Онлайн Визуализация Митоз в развивающихся мышиных эмбриональных Cortex

Резюме

Neural митоза предшественников является критическим параметром нейрогенеза. Большая часть нашего понимания нейронной митоза предшественников на основе анализа основного ткани. Онлайн изображений в эмбриональных срезах мозга является универсальный метод для оценки митоза с высоким временным и пространственным разрешением в контролируемой среде.

Аннотация

Хотя непродолжительны, митоз является сложной и динамичной многоступенчатый процесс основополагающее значение для развития органов, включая мозг. В развивающихся коры головного мозга, нарушение митоза нейронных клеток-предшественников может вызвать дефекты в размере мозга и функции. Таким образом, существует острая необходимость в инструментах, чтобы понять механизмы нервной митоза предшественников. Развития коры у грызунов является выдающимся моделью для изучения этого процесса. Neural митоза предшественников обычно рассматриваются в фиксированных срезов головного мозга. Этот протокол будет подробно описать подход к живого изображения митоза в бывших естественных условиях эмбриональных срезах мозга. Мы опишем важные шаги для этой процедуры, которые включают в себя: добычу мозга, мозг вложение, Vibratome секционирования срезах мозга, окрашивание и культивирование срезов и покадровой обработки изображений. Затем мы продемонстрировать и подробно описывают, как выполнять анализ после приобретения митоза. Мы включаем Представитель Результаты фром этот анализ с использованием жизненно красителя Syto11 трансгенные мыши (гистонов H2B-EGFP и ЦентрИН-EGFP) и внутриутробное электропорации (mCherry-α-тубулина). Мы обсудим, как эта процедура может быть лучше оптимизирован и как он может быть изменен для изучения генетической регуляции митоза. Живая съемка митоза в срезах мозга является гибкий подход к оценке влияния возраста, анатомии, и генетической возмущения в контролируемой среде, и генерировать большое количество данных с высоким временным и пространственным разрешением. Поэтому этот протокол будет дополнять существующие инструменты для анализа нейронной митоза предшественников.

Введение

Общая цель этого протокола заключается в описании, как выполнять Живая съемка нервной митоза предшественников в эмбриональных срезах мозга. Использование живых изображений срезах мозга в культуре, этот протокол обеспечивает простой метод для анализа несколько аспектов митоза в нейронных клеток-предшественников в среде высоко аналогичной обстановке в естественных условиях. Он может быть применен к мозгу мутантных животных и / или мозгов, которые были изменены с внутриутробное электропорации) ^1-5. Этот метод также идеально подходит для проверки эффекта фармакологических агентов на митоз нейронных предшественников, путем простого добавления агента к культуральной среде. В целом, эта статья будет сделать технически сложный протокол доступным для тех, кто учится нейрогенез.

Во время нейрогенеза, различные нервные популяции предшественников пройти точные подразделения генерировать нейроны, которые в конечном итоге способствуют шести корковых слоев взрослого неокортекс ^6-8. В начале развития коры, нейронная бассейн предшественником расширяется нейроэпителиальные (NE) клетки делятся симметрично самообновлению. NE клетки затем конвертировать в радиальных глиальных клеток (РГК). Первоначально РГК разделить симметрично производить два новых РГК, однако во время навалом нейрогенеза, основным видом РГК "деления является асимметричной. В асимметричных делений, 1 РГК приводит к новому РГК и либо постмитотических нейрона, или более специализированный прародителя (либо короткий нейронная предшественника (SNP), внешней радиальной глии (ORG), или промежуточного прародителя (ИЯФ) ^2,3,7,9. INPS, ОНП, и Orgs может генерировать нейроны в суб-желудочка, желудочка и базальных отделах коры, соответственно. Таким образом, деление клетки из клеток-предшественников является фундаментальным процессом генерации нейронов неокортекс.

Многочисленные исследования указывают на корреляции между конкретными митоза черт РГК и судьбе дочерних клеток. Хайдар и др.., А Такахаши и др..показали, что продолжительность митотического РГК и длина клеточного цикла увеличение как нейрогенез доходов, нахождение отражение в последующих исследованиях ^10-13. Ряд исследований показали, что митотического веретена ориентации по отношению к желудочка влияет аспекты нейрогенеза и corticogenesis, в том числе типов нейронов, генерируемых и месте потомства в мозгу, соответственно ^3,10,14-16. Будь декольте самолет ориентация напрямую влияет судьбы клеток является спорным, но вывод остается, что это митотический воздействие параметров нейрогенез. Далее подчеркивает важность митоза является наблюдение, что многие гены, участвующие в механике митоза имеют решающее значение для нейрогенеза и для правильного развития мозга ^17-20.

Митоз представляет собой динамический процесс, но на сегодняшний день большинство исследований подробно нейронной митоза предшественников используют анализ разделов фиксированных тканей или изображений нейронных клеток-предшественников через в пробирке культуре клеток. Таким образом, способы господствующие для оценки митоза только дают представление о данном процессе и не в состоянии раскрыть, как клетки ведут себя в ткани. Живая съемка нервной митоза предшественников все чаще становится важным инструментом для понимания нейронной функции предшественников. Примеры см. эти ссылки ^{4,8,10,21-25.} Несколько выдающихся протоколы были опубликованы для подготовки и обработки изображений срезов мозга ^26,27. Однако до настоящего времени, комплексный протокол для обработки изображений и анализа митоза не было описано и не показано в видео.

Этот метод имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с фиксированной анализа срезов головного мозга. Покадровый анализ срезах мозга позволяет поколение значительно более точек данных, которые могут быть проанализированы в гибкой форме. Во-первых, данные собираются в отдельных точках времени в течение нескольких минут или нескольких часов. Можно анализировать отдельные моменты времени (для создания статического монтаж) илиможно совмещать различные моменты времени в кино. Во-вторых, конфокальной микроскопии срезов позволяет генерировать данные на разных Z секций в срезах мозга. В результате отдельные секции могут быть проанализированы. Кроме того, стеки отдельных секций могут быть объединены в максимальной проекции интенсивности. В-третьих, анализ выполняется в контексте ткани, показывая, как клетки делятся относительно соседних ячеек и сооружений. В-четвертых, он идеально подходит для анализа мутантов, которые показывают некоторые признаки митоза дефектов. Вместе этот протокол поможет прояснить важные шаги, чтобы помочь следователям, которые желают осуществлять живую съемку нервной митоза предшественников в их собственных лабораториях.

протокол

1. Подготовка информации (рис. 1, стадия 1)

1. Кусочек Культура Средний
   1. 25 мл ломтик культуральной среде достаточно, чтобы подготовить 5 стеклянным дном блюда с 2 ломтика на лунку.
   2. В 50 мл коническую трубку, добавить 250 мкл 100x N2 решения и 500 мкл 50x B27 раствора без витамина А. Добавить DMEM/F12 до объема 22,5 мл.
   3. Фильтр стерилизовать раствор, а затем добавить 1,25 мл инактивированной нагреванием лошадиной сыворотки и 1,25 мл фетальной бычьей сыворотки.
   4. Инкубировать раствор в водяной бане при 37 ° С в течение всего срока подготовки ломтиками.
   5. Добавить факторы роста (FGF и EGF, конечную концентрацию 10 нг / мл и 20 нг / мл, соответственно), непосредственно перед началом культуры. В состав этой среды была оптимизирована для содействия выживанию клеток в культуре и увеличить скорость пролиферации нервных клеток-предшественников. Это будет таким образом максимизировать вероятностьнаблюдать митотических клеток в срезе.
2. Полный ССРХ Вскрытие Решение
   1. Приготовления 500 мл HBSS полной добавлением 50 мл 10-кратного HBSS, 1,25 мл 1 М Hepes (рН 7,4, 2,5 мМ FC), 6 мл 2,5 М D-глюкозы (FC 30 мм), 2,2 мл 0,9 М NaHCO ₃ (FC 4 мМ) и обрабатывали в автоклаве DIH ₂ O до конечного объема 500 мл.
   2. Решение Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° С до сбора рогов матки от беременной мыши. Это решение может быть выдерживали при 4 ° С в течение недели.
   3. Держите HBSS на льду во время всей процедуры вскрытия.
3. Встраивание решение
   1. Для вложения 4 эмбриональных мозгов, подготовить 30 мл 3% низкоплавкой агарозе в полном решения HBSS. В 50 мл коническую пробирку, добавляют 0,9 г агарозы с низкой температурой плавления и полного HBSS до 30 мл.
   2. Смешайте раствор с вихревой смеситель, и растопить в микроволновой печи с репутацией трубки и открытой крышкой.
   3. В то время как в микроволновой печи, следить за решение рRevent переполнения из-за чрезмерного кипения. При кипячении начинается, остановить микроволновая печь и вихрь решение.
   4. Повторите эти действия, пока все агарозном не растает.
   5. Хранить трубку в водяной бане при 42 ° С

2. Рассечение эмбрионов (рис. 1, стадия 2)

1. После тщательного эвтаназии беременной мыши, собирать рога матки и передавать их в 10 см ² чашки Петри, содержащей холодной полный 1x HBSS. Возраст эмбриона может варьироваться в зависимости от исследования. Этот протокол был успешно использован для культивирования ломтики мозга от эмбриональных дней E12.5 к E17.5. Благодаря своим размерам, молодые мозги, как правило, сложнее работать.
2. Сбор эмбрионов и рассекать из эмбриональных мозг, как описано выше в крыс и мышей ^26,27 до полного эмбрионального мозга в том числе заднего мозга и переднего мозга с помощью двух полушарий головного мозга не будет получена. Они могут бытьдержали при комнатной температуре, пока все мозги не были расчленены.
3. Сбор эмбрионов и рассекать из эмбриональных мозг, как описано выше в крыс и мышей ^26,27 до полного эмбрионального мозга в том числе заднего мозга и переднего мозга с помощью двух полушарий головного мозга не будет получена. Они могут быть сохранены при комнатной температуре, пока все мозги не были расчленены.

3. Погружение эмбриональных Brains (рис. 1, шаг 3)

1. В ведро с льда, создать дыру в лед, чтобы вставить вложения форм в.
2. Налейте 3% агарозном среды в пластиковые формы и разместить эту форму в отверстие, полученного на льду.
3. Перемешивают в агарозном среду с кончиком цифровым термометром, пока температура не достигнет 35 ° С.
4. Оперативно передавать в мозг в вложения среды.
5. Важнейший шаг: Чтобы удалить избыток HBSS на границе между мозгом и агарозы, тщательно и аккуратно падать / вращать мозг неоднократнов вложения раствора с пинцетом.
6. Подушка из гелеобразного агарозы образуют в нижней части пресс-формы в контакте со льдом. После того, как подушка может ощущаться кончиком пинцета при перемешивании мозг, поместите мозг спинной стороной вверх. Мозг не должны опускаться до самого дна формы.

4. Подготовка агарозном блока (рис. 1, Стади 4)

1. Пусть агароза затвердеет в льду в течение по меньшей мере 5 мин.
2. Использование лезвие, раздел углы формы.
3. Осторожно вырезать агарозы блок вокруг мозга с помощью лезвия бритвы. Постарайтесь свести к минимуму количество сокращений, чтобы избежать возмущения встроенный мозг.
4. Убедитесь, что блок имеет большую площадь поверхности в хвостовой части головного мозга (по сравнению с ростральной области, см. рисунок 1, шаг 4) для улучшения стабильности блока на секционирования пьедестала.
5. Последнее сокращение должно быть тем, на хвостовом стороне мозга;это сокращение будет определять правильный секционирования самолет с Vibratome.
6. Ли так, совместив лезвие перпендикулярно к ростро-хвостовой оси мозга и агарозном блока. Сдвиньте вниз лезвие каудально вдоль ростро-каудальном оси и сделать окончательный вариант около 5 мм от наиболее хвостового отдела головного мозга.
7. Установите блок агарозы / мозга в сторону и повторите вложение других мозгов.

5. Передача Embedded Мозги в лоток на Vibratome (рис. 1, шаг 5)

1. Добавить каплю клея на нижней части Vibratome лотка. Поместите клей, так что агарозы блоки будут расположены в пределах досягаемости вибрирующей лезвия.
2. Поместите блок агарозы / мозг хвостовой стороной вниз на краю лопатки, причем около 50% от опрокидывания блока краю шпателя.
3. Применить хвостовой лицо агарозном блока на клей и сдвиньте шпатель далеко, поддерживая агарозном блок в нижней части лотка с сhoulder из пинцетом. Не позволяйте шпатель напрямую связаться с клеем.
4. Пусть клей затвердеть при комнатной температуре в течение 5 мин.

6. Секционирование из встроенных Brains (рис. 1, Шаг 6)

1. Заполните Vibratome поднос с HBSS.
2. Определить начало и конец позиции Vibratome лезвия.
3. Создать 200 - 250 мкм ломтиками. С Vibratome VT1000s, используйте следующие параметры: скорость 2 - 4, частотные 8.
4. Осторожно снимите ломтики из Vibratome как они отрезаны. Передача ломтики с помощью шпателя и заднем конце пинцетом в 12-луночные планшеты, заполненные полной HBSS. В качестве альтернативы некоторые исследователи использовали кисть вместо пинцета ключевой момент:. Во время передачи, позаботиться о том, ломтики мозга остаются прикрепленными к окружающей агарозы.

7. Syto11 Окрашивание срезов (рис. 1, стадия 7)

1. Развести Syto11 в конечной концентрации0,5 - 1 мкм в ломтик культуральной среде с добавлением факторов роста.
2. В лунку 12-луночного планшета, инкубировать ломтиками от одного мозга в 2,5 мл окрашивающего раствора в течение 1 часа при 37 ° С.
3. Промыть срезы в 2,5 мл культуральной среды среза без окрашивания раствор в течение 20 мин.

8. Монтаж фрагменты В стеклянный Блюдо (рис. 1, шаги 8, 9)

1. Подготовка 15 мкл встраивания коллагена раствора на срез. Готовят раствор 1,5 мг / мл коллагена путем смешивания 375 мкл 3 мг / мл коллагена типа I раствора с 75 мкл 10х DMEM, 9,4 мкл 1 М NaOH и 290 мкл H ₂ O. Храните на льду.
2. Поместите каплю 15 мкл раствора коллагена в нижней части 35 мм Стекло нижней Microwell Блюдо. Распространение его с концом пипетки, чтобы соответствовать размеру среза.
3. Перенести кусочек в каплю коллагена с помощью шпателя и пинцетом Ключевой момент:. Монтаж несколько фрагментов в отличаютсяЛОР блюда увеличивает вероятность приобрести ломтики подходящие для работы с изображениями. Экран с помощью различных срезах и выберите те, которые наилучшим образом отвечают критериям, описанным ниже в разделе "Представительства Результаты".
4. Пусть ломтики инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин до передачи их в инкубаторе 37 ° C с 5% CO _2.
5. Через 20 мин, добавить 1,2 мл ломтик культуральной среде в стеклянным дном Microwell Блюдо. Добавить 600 мкл среды в то время, и развернул его с кончика пипетки.
6. Захват низкой кратности изображение среза мозга для записи анатомическую уровень и целостность среза.

9. Живая съемка ломтики (рис. 1, стадии 10, 11)

1. Пусть ломтики восстановить в инкубаторе в течение по крайней мере 1 часа и 30 минут при 37 ° С с 5% CO ₂ до живого изображения.
2. Изображение ломтики с микроскопом выбора, имея в виду, что Syto11 очень склонны к фотообесцвечивания. Здесь инверсииТед спиннинг диск конфокальной микроскопии используется (Андор XD революция вращающийся диск конфокальной микроскопии). В качестве альтернативы лазерной сканирующей конфокальной микроскопии может быть использован. Следующие параметры для прядения диска микроскопом настройки.
3. В течение всего сеанса живого изображения, поддерживать ломтики при 37 ° С, 5% СО ₂ в увлажненной инкубационной камере, прикрепленной к микроскопом.
4. Клетки изображения с 60X кремния нефти объективом с рабочим расстоянием 300 мкм, и числовой апертурой 1,3 (для примера см. рис 3B, 3C, 3E, 3F, 4А, 4В). Масло цель 100X с рабочей дистанции 130 мкм и числовой апертурой 1,4 (см., например, рис 4C) также могут быть использованы. Разрешение камеры составляет 512 х 512.
5. Изображение ячейки в Z-Stack 30 мкм, с центром Z-Stack, расположенной примерно 40 мкм ниже поверхности среза. Попытка изображение глубже в ткани может вызвать цель, чтобы добавитьмеханическое давление на срезе. Это может повлиять на целостность мозга срез. Если планируете сделать 3D реконструкции ячеек, использовать Z-интервал не более 2 мкм.
6. Отрегулируйте мощность лазера и время экспозиции, чтобы ограничить фотообесцвечивания. Использование время экспозиции в диапазоне от 30 до 200 мс, в зависимости от интенсивности сигнала Syto11.
7. С моторизованным этапе изображений несколько позиций по нескольким ломтиками установлен в 1 блюдо. Например, изображение до 20 позиций, разбросанных по 4-х различных срезов в 1 одном блюде.
8. Для живого изображения, использовать временное разрешение менее 5 мин для обеспечения возможности выявления различных фаз митоза. Использование Syto11 и / или гистон H2B-EGFP, 4 - 5 час из живого изображения достаточно, чтобы наблюдать значительное количество митотических клеток. Однако, если томография редко помечены митотических клеток (например, те, достигается в маточно электропорации), то больше визуализации параметров (на ночь) подходит и работает мыLL.
   Примечание: Используя этот протокол, мы обычно наблюдаем в среднем 10 митоза клеток на месте. Как указано выше, множественный изображения установлен ломтики увеличивает вероятность имеющих успешный эксперимент. При таком подходе мы обычно определить митотических клеток практически во всех экспериментов, выполненных с Syto11 или гистона H2B-EGFP.

10. После приобретения Анализ Митоз (рис. 2)

Все процедуры в этом разделе были оптимизированы на Фиджи (ImageJ), что выгодно, потому что это бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом. Другие программные решения доступны для выполнения тех же задач, таких как Metamorph, Imaris и Amira.

1. Идентификация митотических фигур на Фиджи
   1. После открытия набора данных для одной позиции, как "HyperStack" выберите один плоскость г (см. рис 2А для расположения на полосе прокрутки), где ткань и клетки выглядят здоровыми (см. критерии в разделе обсуждения).Выделите через временном измерении определить клетки, проходящие через анафазе, как это самый простой митотический фаза идентифицировать.
   2. Выделите назад во времени, чтобы определить точку во времени, когда клетка вступает в митоз (конденсация ДНК). Клетка может перемещаться по Z-плоскостей, но временное разрешение и параметры Z-Stack, описанные ранее были оптимизированы для того, чтобы этот процесс.
   3. В электронной таблице, запишите 4D координаты ячейки в HyperStack (X, Y, Z и времени, см. рисунок 2А визуализировать расположение этих фигур в интерфейсе Фиджи), поскольку это входит в митоз. Зная эти координаты помешает считая той же клетке в несколько раз.
   4. Прокрутка вперед во времени и записывать время, когда клетка переходит из одной фазы в другую. Документ продолжительность каждого митотического фазы для одного данной ячейки.
   5. Перейдите с другими клетками, по всей набора данных (несколько клеток в учебных позиций).
2. 3D Реконструкционный из клеток и Количественное определение вращения во время метафазы (адаптировано из Гейдара и др., 2003) (рис. 2В).
   1. Выявив несколько митотических клеток, не использовать координаты ячейки и прокрутите вперед во времени до начала метафазы.
   2. Поверните весь "HyperStack" таким образом, чтобы желудочка граница плоская (с помощью команды "Изображение / Transform / Rotate ..."). Используйте "угол" инструмент для определения угла применять для этого вращения.
   3. Определить плоскость г, где клетка представляет интерес является наиболее наглядным. В этой плоскости, используйте "прямоугольник выбора" инструмент, чтобы нарисовать выбор, который включает всю ячейку.
   4. Определить Z-самолеты, которые включают в клетку интересов. Используйте команду "Изображение / Дублировать», чтобы создать "суб-стек". В диалоговом окне, оставить "Duplicate HyperStack" проверили. "Кусочки (г)" параметр соответствует Z-плоскостей в том числе всей сеLL, и "Рамки (т)" параметр соответствует текущей момент времени.
   5. Если разрешение оставляет желать лучшего, увеличить размер "к югу от стека", используя "Изображение / Adjust / размер ..." команду.
   6. Создайте 3D-реконструкция ячейки в текущей момент времени, используя "Image/Stacks/3D проект ...» команду. Параметры этой команды отображаются на рисунке 2B. "Расстояние между Slice" соответствует интервалу между каждой из Z-Plane изображений (мкм). Важно: убедитесь, что физический размер (мкм) к югу от стека был сохраняется. Если нет, то интерполяция пикселей в размерности г будет неправильным, и реконструкция 3D будет неточным.
   7. Используя полосу прокрутки, вращать полученный 3D-реконструкция, так что край метафазной пластинки видна. Номер кадра соответствует бета углом, описанной на фигуре 3В, записать этот номер. Использование"Угол" инструмент и "Анализ / Мера ..." команду, измерить угол между горизонтальной плоскости и линии рассекает метафазной пластинки перпендикулярно (рис. 2В). Это угол альфа.
   8. Запись эти углы для всех временных точках метафазных клетки интереса. Угол поворота между точками времени (Т) и (Т-1) равна абсолютной величине разницы между углом в (Т) и под этим углом на (Т-1).
3. Измерение ориентации плоскости спайности
   1. 3D реконструкции ячейку интереса в свое время точку во время анафазы, следуя инструкциям, описанным для 3D реконструкции метафазных пластинок.
   2. Поворот реконструкцию до края двух пластин, образованных сегрегирующих хромосом не видны.
   3. Используйте инструмент угол, чтобы измерить угол между горизонтальной (желудочковая край) и линию, параллельную двух пластин, образованных сегрегирующих хромосом. Это угол плоскости спайности (рис. 2в).
4. Генерация Фильмы
   1. Как клетки часто перемещаются между различными Z-плоскостей, определить Z-самолеты, занятые ячейки во время прямого сессии изображений. Генерация "Максимальная проекцию интенсивности» этих Z-плоскостях с помощью "Image / стеки / Z проект ...» команду. Сохраните полученное стек в виде файла ". TIF».
   2. Откройте этот файл в 1,45 версии ImageJ как Фиджи не включает стабильный плагин для генерации ". Мов" или ". Ави" файлов.
   3. Используйте "Файл / Сохранить как / ..." командованием ImageJ для создания фильма в формат, совместимый с вашим ниже по течению приложений.

Результаты

Успех этого анализа и наблюдение нескольких митотических клеток в течение одного живого изображений сессии в значительной степени зависит от обоих целостности и анатомической уровне среза, где приобретения сделаны. Как будет показано ниже, анатомическая уровень кусочком является ва...

Обсуждение

Основным преимуществом протокола мы описали, что она обеспечивает динамический временное разрешение митоза нейронных клеток-предшественников. Как правило, анализы визуализировать митоза в развивающемся мозге выполняются с помощью иммунофлюоресценции секций фиксированных тканей. ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
100X N2	Life technologies	17502048	for culture medium
50X B27 without vitamin A	Life technologies	12587010	for culture medium
DMEM/F12	Life technologies	11320033	for culture medium
Heat-inactivated horse serum	Sigma Aldrich	H1138-500ml	for culture medium
Heat-inactivated calf serum	Sigma Aldrich	F4135-500ML	for culture medium
FGF	R&D Sytems	3139-FB-025	for culture medium
EGF			for culture medium
10X HBSS	Life technologies	14065-056	for the dissection of the embryos
Hepes Free Acid	Sigma Aldrich	H4034	dilute to 1M (pH7.4)
2.5M D-Glucose	Sigma Aldrich	G8769	for the dissection of the embryos
0.9M NaHC03	Life technologies	25080-094	for the dissection of the embryos
low-melting agarose	Fisher	BP165-25	for generating slices
Loctite 404 glue	Loctite 404	46551	keep at 4˚C
syto11	Life technologies	S7573	Make 5µl aliquots
3 mg/ml collagen type I	Life technologies	A1048301	for culturing slices
glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	for culturing slices
petri dishes			for dissection of the embryos
digital thermometer			to measure the temperature of the agarose
spatula			to transfer brains
paintbrush			alternative to transfer brains
vibratome	Leica	VT1000s	for generating slices
dissecting microscope			dissecting out embryos
imaging microscope			A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber