Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

Riepilogo

Progenitrici neurali mitosi è un parametro critico della neurogenesi. Gran parte della nostra comprensione delle progenitrici neurali mitosi si basa sull'analisi del tessuto fisso. Vivo imaging in fettine cerebrali embrionali è una tecnica versatile per valutare mitosi con alta risoluzione temporale e spaziale in un ambiente controllato.

Abstract

Anche se di breve durata, mitosi è un processo multi-step complesso e dinamico fondamentale per lo sviluppo di organi compreso il cervello. Nella corteccia cerebrale di sviluppo, mitosi anormale di progenitori neurali può causare difetti di dimensioni e funzione cerebrale. Quindi, vi è una necessità critica per strumenti per comprendere i meccanismi di neurale progenitore mitosi. Sviluppo corticale nei roditori è un modello eccezionale per lo studio di questo processo. Progenitrici neurali mitosi è comunemente esaminati nelle sezioni di cervello fissi. Questo protocollo descrive in dettaglio un approccio per l'imaging dal vivo della mitosi in ex vivo fettine di cervello embrionali. Noi descrivere i passaggi critici per questa procedura, che includono: l'estrazione del cervello, l'incorporamento del cervello, vibratome sezionamento di fette di cervello, colorazione e coltura di fette, e time-lapse imaging. Abbiamo poi dimostrare e descrivere in dettaglio come eseguire un'analisi post-acquisizione della mitosi. Includiamo risultati rappresentativi from questo test utilizzando il colorante vitale Syto11, topi transgenici (istone H2B-EGFP e centrin-EGFP), e in utero elettroporazione (mCherry-α-tubulina). Discuteremo di come questa procedura può essere meglio ottimizzato e come può essere modificato per lo studio della regolazione genetica della mitosi. Vivo imaging di mitosi in fettine cerebrali è un approccio flessibile per valutare l'impatto dell'età, anatomia, e perturbazione genetica in un ambiente controllato, e per generare una grande quantità di dati ad alta risoluzione temporale e spaziale. Quindi questo protocollo integrerà gli strumenti esistenti per l'analisi dei neurali progenitrici mitosi.

Introduzione

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere come eseguire l'imaging dal vivo di progenitori neurali mitosi in fettine di cervello embrionali. Utilizzo di immagini dal vivo di fette di cervello nella cultura, questo protocollo fornisce un metodo semplice per saggiare molteplici aspetti della mitosi nei progenitori neurali in un ambiente altamente simile ad un ambiente in vivo. Esso può essere applicato a cervello di animali e / o cervelli mutanti che sono state manipolate con elettroporazione in utero) ^1-5. Questa tecnica è ideale anche per testare l'effetto di agenti farmacologici su mitosi precursori neurali, semplicemente aggiungendo un agente al mezzo di coltura. In sintesi, questo articolo farà un protocollo tecnicamente impegnativo accessibile a coloro che studiano la neurogenesi.

Durante la neurogenesi, distinte popolazioni progenitrici neurali subiscono divisioni precise per generare neuroni che alla fine contribuiscono a sei strati corticali dell'adulto neocorteccia ^6-8. All'inizio dello sviluppo corticale, la piscina precursore neurale si espande come neuroepiteliale (NE) le cellule si dividono simmetricamente di auto-rinnovarsi. Cellule NE poi convertono in cellule gliali radiali (RGCs). Inizialmente RGCs dividono simmetricamente per produrre due nuovi RGC, tuttavia durante la maggior parte della neurogenesi, la modalità principale RGC 'di divisione è asimmetrica. In divisione asimmetrica, 1 RGC dà luogo ad una nuova RGC e di un neurone post-mitotico, o un progenitore più specializzato (sia per un breve precursore neurale (SNP), un glia radiale esterna (ORG), o un progenitore intermedio (INP) ^2,3,7,9. INP, SNP, e ORG possono generare neuroni alla sub-ventricolare, e regioni basali della corteccia, rispettivamente. Quindi, la divisione cellulare dei progenitori è un processo fondamentale per generare neuroni del neocorteccia.

Numerosi studi indicano una correlazione tra specifici tratti mitotici di RGCs e il destino delle cellule figlie. Haydar et al. Ed Takahashi et al.hanno dimostrato che la durata mitotico RGC e ciclo cellulare aumento di lunghezza come procede neurogenesi, un reperto eco nel follow-up di studi ^10-13. Un certo numero di studi hanno suggerito che fuso mitotico orientamento rispetto al ventricolo influenza aspetti della neurogenesi e corticogenesi, compresi i tipi di neuroni generati e posizione della progenie nel cervello, rispettivamente ^3,10,14-16. Sia orientamento del piano di clivaggio influenza direttamente il destino della cellula è controversa, ma la conclusione resta che questo mitotico impatti parametri neurogenesi. Ulteriori sottolineando l'importanza della mitosi è l'osservazione che molti geni coinvolti nei meccanismi di mitosi sono cruciali per la neurogenesi e per il corretto sviluppo del cervello ^17-20.

La mitosi è un processo dinamico, ma fino ad oggi la maggior parte degli studi che descrivono neurali progenitrici mitosi utilizzare l'analisi di sezioni di tessuto fissi o immagini di progenitori neurali tramite coltura cellulare in vitro. Così, i metodi tradizionali per valutare la mitosi forniscono solo un'istantanea di questo processo e non riescono a scoprire come le cellule si comportano in un tessuto. Vivo imaging progenitrici neurali mitosi è diventato sempre più uno strumento fondamentale per comprendere la funzione dei progenitori neurali. Per esempi vedere questi riferimenti ^{4,8,10,21-25.} Diversi protocolli in essere sono stati pubblicati per la preparazione e l'imaging di fette di cervello ^26,27. Tuttavia ad oggi, un protocollo completo per l'imaging e analisi di mitosi non è stata descritta né dimostrato in video.

Questa tecnica offre diversi vantaggi significativi rispetto analisi fisso di sezioni cerebrali. Analisi Time-lapse di fette di cervello consente la generazione di un numero significativamente maggiore punti di dati che possono essere analizzati in modo flessibile. In primo luogo, i dati vengono raccolti presso i singoli punti di tempo nel corso di alcuni minuti a diverse ore. Si può analizzare punti temporali individuali (per creare un montaggio statico) opuò combinare diversi momenti in film. In secondo luogo, confocale di fette consente la generazione di dati in diverse sezioni Z in fettine cerebrali. Come risultato, le singole sezioni possono essere analizzati. In alternativa, pile di singole sezioni possono essere combinati in una proiezione massima intensità. Terzo, analisi viene fatta nel contesto di un tessuto, rivelando come cellule si dividono rispetto alle cellule e strutture vicine. Quarto, è ideale per l'analisi di mutanti che mostrano alcune prove di difetti mitotici. Insieme, questo protocollo aiuterà a chiarire passaggi critici per aiutare gli investigatori che intendono effettuare l'imaging dal vivo di progenitori neurali mitosi nei propri laboratori.

Protocollo

1. Preparazione dei supporti (figura 1, Punto 1)

1. Fetta Cultura Media
   1. 25 ml di fetta di terreno di coltura è sufficiente per preparare piatti peggiori 5 in vetro con 2 fette per bene.
   2. In una provetta da 50 ml, aggiungere 250 ml di una soluzione di N2 100x e 500 microlitri di una soluzione 50x B27 senza vitamina A. Aggiungere DMEM/F12 ad un volume di 22,5 ml.
   3. Filtro sterilizzare soluzione e successivamente aggiungere 1,25 ml di siero di cavallo inattivato calore e 1,25 ml di siero fetale bovino.
   4. Incubare soluzione in un bagno d'acqua a 37 ° C per tutta la durata della preparazione delle fette.
   5. Aggiungere fattori di crescita (EGF, FGF e concentrazione finale di 10 ng / ml e 20 ng / ml, rispettivamente) immediatamente prima dell'inizio della coltura. La composizione di questo mezzo è stato ottimizzato per promuovere la sopravvivenza delle cellule in coltura e per aumentare il tasso di proliferazione dei progenitori neurali. Ciò quindi massimizzare la probabilità diosservare cellule in mitosi nella fetta.
2. HBSS completa dissezione Solution
   1. Preparare 500 ml di piena HBSS aggiungendo 50 ml di 10x HBSS, 1,25 ml di 1 M Hepes (pH 7.4, FC 2,5 mm), 6 ml di 2,5 M D-glucosio (FC 30 mm), 2,2 ml di 0,9 M NaHCO ₃ (FC 4 mm) e autoclavato diH ₂ O al volume finale di 500 ml.
   2. Soluzione Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C fino alla raccolta delle corna uterine dal mouse incinta. Questa soluzione può essere conservato a 4 ° C per settimane.
   3. Mantenere HBSS in ghiaccio durante l'intera procedura di dissezione.
3. Incorporare soluzione
   1. Per l'inclusione di quattro cervelli embrionali, preparare 30 ml di 3% agarosio low melting nella soluzione completa HBSS. In una provetta da 50 ml conica, aggiungere 0,9 g di agarosio low melting e pieno HBSS a 30 ml.
   2. Mescolare la soluzione con un vortex e fondere in un forno a microonde con il tubo in piedi e il tappo aperto.
   3. Mentre nel microonde, monitorare la soluzione di pOverflow revent a causa di eccessiva ebollizione. Quando bolle si avvia, interrompere il forno a microonde e agitare la soluzione.
   4. Ripetere queste operazioni fino a quando tutta l'agarosio si è sciolto.
   5. Conservare la provetta in un bagno d'acqua a 42 ° C.

2. Dissezione degli embrioni (figura 1, punto 2)

1. Dopo un'attenta eutanasia del mouse in stato di gravidanza, raccogliere le corna uterine e trasferirli in un piatto di 10 centimetri ² Petri contenente freddo pieno 1x HBSS. L'età dell'embrione può variare a seconda dello studio. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per la coltura di fette di cervello da giorni embrionali E12.5 a E17.5. A causa delle loro dimensioni, i cervelli più giovani tendono ad essere più difficile da lavorare.
2. Raccogliere gli embrioni e sezionare i cervelli embrionali come descritto precedentemente nel ratto e topo ^26,27, fino ad ottenere un cervello embrionale completo compreso hindbrain e proencefalo con i due emisferi cerebrali. Questi possono essereconservato a temperatura ambiente finché non sono stati sezionati tutti i cervelli.
3. Raccogliere gli embrioni e sezionare i cervelli embrionali come descritto precedentemente nel ratto e topo ^26,27, fino ad ottenere un cervello embrionale completo compreso hindbrain e proencefalo con i due emisferi cerebrali. Questi possono essere conservati a temperatura ambiente finché non sono stati sezionati tutti i cervelli.

3. Embedding dei cervelli embrionali (Figura 1, punto 3)

1. In un recipiente contenente ghiaccio, creare un buco nel ghiaccio per inserire gli stampi incorporamento in.
2. Versare il terreno agarosio 3% in uno stampo di plastica e posizionare che stampo nel foro preparato nel ghiaccio.
3. Mescolare il mezzo agarosio con la punta di un termometro digitale finché la temperatura raggiunge i 35 ° C.
4. Prontamente trasferire il cervello nel mezzo di inclusione.
5. Punto Critico: Per rimuovere l'eccesso HBSS all'interfaccia tra il cervello e l'agarosio, con cura e asciugare delicatamente / ruotare il cervello voltenella soluzione incasso con le pinze.
6. Un cuscino di agarosio gelificata formerà sul fondo dello stampo a contatto con il ghiaccio. Una volta che il cuscino può essere sentito con la punta della pinza agitando il cervello, posizionare il cervello con la dorsale verso l'alto. Il cervello non dovrebbe sprofondare fino al fondo dello stampo.

4. Preparazione di agarosio Block (Figura 1, punto 4)

1. Lasciate che il agarosio indurire nel ghiaccio per almeno 5 min.
2. Utilizzando una lama di rasoio, sezione angoli dello stampo.
3. Ritagliarsi cautela un blocco di agarosio intorno al cervello con una lama di rasoio. Cercare di ridurre al minimo il numero di tagli per evitare perturbando il cervello incorporato.
4. Assicurarsi che il blocco ha una superficie più ampia nella regione caudale del cervello (contro la regione rostrale, vedi Figura 1, punto 4) per aumentare la stabilità del blocco sul piedistallo sezionamento.
5. L'ultimo taglio dovrebbe essere quello sul lato caudale del cervello;questo taglio definirà il piano di sezione corretta con il vibratome.
6. Farlo allineando la lama perpendicolare all'asse rostro-caudale del cervello e il blocco di agarosio. Far scorrere verso il basso la lama caudalmente lungo l'asse rostro-caudale e fare il taglio finale di circa 5 mm dalla regione più caudale del cervello.
7. Impostare il blocco di agarosio / cervello da parte e ripetere l'incorporamento di altri cervelli.

5. Trasferimento dei cervelli incorporati nel vassoio della Vibratome (Figura 1, punto 5)

1. Aggiungere una goccia di colla sul fondo del vassoio vibratome. Posizionare colla in modo che i blocchi di agarosio saranno posizionati all'interno dell'estensione della lama vibrante.
2. Posizionare il lato del blocco di agarosio / cervello caudale sul bordo della spatola, con circa il 50% del ribaltamento blocco oltre il bordo della spatola.
3. Applicare la faccia caudale del blocco di agarosio per la colla e far scorrere la spatola di distanza, mantenendo il blocco di agarosio al fondo del vassoio con la shoulder di un paio di pinzette. Non lasciate che la spatola contattare direttamente la colla.
4. Sia la colla solidificare a temperatura ambiente per 5 min.

6. Sezionamento del Brains embedded (Figura 1, punto 6)

1. Riempire il vassoio vibratome con HBSS.
2. Definire le posizioni di partenza e di arrivo della lama vibratome.
3. Genera 200-250 micron fette. Con il vibratome VT1000S, utilizzare i seguenti parametri: velocità 2-4, frequenza 8.
4. Rimuovere con attenzione le fette dal vibratome quando vengono tagliate. Trasferire le fette con una spatola e il back-end di pinzette in 12 piatti e pieni di piena HBSS. In alternativa, alcuni ricercatori hanno usato un pennello al posto di pinzette Punto chiave:. Durante il trasferimento, fare attenzione che le fette di cervello rimangono attaccati al agarosio circostante.

7. Syto11 colorazione delle fette (Figura 1, punto 7)

1. Diluire Syto11 ad una concentrazione finale di0,5-1 mM nel terreno di coltura fetta integrati con fattori di crescita.
2. Nel pozzetto di una piastra 12 pozzetti, incubare fette da un cervello in 2,5 ml di soluzione colorante per 1 ora a 37 ° C.
3. Lavare le fette in 2,5 ml di mezzo di coltura fetta senza macchiare soluzione per 20 min.

8. Montaggio fette in un piatto fondo di vetro (Figura 1, punti 8, 9)

1. Preparare 15 ml di incorporamento soluzione di collagene per fetta. Preparare una soluzione di 1,5 mg / ml di collagene miscelando 375 ml di 3 mg / ml di soluzione di collagene di tipo I con 75 ml di DMEM 10x, 9,4 ml di NaOH 1 M, e 290 ml di H ₂ O. Memorizzare sul ghiaccio.
2. Una goccia 15 ml della soluzione di collagene nella parte inferiore di un fondo 35 millimetri vetro micropozzetti piatto. Stendere con una punta di pipetta in base alle dimensioni della fetta.
3. Trasferire la fetta nella goccia di collagene con una spatola e un paio di pinzette Punto chiave:. Montaggio più sezioni in diversipiatti ORL aumenta la probabilità di acquisire fette adatti per l'imaging. Schermo attraverso diverse sezioni e selezionare quelli che meglio soddisfano i criteri descritti di seguito nella sezione "Rappresentante dei risultati".
4. Lasciate le fette incubare a temperatura ambiente per 10 min prima di trasferirli in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO _2.
5. Dopo 20 minuti, aggiungere 1,2 ml di fetta di terreno di coltura nel fondo di vetro micropozzetti Dish. Aggiungere 600 pl di mezzo alla volta e stendere con un puntale.
6. Catturare un'immagine basso ingrandimento della fetta cervello per registrare il livello anatomico e l'integrità della fetta.

9. Imaging Live della Slices (Figura 1, i passaggi 10, 11)

1. Lasciate le fette recuperare nell'incubatrice per almeno 1 ora e 30 min a 37 ° C con 5% di CO ₂ prima di imaging in tempo reale.
2. Immagine le fette con il microscopio della scelta, tenendo presente che Syto11 è molto incline a photobleaching. Qui un inverted disk spinning microscopio confocale viene utilizzato (Andor XD rivoluzione filatura microscopio confocale disco). In alternativa un microscopio confocale a scansione laser può essere usato. I seguenti parametri sono per il microscopio disco rotante set-up.
3. Durante l'intera sessione di imaging in tempo reale, fette mantenere a 37 ° C, 5% CO ₂ in una camera di incubazione umidificata collegata al microscopio.
4. Celle di immagine con un obiettivo 60X olio siliconico con una distanza di lavoro di 300 micron, e una apertura numerica di 1,3 (per esempio vedere figure 3B, 3C, 3E, 3F, 4A, 4B). Un obiettivo olio 100X con una distanza di lavoro di 130 micron e una apertura numerica di 1,4 (per esempio vedere Figura 4C) può anche essere usato. La risoluzione della fotocamera è di 512 x 512.
5. Fotografia le celle di un 30 um z-stack, con il centro della z-stack situata a circa 40 micron sotto la superficie della fetta. Cercando di immagine più in profondità nel tessuto può causare l'obiettivo di aggiungerepressione meccanica sulla fetta. Ciò può compromettere l'integrità della fetta cervello. Se si intende effettuare ricostruzioni 3D delle cellule, utilizzare un z-intervallo di non più di 2 pm.
6. Regolare la potenza del laser e tempi di esposizione per limitare photobleaching. Utilizzare tempi di esposizione che vanno da 30 a 200 msec, a seconda dell'intensità del segnale Syto11.
7. Con un palco motorizzato, immagine più posizioni in più sezioni montate in 1 piatto. Ad esempio, l'immagine fino a 20 posizioni sparse 4 fette differenti in 1 piatto unico.
8. Per l'imaging in tempo reale, utilizzare una risoluzione temporale inferiore a 5 minuti per consentire l'individuazione delle diverse fasi della mitosi. Utilizzando Syto11 e / o istone H2B-EGFP, 4-5 ore di immagini dal vivo sono sufficienti per osservare un numero significativo di cellule mitotiche. Tuttavia, se l'imaging scarsamente etichettati cellule in mitosi (come quelli raggiunti da elettroporazione in utero), quindi un parametro di imaging più lungo (durante la notte) è appropriato e lavora noill.
   Nota: Usando questo protocollo, di solito osserviamo in media 10 cellule in mitosi per posizione. Come detto sopra, l'imaging aerei montato fette aumenta la probabilità di avere un esperimento riuscito. Con questo approccio tipicamente identificare le cellule mitotiche in quasi tutti gli esperimenti eseguiti con Syto11 o istone H2B-EGFP.

10. Post-acquisizione Analisi della mitosi (figura 2)

Tutte le procedure descritte in questa sezione sono stati ottimizzati in Fiji (ImageJ), che è vantaggioso perché si tratta di un software open source gratuito. Sono a disposizione per eseguire le stesse operazioni, ad esempio Metamorph, Imaris, e Amira altre soluzioni software.

1. Identificazione dei Mitotic Figure in Fiji
   1. Dopo aver aperto il set di dati per una posizione di "HyperStack", selezionare un piano z (vedere la Figura 2A per la posizione della barra di scorrimento) dove il tessuto e le cellule aspetto sano (vedi criteri nella sezione discussione).Scorrere attraverso la dimensione temporale per identificare le cellule che passano attraverso anaphase, in quanto è il più facile fase mitotico da identificare.
   2. Scorrere indietro nel tempo per identificare il punto di tempo in cui la cellula entra mitosi (condensazione del DNA). La cella può muoversi attraverso z-aerei, ma la risoluzione temporale e parametri z-stack descritti in precedenza sono stati ottimizzati per attivare questo processo.
   3. In un foglio di calcolo, registrare il 4D coordinate della cella nella HyperStack (X, Y, Z e tempo, vedere la Figura 2A per visualizzare la posizione di questi dati nell'interfaccia Fiji), che entra mitosi. Conoscendo queste coordinate impedirà contare la stessa cella più volte.
   4. Scorrere in avanti nel tempo e registrare il tempo quando la cella passa da una fase all'altra. Documentare la durata di ciascuna fase mitotica per una data cella.
   5. Procedere con altre cellule, attraverso l'intero set di dati (più celle all'interno e tra posizioni).
2. 3D Ricostruireione delle cellule e quantitativa di rotazione durante la metafase (Adattato da Haydar et al, 2003) (Figura 2B).
   1. Dopo aver identificato più celle mitotiche, utilizzare le coordinate di una cella e scorrere in avanti nel tempo fino all'inizio di metafase.
   2. Ruotare l'intero "HyperStack" in modo che il bordo ventricolare è planare (usando il "Immagine / Trasforma / Ruota ..." il comando). Utilizzare lo strumento "angolo" per determinare l'angolo di applicare per questa rotazione.
   3. Identificare il piano z dove la cella di interesse è più visibile. In quel piano, utilizzare lo strumento "rettangolo di selezione" per disegnare una selezione che comprende tutta la cella.
   4. Identificare le z-piani che includono la cella di interesse. Utilizzare il comando "Immagine / Duplica" per creare un "sub-stack". Nella finestra di dialogo, lasciare "HyperStack Duplica" selezionata. Il "Slices (z)" parametro corrisponde alle z piani, tra cui l'intero cell, e le "Frames (t)" parametro corrisponde al punto di tempo corrente.
   5. Se la risoluzione è scarsa, aumentare la dimensione della "sub-stack" utilizzando il "Immagine / Regola / Taglia ..." il comando.
   6. Generare una ricostruzione in 3D della cella al punto di tempo corrente utilizzando il "progetto Image/Stacks/3D ..." il comando. I parametri per questo comando vengono visualizzati nella figura 2B. La "spaziatura fetta" corrisponde all'intervallo tra ciascuna delle immagini piano z (micron). Importante: assicurarsi che la dimensione fisica (micron), del sub-stack è stato conservato. In caso contrario, l'interpolazione dei pixel nella dimensione z sarà errato, e la ricostruzione 3D sarà imprecisa.
   7. Utilizzando la barra di scorrimento, ruotare la conseguente ricostruzione 3D in modo che il bordo della piastra di metafase è visibile. Il numero di telaio corrisponde all'angolo beta descritto in Figura 3B, registrare questo numero. Utilizzoil tool "angolo" e la "Analyze / Measure ..." il comando, misurare l'angolo tra l'orizzontale e una linea che attraversa il piatto di metafase perpendicolarmente (Figura 2B). Questo è l'angolo alfa.
   8. Registrare questi angoli per tutti i punti temporali metafase della cella di interesse. L'angolo di rotazione tra i punti di tempo (t) e (t-1) è uguale al valore assoluto della differenza tra un angolo a (t) e tale angolo a (t-1).
3. Misurare l'orientamento della fenditura Piano
   1. 3D ricostruire una cella di interesse a un certo punto durante l'anafase seguendo le istruzioni descritte per la ricostruzione 3D di piastre in metafase.
   2. Ruotare la ricostruzione fino ai bordi delle due lastre formate dai cromosomi segreganti sono visibili.
   3. Utilizzare lo strumento angolo per misurare l'angolo tra l'orizzontale (bordo ventricolare) e una linea parallela alle due piastre formate dai cromosomi segreganti. Questo è l'angolo del piano di clivaggio (Figura 2C).
4. Generazione di Film
   1. Come le cellule si muovono spesso in diversi Z-aerei, identificare i z piani occupati dalla cellula durante la sessione di imaging dal vivo. Generare una "proiezione massima intensità" di questi z-piani utilizzando il comando "Immagine / Pile / Z progetto ...". Salvare lo stack risultante come file ". TIF".
   2. Aprire questo file nella versione 1.45 di ImageJ come Fiji non include un plugin stabile per la generazione di ". Mov" o file ". Avi".
   3. Usare il "File / Salva con nome / ..." il comando di ImageJ per generare un filmato in un formato compatibile con le applicazioni a valle.

Risultati

Il successo di questo test e l'osservazione di più celle mitotiche durante una sessione di imaging in tempo reale dipendono in gran parte sia l'integrità e livello anatomico della fetta in cui sono fatti acquisizioni. Come discusso in seguito, il livello anatomico di una fetta è un fattore importante. Figura 3A mostra rostro-caudale e medio-laterale località dove abbiamo avuto più successo. Per ulteriori discussioni di questo tema si veda Noctor ^26. L'integrità della fetta p...

Discussione

Il principale vantaggio del protocollo abbiamo descritto è che fornisce una risoluzione temporale dinamica della mitosi di progenitori neurali. In genere, saggi di visualizzare mitosi nel cervello in via di sviluppo vengono eseguite utilizzando immunofluorescenza di sezioni di tessuto fissate. Ma questo approccio fornisce solo un'istantanea di mitosi a un certo punto volta.

Ci sono diversi passaggi che sono più critici per l'imaging mitosi in fettine di cervello: 1) Le fette di cer...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
100X N2	Life technologies	17502048	for culture medium
50X B27 without vitamin A	Life technologies	12587010	for culture medium
DMEM/F12	Life technologies	11320033	for culture medium
Heat-inactivated horse serum	Sigma Aldrich	H1138-500ml	for culture medium
Heat-inactivated calf serum	Sigma Aldrich	F4135-500ML	for culture medium
FGF	R&D Sytems	3139-FB-025	for culture medium
EGF			for culture medium
10X HBSS	Life technologies	14065-056	for the dissection of the embryos
Hepes Free Acid	Sigma Aldrich	H4034	dilute to 1M (pH7.4)
2.5M D-Glucose	Sigma Aldrich	G8769	for the dissection of the embryos
0.9M NaHC03	Life technologies	25080-094	for the dissection of the embryos
low-melting agarose	Fisher	BP165-25	for generating slices
Loctite 404 glue	Loctite 404	46551	keep at 4˚C
syto11	Life technologies	S7573	Make 5µl aliquots
3 mg/ml collagen type I	Life technologies	A1048301	for culturing slices
glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	for culturing slices
petri dishes			for dissection of the embryos
digital thermometer			to measure the temperature of the agarose
spatula			to transfer brains
paintbrush			alternative to transfer brains
vibratome	Leica	VT1000s	for generating slices
dissecting microscope			dissecting out embryos
imaging microscope			A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber