعة الدراسات 10-13. وقد اقترح عدد من الدراسات التي المغزل الإنقسامية التوجه النسبي إلى البطين يؤثر جوانب تكوين الخلايا العصبية وcorticogenesis، بما في ذلك أنواع من الخلايا العصبية ولدت وموقع ذرية في الدماغ، على التوالي 3،10،14-16. ما إذا كان التوجه الطائرة الانقسام يؤثر بشكل مباشر مصير الخلية مثير للجدل، ولكن يبقى الاستنتاج بأن هذه الآثار الإنقسامية المعلمة تكوين الخلايا العصبية. مزيد من التأكيد على أهمية الانقسام هو ملاحظة أن العديد من الجينات المعنية في اليات الانقسام حاسمة لتكوين الخلايا العصبية والدماغ السليم للتنمية 17-20.

الانقسام هو عملية ديناميكية، ولكن حتى الآن معظم الدراسات تفصيل العصبية السلف الانقسام الاستفادة من تحليل المقاطع النسيجية ثابتة أو التصوير من الأسلاف العصبية عن طريق زراعة الخلايا في المختبر. وبالتالي، فإن الأساليب السائدة لتقييم الانقسام توفر سوى لقطة من هذه العملية وتفشل في الكشف عن كيف تتصرف الخلايا في الأنسجة. أصبح التصوير الحي من العصبية السلف الانقسام بشكل متزايد أداة حاسمة لفهم وظيفة السلف العصبية. للحصول على أمثلة يرجى الاطلاع على هذه المراجع 4،8،10،21-25. وقد نشرت العديد من البروتوكولات غير المسددة لإعداد وتصوير شرائح الدماغ 26،27. ولكن حتى الآن، لم يتم وصفها بروتوكول شامل للتصوير وتحليل الانقسام ولا أظهر في الفيديو.

هذا الأسلوب يوفر عدة مزايا هامة على تحليل ثابت من أقسام الدماغ. تحليل الوقت الفاصل بين شرائح الدماغ تمكن جيل من أكثر بكثير من نقاط البيانات التي يمكن تحليلها بطريقة مرنة. أولا، يتم جمع البيانات في نقطة زمنية الفردية على مدى عدة دقائق أو عدة ساعات. يمكن للمرء أن تحليل نقاط زمنية الفردية (لإنشاء المونتاج ثابت) أولا يمكن الجمع بين نقاط زمنية مختلفة في الأفلام. الثانية، والتصوير متحد البؤر من شرائح تمكن الجيل من البيانات في أقسام مختلفة Z في شرائح الدماغ. ونتيجة لذلك، يمكن تحليل المقاطع الفردية. بدلا من ذلك، أكوام من المقاطع الفردية يمكن دمجها في الإسقاط كثافة اكبر. الثالثة، ويتم التحليل في سياق الأنسجة، وكشف عن كيفية تقسيم الخلايا نسبة إلى الخلايا والهياكل المجاورة. الرابعة، هي مناسبة بشكل مثالي لتحليل المسوخ التي تظهر بعض الأدلة على عيوب الإنقسامية. معا هذا البروتوكول سوف تساعد على توضيح الخطوات الحاسمة لمساعدة المحققين الذين يرغبون في إجراء التصوير الحي من العصبية السلف الانقسام في المختبرات الخاصة.

Protocol

1. إعداد وسائل الاعلام (الشكل 1، الخطوة 1)

  1. شريحة متوسطة الثقافة
    1. 25 مل من مستنبت شريحة كافية لإعداد أطباق أسفل الزجاج 5 مع 2 شرائح لكل بئر.
    2. في أنبوب 50 مل المخروطية، إضافة 250 ميكرولتر من حل N2 100X و 500 ميكرولتر من 50X B27 حل من دون فيتامين (أ) إضافة DMEM/F12 إلى حجم 22.5 مل.
    3. فلتر تعقيم الحل وبعد ذلك إضافة 1.25 مل من مصل الحصان الحرارة المعطل و 1.25 مل من مصل بقري جنيني.
    4. احتضان الحل في حمام الماء عند 37 درجة مئوية لمدة إعداد الشرائح.
    5. إضافة عوامل النمو (صندوق الأجيال القادمة وصندوق تعديل العولمة الأوروبي، تركيز النهائي من 10 نانوغرام / مل و 20 نانوغرام / مل، على التوالي) مباشرة قبل بداية الثقافة. وقد تم تحسين تكوين هذه الوسيلة لتعزيز بقاء الخلايا في الثقافة وزيادة معدل انتشار الأسلاف العصبية. وبالتالي فإن هذا تعظيم احتمال لمراقبة الخلايا الإنقسامية في شريحة.
  2. HBSS كاملة تشريح الحل
    1. إعداد 500 مل من HBSS كاملة بإضافة 50 مل من 10X HBSS، 1.25 مل من 1 M HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.4، 2.5 ملي FC)، و 6 مل من 2.5 M D-جلوكوز (FC 30 ملم)، 2.2 مل من 0.9 M NaHCO 3 (FC 4 ملم) وتعقيمها DIH 2 O إلى الحجم النهائي من 500 مل.
    2. الحل تصفية وتعقيم المحل في 4 درجات مئوية حتى جمع قرون الرحم من الماوس الحوامل. يمكن الاحتفاظ هذا الحل في 4 درجات مئوية لمدة أسابيع.
    3. إبقاء HBSS على الجليد أثناء إجراء تشريح كامل.
  3. تضمين الحل
    1. لتضمين من 4 العقول الجنينية، وإعداد 30 مل من 3٪ منخفضة ذوبان الاغاروز في حل HBSS كاملة. في أنبوب 50 مل المخروطية، إضافة 0.9 غرام من انصهار منخفضة الاغاروز وHBSS كاملة إلى 30 مل.
    2. مزيج الحل مع خلاط دوامة، وتذوب في الميكروويف مع مكانة أنبوب والغطاء مفتوحا.
    3. بينما في الميكروويف، ورصد الحل عتجاوز بسبب الإفراط في الغليان revent. عندما يبدأ الغليان، والتوقف عن الميكروويف ودوامة الحل.
    4. كرر هذه الخطوات حتى ذاب كل الاغاروز.
    5. تخزين الأنبوب في حمام الماء عند 42 درجة مئوية.

2. تشريح الأجنة (الشكل 1، الخطوة 2)

  1. بعد القتل الرحيم الحذر من الفأرة الحوامل، وجمع قرون الرحم وتحويلها إلى 10 سم 2 طبق بتري تحتوي على البارد الكامل 1X HBSS. عمر الجنين يمكن أن تختلف تبعا للدراسة. وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لزراعة شرائح الدماغ من أيام الجنينية E12.5 E17.5 ل. نظرا لحجمها، والعقول الشابة تميل إلى أن تكون أكثر صعوبة في التعامل معها.
  2. جمع الأجنة وتشريح أدمغة الجنينية كما هو موضح سابقا في الجرذان والفئران 26،27، حتى يتم الحصول على المخ الجنينية كاملة بما في ذلك الدماغ المؤخر والدماغ الأمامي مع اثنين من نصفي الكرة المخية. ويمكن لهذه أن تكونأبقى على RT حتى يتم تشريح كل العقول.
  3. جمع الأجنة وتشريح أدمغة الجنينية كما هو موضح سابقا في الجرذان والفئران 26،27، حتى يتم الحصول على المخ الجنينية كاملة بما في ذلك الدماغ المؤخر والدماغ الأمامي مع اثنين من نصفي الكرة المخية. هذه يمكن أن تبقى في RT حتى يتم تشريح كل العقول.

3. تضمينها في المخ الجنينية (الشكل 1، الخطوة 3)

  1. في دلو يحتوي على الجليد، وخلق ثقب في الجليد لإدراج قوالب التضمين في.
  2. صب 3٪ الاغاروز المتوسطة في قالب من البلاستيك ووضع هذا القالب في حفرة أعدت في الجليد.
  3. تحريك المتوسطة الاغاروز مع غيض من ميزان الحرارة الرقمي حتى تصل درجة الحرارة الى 35 درجة مئوية.
  4. على الفور نقل المخ في المتوسط ​​التضمين.
  5. الخطوة الحاسمة: لإزالة الزائدة HBSS في مجال التفاعل بين الدماغ والاغاروز، بعناية وتعثر بلطف / تناوب المخ بشكل متكررفي حل التضمين مع ملقط.
  6. وهناك وسادة من الاغاروز تبلور شكل في الجزء السفلي من العفن في اتصال مع الجليد. مرة واحدة يمكن أن يرى وسادة مع غيض من ملقط مع التحريك الدماغ، ضع الدماغ مع الجانب الظهري تصل. ينبغي أن الدماغ لا تنزل الى القاع جدا من العفن.

4. إعداد الاغاروز كتلة (الشكل 1، الخطوة 4)

  1. السماح للالاغاروز تتصلب في الجليد لمدة 5 دقائق على الأقل.
  2. باستخدام شفرة حلاقة، قسم زوايا العفن.
  3. نحت بعناية كتلة الاغاروز حول الدماغ باستخدام شفرة حلاقة. محاولة للحد من عدد من التخفيضات لتجنب احداث بلبلة في الدماغ المضمنة.
  4. تأكد من أن كتلة لديها مساحة أكبر في المنطقة الذيلية من الدماغ (مقابل منطقة منقاري، انظر الشكل 1، الخطوة 4) لزيادة استقرار كتلة على قاعدة التمثال باجتزاء.
  5. وينبغي أن يكون الخفض الأخير على الجانب الذيلية من الدماغ؛وهذا الخفض تحديد الطائرة باجتزاء الصحيح مع vibratome.
  6. تفعل ذلك عن طريق مواءمة شفرة عمودي على محور rostro-الذيلية من الدماغ وكتلة agarose. تنزلق نحو caudally النصل على طول محور rostro-الذيلية وجعل خفض النهائي حوالي 5 ملم بعيدا عن المنطقة الأكثر الذيلية من الدماغ.
  7. تعيين كتلة الاغاروز / الدماغ جانبا وكرر التضمين من العقول الأخرى.

5. نقل من الأمخاخ جزءا لا يتجزأ من داخل علبة من Vibratome (الشكل 1، الخطوة 5)

  1. إضافة قطرة من الغراء على الجزء السفلي من الدرج vibratome. وضع الغراء بحيث سيتم وضع لبنات الاغاروز في متناول شفرة تهتز.
  2. وضع الجانب الذيلية كتلة الاغاروز / أسفل الدماغ على حافة ملعقة، مع حوالي 50٪ من كتلة حرجة على حافة الملعقة.
  3. تطبيق الوجه الذيلية من كتلة agarose إلى الغراء، وحرك الملعقة بعيدا، والحفاظ على كتلة agarose إلى أسفل الدرج مع لياليhoulder من زوج من ملاقط. لا تدع ملعقة الاتصال مباشرة الغراء.
  4. السماح للالغراء يصلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.

6. باجتزاء من الأمخاخ جزءا لا يتجزأ من (الشكل 1، الخطوة 6)

  1. ملء علبة vibratome مع HBSS.
  2. تحديد المواقف البداية والنهاية للشفرة vibratome.
  3. توليد 200-250 ميكرون شرائح. مع vibratome VT1000S، استخدم المعلمات التالية: سرعة 2-4، وتواتر 8.
  4. إزالة بعناية شرائح من vibratome كما يتم قطع. نقل شرائح مع ملعقة ونهاية الجزء الخلفي من ملاقط إلى 12 الأطباق جيدا مليئة HBSS كاملة. بدلا من ذلك استخدمت بعض الباحثين الفرشاة بدلا من ملاقط نقطة أساسية: خلال نقل والحرص على أن تظل شرائح الدماغ تعلق على الاغاروز المحيطة بها.

7. Syto11 تلطيخ للشرائح (الشكل 1، الخطوة 7)

  1. تمييع Syto11 إلى تركيز النهائي من0،5-1 ميكرومتر في المتوسط ​​ثقافة شريحة تستكمل مع عوامل النمو.
  2. في بئر من لوحة 12 جيدا، واحتضان شرائح من دماغ واحد في 2.5 مل من الحل تلطيخ لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  3. تغسل شرائح في 2.5 مل من مستنبت شريحة دون تلطيخ الحل لمدة 20 دقيقة.

8. تركيب شرائح في صحن زجاج القاع (الشكل 1، الخطوات 8 و 9)

  1. إعداد 15 ميكرولتر من تضمين حل الكولاجين لكل شريحة. إعداد محلول 1.5 ملغ / مل الكولاجين عن طريق خلط 375 ميكرولتر من 3 ملغ / مل نوع الكولاجين أنا حل مع 75 ميكرولتر من 10X DMEM، 9.4 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 1 M، و 290 ميكرولتر من H 2 O. تخزين على الجليد.
  2. وضع قطرة 15 ميكرولتر من الحل الكولاجين في الجزء السفلي من قاع 35 مم زجاج Microwell الصحن. انتشر مع طرف الماصة لتتناسب مع حجم شريحة.
  3. نقل شريحة في قطرة من الكولاجين مع ملعقة وزوج من ملاقط نقطة أساسية: تركيب شرائح متعددة في تختلفأطباق والأنف والحنجرة ويزيد من احتمال للحصول على شرائح مناسبة للتصوير. الشاشة من خلال شرائح مختلفة واختيار تلك التي تلبي أفضل معايير المبينة أدناه في القسم "ممثل النتائج".
  4. السماح للشرائح احتضان عند RT لمدة 10 دقيقة قبل نقلهم الى الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  5. بعد 20 دقيقة، إضافة 1.2 مل من مستنبت شريحة في صحن زجاج القاع Microwell. إضافة 600 ميكرولتر من المتوسطة في وقت وانتشاره مع طرف ماصة.
  6. التقاط صورة التكبير منخفضة من شريحة الدماغ لتسجيل مستوى التشريحية وسلامة شريحة.

9. تصوير لايف لشرائح (الشكل 1، الخطوات 10 و 11)

  1. السماح للشرائح استرداد في الحاضنة لمدة 1 ساعة على الأقل و 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 قبل التصوير الحي.
  2. صورة شرائح المجهر مع الاختيار، مع الأخذ في الاعتبار أن Syto11 هو عرضة للغاية لphotobleaching من. هنا لإنفريستخدم تيد الغزل القرص المجهر متحد البؤر (أندور XD الثورة الغزل متحد البؤر المجهر القرص). بدلا المجهر متحد البؤر المسح الضوئي ليزر يمكن استخدامها. المعلمات التالية هي لمجهر القرص الغزل انشاء.
  3. خلال الدورة التصوير الحي بأكمله، والحفاظ على شرائح عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 في غرفة الحضانة مرطب تعلق على المجهر.
  4. خلايا الصورة مع الهدف 60X السيليكون النفط مع مسافة العمل من 300 ميكرون، والفتحة العددية من 1.3 (للأمثلة أنظر الشكلين 3B، 3C، 3E، 3F، 4A، 4B). وثمة هدف النفط 100X مع مسافة عمل 130 ميكرون والفتحة العددية من 1.4 (على سبيل المثال انظر الشكل 4C) يمكن أن تستخدم أيضا. القرار من الكاميرا هو 512 X 512.
  5. صورة الخلايا في 30 ميكرون ض المكدس، مع مركز للض المكدس تقع على بعد حوالي 40 ميكرون تحت سطح شريحة. يمكن أن تحاول الصورة أعمق في الأنسجة يتسبب في الهدف لإضافةالضغط الميكانيكي على شريحة. وهذا يمكن أن يؤثر على سلامة شريحة الدماغ. إذا التخطيط لجعل اعادة البناء 3D من الخلايا، استخدم ض دام لا يزيد عن 2 ميكرون.
  6. ضبط قوة الليزر ومرات التعرض للحد من photobleaching من. استخدام مرات التعرض تتراوح 30-200 ميللي ثانية، اعتمادا على شدة إشارة Syto11.
  7. مع مرحلة الآلية، صورة مواقف متعددة عبر شرائح متعددة تقام في 1 طبق. على سبيل المثال، صورة يصل إلى 20 مواقع منتشرة في جميع أنحاء 4 شرائح مختلفة في 1 صحن واحد.
  8. للتصوير الحية، واستخدام الاستبانة الزمنية أقل من 5 دقائق لتمكين التعرف على مختلف مراحل الانقسام. باستخدام Syto11 و / أو هيستون H2B-EGFP، 4-5 ساعة من التصوير الحي تكفي لمراقبة عدد كبير من الخلايا الإنقسامية. ومع ذلك، إذا وصفت التصوير قليلة الخلايا الإنقسامية (مثل تلك التي في الرحم التثقيب الكهربائي يتحقق)، ثم معلمة يعد التصوير (بين عشية وضحاها) هو المناسب ويعمل نحنليرة لبنانية.
    ملاحظة: باستخدام هذا البروتوكول، نلاحظ عادة في المتوسط ​​10 الخلايا الإنقسامية في الموقف. كما ذكر أعلاه، شنت التصوير متعددة شرائح يزيد من احتمال وجود تجربة ناجحة. مع هذا النهج عادة نحدد الخلايا الإنقسامية في تقريبا جميع التجارب أجريت مع Syto11 أو هيستون H2B-EGFP.

10. بعد الاستحواذ تحليل الانقسام (الشكل 2)

وقد تم تحسين جميع إجراءات في هذا القسم في فيجي (يماغيج)، والذي هو مفيد لأنه هو البرمجيات مفتوحة المصدر مجانية. تتوفر لأداء نفس المهام، مثل Metamorph، Imaris، وأميرة حلول البرمجيات الأخرى.

  1. تحديد أرقام الميتوزى في فيجي
    1. بعد فتح ورقة العمل لموقف واحد بأنه "hyperstack"، حدد أحد ض الطائرة (انظر الشكل 2A لموقع شريط التمرير) حيث الأنسجة والخلايا تبدو صحية (انظر المعايير في قسم المناقشة).انتقل عبر البعد الزماني لتحديد الخلايا التي يمر طور الصعود، كما هو أسهل لتحديد المرحلة الإنقسامية.
    2. انتقل إلى الوراء في الوقت المناسب لتحديد نقطة زمنية حيث يدخل الخلية الانقسام (التكثيف DNA). الخلية قد نقل عبر ض الطائرات، ولكن تم القرار الأمثل الزمنية والمعلمات ض المكدس هو موضح سابقا لتمكين هذه العملية.
    3. في جدول بيانات، تسجيل 4D إحداثيات الخلية في hyperstack (X، Y، Z والوقت، انظر الشكل 2A لتصور موقع هذه الأرقام في واجهة فيجي) وهي تدخل الانقسام. ومعرفة هذه الإحداثيات منع عد الخلية نفسها عدة مرات.
    4. انتقل إلى الأمام في الوقت المناسب وتسجيل الوقت الذي تقدم الخلية من مرحلة إلى أخرى. توثيق مدة كل مرحلة الإنقسامية لخلية واحدة معينة.
    5. المضي قدما مع الخلايا الأخرى، عبر البيانات الكاملة (خلايا متعددة داخل وعبر المواقف).
  2. 3D إعادة بناءايون من خلايا والكميات من خلال دوران الطورية (مقتبس من حيدر وآخرون، 2003) (الشكل 2B).
    1. بعد أن حدد الخلايا الإنقسامية متعددة، استخدام الإحداثيات من خلية وانتقل إلى الأمام في الوقت المناسب حتى بداية الطورية.
    2. تدوير كامل "hyperstack" بحيث الحدود البطيني هو مستو (باستخدام "صورة / تحويل / تدوير ..." الأوامر). استخدام "زاوية" أداة لتحديد زاوية لتطبيق لهذا التناوب.
    3. تحديد ض الطائرة حيث الخلية من الفائدة هو الأكثر وضوحا. في تلك الطائرة، واستخدام "مستطيل التحديد" أداة لرسم التحديد الذي يتضمن الخلية بأكملها.
    4. تحديد ض الطائرات التي تتضمن الخلية من الفائدة. استخدام "صورة / تكرار الأمر" لإنشاء "كومة من الباطن". في مربع الحوار، وترك "hyperstack مكررة" التحقق. و"شرائح (ض)" المعلمة يتوافق مع ض الطائرات بما في ذلك كله مليرة لبنانية، و "إطارات (ر)" المعلمة يقابل النقطة الوقت الحالي.
    5. إذا كان القرار هو الفقراء، وزيادة حجم "كومة الفرعية" باستخدام "الصورة / ضبط / الحجم ..." الأوامر.
    6. تولد إعادة الإعمار 3D للخلية عند نقطة الوقت الحالي باستخدام "المشروع Image/Stacks/3D ..." الأوامر. يتم عرض المعلمات لهذا الأمر في الشكل 2B. و"تباعد شريحة" يتوافق مع فاصل زمني بين كل من الصور ض الطائرة (ميكرومتر). المهم: تأكد من أن البعد المادي (ميكرون) من المكدس الفرعية تم حفظها. إذا لم يحدث ذلك فإن الاستيفاء من بكسل في البعد ض تكون غير صحيحة، وسوف إعادة الإعمار 3D تكون غير دقيقة.
    7. باستخدام شريط التمرير، وتناوب على إعادة الإعمار 3D الناتجة بحيث حافة لوحة الطورية مرئيا. عدد إطار يتوافق مع زاوية بيتا هو موضح في الشكل 3B، سجل هذا الرقم. باستخدامفي "زاوية" أداة و "تحليل / قياس ..." القيادة، وقياس الزاوية بين الأفقي وخط تتوسط لوحة الطورية عموديا (الشكل 2B). هذا هو ألفا زاوية.
    8. تسجيل هذه الزوايا لجميع نقاط الوقت الطورية للخلية من الفائدة. زاوية دوران بين نقاط الوقت (ر) و (ر 1) يساوي القيمة المطلقة للفرق بين زاوية في (ر) وهذه الزاوية في (تي 1).
  3. قياس التوجه للطائرة الشق
    1. 3D إعادة بناء خلية من الفائدة عند نقطة زمنية واحدة خلال طور الصعود التالية الإرشادات الموضحة لإعادة الإعمار 3D لوحات الطورية.
    2. تدوير إعادة الإعمار حتى حواف اثنين من لوحات شكلتها الكروموسومات فصل مرئية.
    3. استخدام أداة زاوية لقياس الزاوية بين الأفقي (حافة البطين) وخط مواز لاثنين من لوحات شكلتها الكروموسومات فصل. هذا هو زاوية من الطائرة الانقسام (الشكل 2C).
  4. جيل من افلام
    1. كما الخلايا غالبا ما تتحرك في أرجاء مختلفة-Z الطائرات، وتحديد للطائرات ض من قبل الخلية المحتلة خلال الدورة التصوير الحي. إنشاء "الإسقاط كثافة الحد الأقصى" من هذه الطائرات-Z باستخدام "صورة / الأكوام / Z المشروع ..." الأوامر. حفظ كومة الناتجة بأنها ". TIF" الملف.
    2. فتح هذا الملف في النسخة 1.45 من يماغيج كما فيجي لا يتضمن المساعد مستقرة لتوليد ". وسائل التحقق" أو ". افي" الملفات.
    3. استخدام "ملف / حفظ باسم / ..." قيادة يماغيج لتوليد فيلم في تنسيق متوافق مع تطبيقات أسفل تيار الخاصة بك.

النتائج

نجاح هذا الاختبار ومراقبة الخلايا الإنقسامية متعددة خلال دورة واحدة التصوير الحية يعتمد إلى حد كبير على كل من النزاهة والمستوى التشريحي للشريحة حيث يتم إجراء عمليات الاستحواذ. كما هو مبين أدناه، ومستوى التشريحية للشريحة هو عامل مهم. ويبين الشكل 3A-rostro الذيل...

Discussion

والميزة الرئيسية لبروتوكول وصفناها هو أنه يوفر القرار الزماني دينامية من الانقسام من الأسلاف العصبية. عادة، يتم تنفيذ المقايسات لتصور الانقسام في الدماغ النامية باستخدام المناعي من أقسام الأنسجة الثابتة. ولكن هذا النهج لا يوفر سوى لقطة من الانقسام في نقطة زمنية وا?...

Disclosures

يعلن الكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

يعترف الكتاب بتمويل من NINDS / NIH، R00-NS064197 NINDS و/ NIH، R01NS083897 (على حد سواء لدائرة الأراضي والمساحة).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Material/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
100X N2Life technologies17502048for culture medium
50X B27 without vitamin ALife technologies12587010for culture medium
DMEM/F12Life technologies11320033for culture medium
Heat-inactivated horse serumSigma AldrichH1138-500mlfor culture medium
Heat-inactivated calf serumSigma AldrichF4135-500MLfor culture medium
FGFR&D Sytems3139-FB-025for culture medium
EGFfor culture medium
10X HBSSLife technologies14065-056for the dissection of the embryos
Hepes Free AcidSigma Aldrich H4034dilute to 1M (pH7.4)
2.5M D-GlucoseSigma AldrichG8769for the dissection of the embryos
0.9M NaHC03Life technologies25080-094for the dissection of the embryos
low-melting agaroseFisher BP165-25for generating slices
Loctite 404 glueLoctite 40446551keep at 4˚C
syto11Life technologiesS7573Make 5µl aliquots
3 mg/ml collagen type I Life technologiesA1048301for culturing slices
glass bottom dishMatTekP35G-1.5-14-Cfor culturing slices
petri dishesfor dissection of the embryos
digital thermometerto measure the temperature of the agarose
spatulato transfer brains
paintbrushalternative to transfer brains
vibratomeLeicaVT1000sfor generating slices
dissecting microscopedissecting out embryos
imaging microscopeA confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber

References

  1. Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
  2. Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).
  3. Konno, D., et al. Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).
  4. LoTurco, J. J., Manent, J. -. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).
  5. Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
  6. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146, 18-36 (2011).
  7. Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).
  8. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, 714-720 (2001).
  9. Wang, X., Tsai, J. -. W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).
  10. Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).
  11. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
  12. Pilaz, L. -. J., et al. Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).
  13. Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
  14. LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex. Nature Communications. 4, 1665 (2013).
  15. Postiglione, M. P., et al. Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex. Neuron. 72, 269-284 (2011).
  16. Silver, D. L., et al. The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).
  17. Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).
  18. Feng, Y., Walsh, C. A. Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size. Neuron. 44, 279-293 (2004).
  19. Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes. Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).
  20. Bond, J., et al. A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size. Nat Genet. 37, 353-355 (2005).
  21. Shu, T., et al. Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression. Neuron. 49, 25-39 (2006).
  22. Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling. Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).
  23. Hu, D. J. -. K., et al. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, 1300-1313 (2013).
  24. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).
  25. Tyler, W. A., Haydar, T. F. Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome. Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).
  26. Noctor, S. C. Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain. CSH Protoc. , (2011).
  27. Elias, L., Kriegstein, A. R. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
  28. Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors. Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).
  29. Hadjantonakis, A. -. K., Papaioannou, V. E. Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice. BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).
  30. Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).
  31. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
  32. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
  33. Yang, Y. -. T., Wang, C. -. L., Van Aelst, L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 15, (2012).
  34. Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139, 597-609 (2009).
  35. Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

88

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved