Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Özet

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Özet

Kısa süreli de, mitoz beyin de dahil olmak üzere organların gelişimi için temel karmaşık ve dinamik çok adımlı bir işlemdir. Gelişmekte olan serebral korteks, sinir atalarıdır anormal mitoz beyin büyüklüğü ve işlevi bozukluklara neden olabilir. Bu nedenle, nöral progenitör mitoz mekanizmalarını anlamak için araçlar için kritik bir ihtiyaç vardır. Kemirgenlerde kortikal gelişim bu sürecin eğitim için olağanüstü bir modeldir. Nöral progenitör mitoz sık sabit beyin bölümlerinde incelenmiştir. Bu protokol ayrıntılı olarak ex vivo embriyonik beyin dilimleri mitoz canlı görüntüleme için bir yaklaşım anlatacağız. Beyin çıkarma, beyin gömme, beyin dilimleri Vibratome bölümlendirilmeleri, lekelenme ve dilimleri kültürlemenin ve time-lapse görüntüleme: Biz dahil olan bu işlem için kritik adımları anlatacağız. Biz o göstermek ve mitoz alım sonrası analizi gerçekleştirmek için nasıl ayrıntılı olarak anlatacağız. Biz temsili sonuçları fr dahilom hayati boya Syto11, transgenik fareler (histon H2B-EGFP ve merkezleme-EGFP) ve utero elektroporasyon (MCherry α-tubulin) kullanarak bu deneyi. Bu işlem en iyi optimize edilebilir nasıl ve mitoz genetik düzenleme çalışması için modifiye edilebilir nasıl tartışacağız. Beyin dilimleri mitoz Canlı görüntüleme kontrollü bir ortamda yaş, anatomi ve genetik pertürbasyonun etkisini değerlendirmek ve yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile veri büyük miktarda üretmek için esnek bir yaklaşımdır. Dolayısıyla bu protokol nöral progenitör mitoz analizi için mevcut araçları tamamlayacak.

Giriş

Bu protokolün genel amacı embriyonik beyin dilimleri nöral progenitör mitoz canlı görüntüleme gerçekleştirmek için nasıl tarif etmektir. Kültürde beyin dilimleri canlı görüntüleme kullanarak, bu protokol, bir in vivo ortamda yüksek oranda benzer bir ortamda sinir progenitörlerin mitoz yönlerine bir çok yönü tahlil için basit bir yöntem sağlamaktadır. It) utero elektroporasyon ile ^1-5 manipüle edilmiş olan mutant hayvan ve / ya da beyin beyinlerine uygulanabilir. Bu teknik sadece kültür ortamına bir madde eklenmesi ile, sinir ön-'mitoz ile ilgili farmakolojik maddelerin etkisini test etmek için de idealdir. Özetle, bu makalede nörogenezi okuyan bir teknik zorlu protokol erişilebilir hale getirecek.

Nöron sırasında, farklı nöral progenitör popülasyonları sonunda ^6-8 neokorteks yetişkin altı kortikal katmanları katkıda nöronlar oluşturmak için kesin bölünmeler tabi. Nöroepitel (NE) hücreler, kendini yenileme simetrik bölmek gibi erken kortikal geliştirme, nöral prekürsör havuzu genişler. NE hücreler daha sonra radyal glial hücreler (RGCs) dönüştürmek. Başlangıçta RGCs ancak nöron toplu sırasında, bölünme RGCs 'ana mod asimetrik olup, iki yeni RGCs üretmek için simetrik bölmek. Asimetrik bir bölümü olarak, 1 RGC yeni RGC ve ya bir post-mitotik nöron ya da daha özel bir progenitör (ya da kısa sinir öncü (SNP), bir dış radyal glia (ORG), ya da bir ara progenitör (INP) yol açar ^2,3,7,9. INPS, SNP ve Orgs sonra alt ventrikül, ventriküler nöronların üretebilir, ve korteks bazal bölgeleri, sırasıyla. Dolayısıyla, atalarıdır hücre bölünmesi nöronları üretmek için temel bir süreçtir neokorteks.

Çeşitli çalışmalar belirli mitoz RGCs özellikleri ve kızı hücrelerinin kaderi arasında bir korelasyon olduğuna işaret. Haydar et al. Ve Takahashi et al.RGC mitoz süresi ve nöron ilerledikçe hücre döngüsü uzunluğu artışı, bir bulgu çalışmalar ^10-13 takip yankılandı olduğunu göstermiştir. Bir dizi çalışma ventriküle mitotik iğ yönlendirme göre, sırasıyla, beyinde üretilen nöronların türleri ve döl konumu, ^3,10,14-16 içeren nöron ve kortikogenezin yönlerini etkileyen olduğunu ileri sürmüşlerdir. Yarılma düzlemi yönlendirilmesi, doğrudan hücre kaderini etkiler tartışmalıdır, ama sonuç bu mitoz parametre etkiler nöron kalır. Daha fazla mitoz önemini vurgulayan mitoz mekaniği oynayan çok sayıda gen nöron ve uygun beyin gelişimi için ^17-20 çok önemli olduğunu gözlemdir.

Mitoz dinamik bir süreç, henüz bugüne kadar nöral progenitör mitoz ayrıntılı çalışmaların çoğu in vitro hücre kültürü yoluyla sabit doku bölümleri veya nöral atalarıdır görüntüleme analizini kullanmak. Böylece, mitoz değerlendirmek için genel yöntemleri sadece bu sürecin bir anlık sağlamak ve hücreler bir dokuda nasıl davrandığını ortaya çıkarmak için başarısız. Nöral progenitör mitoz Canlı görüntüleme giderek nöral progenitör işlevini anlamak için kritik bir araç haline gelmiştir. Örnekler için bu referanslar bakınız ^{4,8,10,21-25.} Çeşitli seçkin protokoller hazırlanması ve beyin dilimleri ^26,27 görüntülenmesi için yayınlanmıştır. Ancak bugüne kadar, görüntüleme ve mitoz analizi için geniş kapsamlı bir protokolü tarif edilmemiştir veya video gösterdi.

Bu teknik, beyin bölümlerinin sabit analizi üzerinde çeşitli önemli avantajlar sunar. Beyin dilimleri Time-lapse analiz esnek bir şekilde analiz edilebilir ölçüde daha fazla veri noktaları nesil sağlar. İlk olarak, veri birkaç dakika veya birkaç saat boyunca ayrı zaman noktalarında toplanmıştır. Bir birey zaman noktaları (statik bir montaj oluşturmak için) ya da analiz edebilirsinizfilm içine farklı zaman noktaları birleştirebilirsiniz. İkincisi, dilim konfokal görüntüleme beyin dilimleri farklı Z bölümlerde veri nesil sağlar. Sonuç olarak, ayrı ayrı bölümler analiz edilebilir. Seçenek olarak ise, tek tek bölümlerin yığınları maksimum yoğunluk çıkıntı halinde birleştirilebilir. Üçüncü olarak, analiz hücreler komşu hücreler ve yapılarına göre bölmek ortaya koyarak, bir doku bağlamında yapılır. Dördüncü olarak, bu ideal mitotik kusurları bazı kanıtlar göstermektedir mutantların analizi için uygundur. Birlikte bu protokol, kendi laboratuarlarında nöral progenitör mitoz canlı görüntüleme yürütmek isteyen araştırmacılara yardımcı olmak için önemli adımlar netleştirmeye yardımcı olacaktır.

Protokol

Medya 1. Hazırlanması (Şekil 1, Aşama 1)

1. Dilim Kültür Ortamı
   1. Dilim kültür ortamı içinde 25 mi, oyuk başına 2 ile 5 dilim cam alt yemekler hazırlamak için yeterlidir.
   2. 50 ml konik bir tüp içinde, bir N2 100x çözeltisi 250 ul ve A vitamini 22,5 ml 'lik bir hacme kadar DMEM/F12 ekle olmayan bir 50x B27 çözeltisi 500 ul ekleyin.
   3. Filtre solüsyonu sterilize etmek ve daha sonra ısı ile inaktive edilmiş at serumu 1.25 ml ve fetal inek serumu, 1.25 ml.
   4. Dilimlerinin hazırlanması süresince 37 ° C'de bir su banyosunda solüsyon inkübe edin.
   5. Büyüme faktörleri (FGF ve EGF, 10 nihai konsantrasyona ekleme ng / ml ve 20 hemen önce kültür başına), sırasıyla, ng / ml. Bu ortamın bir bileşim kültürde hücrelerin hayatta kalmasını geliştirmek için ve sinir progenitörlerin proliferasyonunu oranını artırmak için optimize edilmiştir. Bu, böylece için olasılık maksimize edecekdilim mitotik hücreler görüyoruz.
2. Tam HBSS Diseksiyon Çözüm
   1. , 0.9 M NaHCO ₃ 2.2 ml 1 M Hepes, 1.25 ml (pH 7.4, 2.5 mM FC), 2.5 M D-Glukoz 6 ml (FC 30 mM) HBSS 10x, 50 ml ilave etmek suretiyle, tam HBSS 500 ml hazırlayın 500 ml'lik nihai hacme kadar diH ₂ O otoklav (FC 4 mM) ve.
   2. Gebe fare rahim boynuzları koleksiyonu kadar 4 ° C'de sterilize çözüm ve mağaza. Bu çözelti hafta boyunca 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
   3. Bütün diseksiyon prosedür sırasında buz üzerinde HBSS tutun.
3. Çözüm gömme
   1. 4 embriyonik beyinlerin gömme için, tam HBSS çözeltisi içinde% 3 düşük erime noktalı agarozun 30 ml hazırlar. 50 ml konik tüp, 30 ml düşük erime noktalı agaroz ve tam HBSS 0.9 g.
   2. , Bir girdaplı karıştırıcı ile çözüm karıştırın ve tüp duran ve kapak açık olan bir mikrodalga içinde eritin.
   3. Mikrodalgada, p çözüm izlemek daAşırı kaynama nedeniyle Revent taşması. Başlar kaynarken, mikrodalga durdurmak ve çözüm vorteks.
   4. Tüm agaroz eriyene kadar bu adımları tekrarlayın.
   5. 42 ° C'de bir su banyosu içinde tüpü saklayın

Embriyoların 2. Diseksiyonu (Şekil 1, Adım 2)

1. Hamile fare dikkatli ötenazi sonra, rahim boynuzları toplamak ve soğuk dolu 1x HBSS içeren 10 cm ² Petri kabı içine aktarabilirsiniz. Embriyonun yaşı çalışmaya bağlı olarak değişebilir. Bu protokol E17.5 embriyonik gün E12.5 beyin dilimleri kültürlemek için başarıyla kullanılmaktadır. Onların büyüklüğü nedeniyle, genç beyinleri ile çalışmak daha zor olma eğilimindedir.
2. Embriyoların toplayın ve iki hemisferdeki ile arka beyin ve ön beyin de dahil olmak üzere tam bir embriyonik beyin elde edilene kadar, sıçan ve fare ^26,27 daha önce tarif edildiği gibi embriyonik beynini incelemek. Bu olabilir,tüm beyinleri edilene kadar oda sıcaklığında tutulması.
3. Embriyoların toplayın ve iki hemisferdeki ile arka beyin ve ön beyin de dahil olmak üzere tam bir embriyonik beyin elde edilene kadar, sıçan ve fare ^26,27 daha önce tarif edildiği gibi embriyonik beynini incelemek. Tüm beyinleri edilmiştir kadar bu, oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.

3.. Embriyonik Brain gömülmesi (Şekil 1, Adım 3)

1. Bir kova içeren buz olarak, gömme kalıp içine eklemek için buz içinde bir delik oluşturmak.
2. Plastik bir kalıba% 3 agaroz orta dökün ve buz içinde hazırlanan delik kalıp içine yerleştirin.
3. Sıcaklık 35 ° C'ye ulaşana kadar dijital bir termometre ucu ile agaroz orta karıştırın
4. Derhal gömme ortamı içine beyin aktarın.
5. Kritik Basamak: dikkatli bir şekilde, beyin ve agaroz arasındaki ara yüzeyde fazla HBSS kaldırmak için tekrar tekrar ve yavaşça / beyin döndürme çamaşırforseps ile gömme çözeltide.
6. Agaroz jel bir yastık buz ile temas kalıbın altındaki oluşturacaktır. Beyin karıştırılırken yastık forseps ucu ile hissedilebilir kez, dorsal yüzü yukarı ile beyin yerleştirin. Beyin kalıp çok dibine batırmak olmamalıdır.

Agaroz Blok 4. Hazırlama (Şekil 1, Adım 4)

1. Agaroz en az 5 dakika boyunca buz içinde sertleşmeye olsun.
2. Bir tıraş bıçağı kullanarak, bölüm kalıbın köşelerinde.
3. Dikkatli bir jilet kullanarak beyin çevresinde bir agaroz blok bölmek. Gömülü beyin karışmasını önlemek için kesim sayısını en aza indirmek için deneyin.
4. Kesit kaide üzerinde bloğun kararlılığını arttırmak için (Şekil 1, Adım: 4, rostral bölge karşı) blok beynin kaudal bölgede daha büyük bir yüzey alanına sahip olduğundan emin olun.
5. Son kesim beynin kaudal tarafında biri olmalıdır;Bu kesim Vibratome ile doğru kesit düzlemini tanımlamak olacaktır.
6. Beyin rostro-kaudal ekseni ve agaroz bloğuna dik olarak bıçağın bunu. Caudally rostro-kaudal ekseni boyunca bıçak aşağı kaydırın ve yaklaşık 5 mm uzakta beynin en kaudal bölgeden son kesim yapmak.
7. Kenara agaroz / beyin bloğu ayarlayın ve diğer beyinleri gömülmesini tekrarlayın.

Vibratome Tepsi içine gömülü Brain 5. Transferi (Şekil 1, Adım 5)

1. Vibratome tepsinin dibine üzerine tutkal bir damla ekleyin. Agaroz blok titreşimli kanadın ulaşılabilecek yerleştirilmiş olacak, böylece yapıştırıcı yerleştirin.
2. Spatula kenarı üzerinde blok devrilme yaklaşık% 50 ile, spatula kenarında agaroz / beyin blok kaudal tarafı aşağı yerleştirin.
3. Tutkal agaroz blok kaudal yüzünü uygulayın ve s ile tepsinin altına agaroz blok bakımı, uzakta spatula kaydırıncımbız bir çift houlder. Spatula doğrudan tutkal temasa izin vermeyin.
4. Tutkal 5 dakika boyunca oda sıcaklığında katılaşmaya olsun.

Gömülü Brain 6. Kesit (Şekil 1, Adım 6)

1. HBSS ile vibratome tepsiyi doldurun.
2. Vibratome bıçak başlangıç ​​ve bitiş pozisyonları tanımlayın.
3. 250 mikron dilimleri - 200 oluşturun. - 4, frekans 8 hız 2: VT1000S Vibratome ile, aşağıdaki parametreleri kullanın.
4. Onlar kesilir gibi dikkatle Vibratome gelen dilim çıkarın. Tam HBSS ile dolu 12 iyi yemekleri içine bir spatula ve cımbız arka ucu ile dilimleri aktarın. Alternatif olarak bazı araştırmacılar, cımbız yerine bir fırça kullanmış Anahtar nokta:. Transferi sırasında, beyin dilimleri çevreleyen agaroz takılı kalması dikkat.

Dilimler 7. Syto11 lekelenmesi (Şekil 1, Adım 7)

1. Bir son konsantrasyon için Syto11 seyreltin0,5 - Dilim kültür ortamı içinde 1 uM büyüme faktörleri ile takviye edilmiştir.
2. Bir 12-yuvalı plaka oyuğuna olarak, 37 ° C'de 1 saat boyunca boyama çözeltisinin 2.5 ml bir beyin dilimleri inkübe
3. 20 dakika boyunca solüsyon lekelemeden dilim kültür ortamına 2.5 ml dilimleri yıkayın.

8. A Glass Bottom Bulaşık Dilimleri Montaj (Şekil 1, Adım 8, 9)

1. Dilim başına kollajen çözüm gömme 15 ul hazırlayın. 10x DMEM, 1 M NaOH 9.4 ul ve H ₂ 290 ul O'dan 75 ul ile 3 mg / ml tip I kolajen çözeltisi 375 ul karıştırılarak bir 1.5 mg / ml kolajen çözeltisi hazırlayın Buz üzerinde saklayın.
2. 35 mm bir cam taban Microwell Bulaşık altındaki kolajen çözeltisi, 15 ul damla yerleştirin. Dilimin büyüklüğüne uygun bir pipet ucu ile yayıldı.
3. Cımbız, bir spatula ve çift kollajen düşüş içine dilim aktarın Anahtar nokta:. Farklı birden çok dilim Montajent yemekler görüntüleme için uygun dilimleri elde etmek için olasılığını arttırır. Ekran farklı dilimlerde ve en iyi "Temsilcisi Sonuçlar" bölümünde, aşağıda açıklanan kriterlere uygun olanları seçin.
4. Dilimleri% 5 _CO2 içeren bir 37 ° C inkübatör içine transfer etmeden önce 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
5. 20 dakika sonra, cam alt Microwell çanağı içine dilim kültür ortamı, 1.2 ml. Bir seferde ortamın 600 ul ilave edin ve bir pipet ucu ile yayıldı.
6. Dilim anatomik seviyesini ve bütünlüğünü kaydetmek için beyin dilim düşük bir büyütme görüntü yakalayın.

Dilimleri 9. Canlı Görüntüleme (Şekil 1, 10, 11 Steps)

1. Dilimleri canlı görüntüleme önce,% 5 _CO2 ile 37 ° C'de en az 1 saat ve 30 dakika boyunca kuluçka makinesi içinde geri olsun.
2. Syto11 Photobleaching çok eğilimli olduğunu göz önünde tutarak seçim mikroskop ile görüntü dilimleri. Bir inver Buradated dönen disk konfokal mikroskop (Andor XD devrim dönen disk konfokal mikroskop) kullanılır. Alternatif olarak, bir lazer tarama konfokal mikroskop kullanılabilir. Aşağıdaki parametreler dönen disk mikroskop set-up için vardır.
3. Bütün canlı görüntüleme oturumu sırasında, 37 ° C, mikroskop bağlı bir inkübasyon odası içinde nemlendirilmiş% 5 _CO2 de dilim korumak.
4. 300 mikron bir çalışma mesafesi ile 60X silikon yağı objektif ve 1.3 bir sayısal diyafram ile Görüntü hücreler (örnekler Şekil 3B, 3C, 3E, 3F, 4A, 4B için bkz). 130 um'lik bir çalışma mesafesi ve 1.4 'lük bir sayısal açıklığı olan bir 100X yağ amacı, (örneğin, Şekil 4C bakınız) de kullanılabilir. Kameranın çözünürlüğü 512 x 512 olduğunu.
5. Yaklaşık 40 um dilim yüzeyinin altında yer alan z-yığınının merkezi ile bir 30 um-z yığını, Görüntü hücreler. Doku içine daha derin görüntü çalışırken amaç eklemek neden olabilirdilim mekanik basınç. Bu beyin dilim bütünlüğünü etkileyebilir. Planlama hücrelerin 3 boyutlu rekonstrüksiyon yapmak için ise, artık mikron 2 den bir z-aralığı kullanınız.
6. Photobleaching sınırlamak için lazer güç ve maruz kalma sürelerini ayarlayın. 30 ila Syto11 sinyalin yoğunluğuna bağlı olarak 200 ms arasında değişen maruz bırakma sürelerinin kullanılması.
7. , Bir motorlu kaide ile, birden fazla görüntü dilimleri üzerinde birden fazla pozisyon 1 kabına monte edilmiştir. 1 tek tabak 4 farklı dilimlere dağılmış 20 pozisyonları Örneğin, görüntü yukarı.
8. Canlı görüntüleme için, mitoz farklı aşamalarının belirlenmesini sağlamak için en az 5 dakika bir zamansal çözünürlük kullanın. Syto11 ve / veya histon H2B-EGFP kullanılarak, 4 - canlı görüntüleme 5 saat mitotik hücre önemli sayıda gözlemlemek için yeterlidir. Görüntüleme seyrek (örneğin utero elektroporasyon elde gibi) mitotik hücreleri etiketli Ancak, daha sonra uzun bir görüntüleme parametresi (gece) uygun olduğunu ve biz işlerill.
   Not: Bu protokolü kullanarak, biz genellikle pozisyon başına ortalama 10 mitotik hücreler üzerinde gözlemlemek. Yukarıda belirtildiği gibi, görüntüleme birden çok dilim monte başarılı bir deney sahip olasılığını artırır. Bu yaklaşım ile, tipik haliyle Syto11 ya da histon H2B-EGFP ile yapılan hemen hemen tüm deneylerde, hücreler mitotik belirlemek.

10. Mitoz Post-satın alma Analizi (Şekil 2)

Bu bölümdeki tüm işlemler bu ücretsiz açık kaynak kodlu bir yazılım olduğu için avantajlıdır Fiji (İmageJ), optimize edilmiştir. Diğer yazılım çözümleri gibi Metamorph, Imaris ve Amira gibi aynı görevleri gerçekleştirmek için kullanılabilir.

1. Mitotik tanımlanması Fiji Rakamlar
   1. Bir "hyperstack" gibi bir pozisyon için veri kümesini açtıktan sonra, doku ve hücrelerin sağlıklı bakmak yere (tartışma bölümünde Kriterler) (kaydırma çubuğunun konumu için Şekil 2A) bir z-düzlem seçin.Bu tanımlamak için en kolay mitotik faz olarak, Anafazda geçiyor hücreleri tanımlamak için zamansal boyutu boyunca ilerleyin.
   2. Hücre mitoz (DNA yoğunlaşması) girdiği zaman noktasını belirlemek için zamanda geriye gidin. Hücre z-düzlemleri üzerinde hareket edebilir, ama zamansal çözünürlük ve daha önce açıklanan z-yığın parametreleri bu süreci sağlamak için optimize edilmiştir.
   3. Bir elektronik olarak, mitoz girerken (Fiji arayüzünde bu rakamların yerini görselleştirmek için Şekil 2A, X, Y, Z ve zaman) 4D hyperstack hücrenin koordinatlarını kaydetmek. Bu koordinatlarını bilerek aynı hücreye birkaç kez sayım önleyecektir.
   4. Zaman içinde ilerlemek ve hücre bir fazdan diğerine ilerledikçe zamanı kaydedecektir. Bir belirli bir hücre için, her bir mitotik fazının süresini belge.
   5. Tam bir veri kümesi üzerinde diğer hücreler, (içinde ve konumlarındaki birden hücreler) ile devam edin.
2. 3D Yeniden İnşaHücreler iyon ve metafaz sırasında dönme kantitasyonu (Haydar et al, 2003 'den uyarlanmıştır) (Şekil 2B).
   1. Metafaz başına kadar birden mitoz hücre tespit ettikten sonra, bir hücrenin koordinatlarını kullanmak ve zaman içinde ilerleyin.
   2. Ventriküler sınır ("Resim / Transform / Döndür ..." komutunu kullanarak) düzlemsel böylece tüm "hyperstack" döndürün. Bu dönüş için başvuruda açısını belirlemek için "açı" aracını kullanın.
   3. Ilgi hücre en görünür olduğu z-düzlemi tanımlayın. Bu düzlemde, tüm hücreyi içeren bir seçim çizmek için "dikdörtgen seçim" aracını kullanın.
   4. Ilgi konusu hücre, z-uçakları belirlenmesi. Bir "alt-yığını" yaratmak için "Image / Kopyala" komutunu kullanın. Iletişim kutusunda, kontrol "Duplicate hyperstack" bırakın. "Dilimler (z)" parametresi de dahil olmak üzere bütün ce z-düzlemlerine karşılıkll, ve "Çerçeve (t)" parametresi, geçerli zaman noktasına karşılık gelir.
   5. Çözünürlük kötü ise, "Resim / ayarla / Boyutu ..." komutunu kullanarak "alt yığın" boyutunu artırır.
   6. "Image/Stacks/3D projesini ..." komutunu kullanarak şimdiki zaman noktasında hücrenin bir 3D yeniden oluşturun. Bu komut için parametreler Şekil 2B'de görüntülenir. "Dilim aralık" z-düzlemi görüntüleri (um) her biri arasındaki aralığa karşılık gelir. Önemli: alt yığın fiziksel boyutu (mikron) muhafaza edilmiş olduğundan emin olun. Eğer değilse, z boyutta piksel interpolasyon yanlış olacaktır ve 3D rekonstrüksiyonu yanlış olacaktır.
   7. Metafaz plakasının kenar görülebilir, böylece kaydırma çubuğunu kullanarak, sonuçta elde edilen 3D yeniden döndürün. Çerçevenin sayısı, Şekil 3B'de tarif edilen beta açıya karşılık gelir, bu numarayı kaydedin. Kullanma"açı" aracı ve "Analiz / Tedbir ..." komutu, yatay ve (Şekil 2B) dik metafaz plakayı ikiye ayıran bir çizgi arasındaki açıyı ölçmek. Bu açı alfa.
   8. Ilgi konusu hücrenin tüm metafaz zaman noktaları için bu açıları kaydedin. Zaman noktalarında (t) ve (t-1) arasındaki dönme açısı (t-1), (T) bir açı ve bu açısı arasındaki farkın mutlak değerine eşittir.
3. Yarılması Plane Yönünü Ölçme
   1. Metafaz plakaların 3D rekonstrüksiyon için açıklanan talimatları izleyerek Anafazda sırasında bir zaman noktasında bir ilgi hücreyi yeniden 3D.
   2. Ayırma kromozomlar ile oluşturulan, iki levhanın kenarları görebilir kadar yeniden döndürün.
   3. Yatay arasındaki açı (ventriküler kenar) ve bir ayırma kromozomlar ile oluşturulan, iki plakalara paralel bir çizgi ölçmek için açı aracını kullanarak. Bu yarılma düzleminin (Şekil 2C) açıdır.
4. Film Üretimi
   1. Hücreler genellikle farklı z-düzlemleri üzerinde hareket olarak, canlı görüntüleme oturumu sırasında hücre tarafından işgal z uçakları tespit. "Görüntü / Bacalar / Z projesi ..." komutunu kullanarak bu z-uçaklık bir "Maksimum yoğunluk projeksiyonu" oluşturun. Bir ". TIF" dosyası olarak çıkan yığını kaydedin.
   2. Fiji ". Mov" veya ". Avi" dosya nesil için istikrarlı bir eklenti içermez gibi ImageJ 1.45 sürümünde bu dosyayı açın.
   3. Aşağı-akış uygulamaları ile uyumlu bir formatta bir film oluşturmak için ImageJ komuta "... / olarak Dosya / Kaydet" kullanın.

Sonuçlar

Bu deneyde başarısı ve bir canlı görüntüleme oturumu sırasında birden fazla mitotik hücre gözlem büyük ölçüde bütünlüğü ve satın yapılır dilimin anatomik düzeyde hem bağlıdır. Aşağıda tartışıldığı gibi, bir dilim anatomik düzeyi önemli bir faktördür. Şekil 3A rostro-caudal gösterir ve medial-lateral biz en başarılı olmuştur yerleri. Bu konuda ek tartışma için Noctor ²⁶ bakın. Dilimin bütünlüğü dilim farklı bölgelerinde değişiklik gö...

Tartışmalar

Tarif ettiğimiz protokolün önemli bir avantajı sinir atalarıdır mitoz dinamik bir zamansal çözünürlük sağlamasıdır. Tipik olarak, gelişmekte olan beyinde mitoz görselleştirmek için deneyler, sabit bir doku bölümlerinin immünofloresan kullanılarak gerçekleştirilir. Ama bu yaklaşım sadece bir zaman noktasında mitoz bir anlık görüntüsünü sağlar.

Beyin dilimleri mitoz görüntüleme için en kritik olan birkaç adım vardır: 1) beyin dilimleri transferi ve mont...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
100X N2	Life technologies	17502048	for culture medium
50X B27 without vitamin A	Life technologies	12587010	for culture medium
DMEM/F12	Life technologies	11320033	for culture medium
Heat-inactivated horse serum	Sigma Aldrich	H1138-500ml	for culture medium
Heat-inactivated calf serum	Sigma Aldrich	F4135-500ML	for culture medium
FGF	R&D Sytems	3139-FB-025	for culture medium
EGF			for culture medium
10X HBSS	Life technologies	14065-056	for the dissection of the embryos
Hepes Free Acid	Sigma Aldrich	H4034	dilute to 1M (pH7.4)
2.5M D-Glucose	Sigma Aldrich	G8769	for the dissection of the embryos
0.9M NaHC03	Life technologies	25080-094	for the dissection of the embryos
low-melting agarose	Fisher	BP165-25	for generating slices
Loctite 404 glue	Loctite 404	46551	keep at 4˚C
syto11	Life technologies	S7573	Make 5µl aliquots
3 mg/ml collagen type I	Life technologies	A1048301	for culturing slices
glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	for culturing slices
petri dishes			for dissection of the embryos
digital thermometer			to measure the temperature of the agarose
spatula			to transfer brains
paintbrush			alternative to transfer brains
vibratome	Leica	VT1000s	for generating slices
dissecting microscope			dissecting out embryos
imaging microscope			A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber