発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

要約

神経前駆有糸分裂は、神経新生の重要なパラメータである。神経前駆糸分裂の我々の理解の多くは、固定された組織の分析に基づいている。胚性脳スライス内のライブイメージングは​​、制御された環境で、高い時間·空間分解能で有糸分裂を評価するための汎用的な手法である。

要約

短期間であるが、有糸分裂は、脳を含む臓器の開発のための基本的な複雑で動的な多段階プロセスである。大脳皮質では、神経前駆細胞の異常な有糸分裂は、脳の大きさと機能の欠陥を引き起こす可能性があります。したがって、神経前駆有糸分裂のメカニズムを理解するためのツールのための重要な必要性がある。げっ歯類における皮質の開発は、このプロセスを研究するための優れたモデルです。神経前駆糸分裂は、一般的に固定された脳切片で検討されている。このプロトコルは、具体的にex vivoでの胚の脳切片における有糸分裂のライブイメージングのためのアプローチを説明します。脳の抽出、埋め込む脳、脳スライス、スライスの染色および培養し、タイムラプスイメージングのビブラトーム切片を：私たちは、これは、この手順のための重要なステップを説明します。次に、有糸分裂のポスト取込み分析を実行する方法を詳細に示し、説明する。我々は、代表的な結果のFRを含みOMこのアッセイは、生体色素Syto11、トランスジェニックマウス（ヒストンH2B-EGFPおよびセントリン-EGFP）を使用して、 子宮内電気穿孔（mCherry-α-チューブリン） であった。我々は、この手順では、最良の最適化することができるか、それが有糸分裂の遺伝的調節の研究のために変更する方法を説明します。脳スライスにおける有糸分裂のライブイメージングは​​、制御された環境で、年齢、解剖学および遺伝的摂動の影響を評価するために、高い時間的·空間分解能で大量のデータを生成するために、柔軟なアプローチである。したがって、このプロトコルは、神経前駆糸分裂の分析のための既存のツールを補完する。

概要

このプロトコルの全体的な目標は、胚の脳スライスの神経前駆細胞の有糸分裂のライブイメージングを実行する方法を説明することである。培養液中の脳スライスのライブイメージングを使用して、このプロトコルは、 生体内の設定に非常に近い環境で、神経前駆細胞の有糸分裂を複数の側面を分析するための簡単な方法を提供する。なお） 子宮内エレクトロポレーションに用い^1-5操作された突然変異動物および/ ​​または脳の脳に適用することができる。この技術は、単に培養培地に薬剤を添加することによって、神経前駆細胞」は、有糸分裂に薬理学的物質の効果を試験することも理想的である。要するに、この記事では、神経新生を研究したものと技術的に困難なプロトコルにアクセスできるようになります。

神経発生時には、明確な神経前駆細胞集団は、最終的には^6-8新皮質大人の6皮質層に寄与する神経細胞を生成するために、正確な部門を経験。神経上皮（NE）細胞は自己複製に対称的に分割し、早けれ皮質開発では、神経前駆プールが展開されます。 NEの細胞は、その後放射状グリア細胞（RGCは）に変換。当初、RGCを、2つの新しいのRGCを生成するために対称的に分割し、ただし、神経発生の大部分の間に、分裂のRGCは「メインモードは非対称である。非対称分裂では、1 RGCは、新たなRGCいずれか有糸分裂後のニューロン、またはより専門的な前駆細胞（いずれか短い神経前駆（SNP）、外側放射状グリア（ORG）、または中間前駆細胞（INP）を生じさせる^{2,3,7,9。INPS、SNP}を、そしてORGSは、サブ心室、心室の神経細胞を生成することができ、かつ皮質の基底領域がそれぞれあるので、前駆細胞の細胞分裂は、神経細胞を生成するための基本的なプロセスであり、新皮質。

多くの研究は、特定の有糸分裂のRGCの特性と娘細胞の運命の間の相関関係を指摘している。ハイダルらおよび高橋らRGC分裂期間および神経発生が進行するにつれて、細胞周期の長さの増加は、発見が追跡中の研究^10-13をエコーすることを示した。多くの研究は、心室への有糸分裂紡錘体の向きが^3,10,14-16それぞれ、脳内で生成された子孫の場所ニューロンのタイプを含む神経発生およびcorticogenesisの態様を、影響することを示唆している。劈開面方位が直接細胞の運命に影響するかどうかは議論の余地があるが、結論は、この有糸分裂のパラメータに影響を与え、神経発生のまま。さらに、有糸分裂の重要性を強調することは、有糸分裂のメカニズムに関与する多くの遺伝子が神経発生のために、適切な脳の発達に重要である^17〜20という観察である。

有糸分裂は、動的なプロセスであり、まだ今日までに、神経前駆有糸分裂を詳述するほとんどの研究は、 インビトロでの細胞培養を介して固定された組織切片の分析または神経前駆細胞の画像化を利用する。このように、有糸分裂を評価するための主流の方法は、このプロセスのスナップショットを提供し、細胞が組織内でどのように動作するかを明らかにすることができない。神経前駆有糸分裂のライブイメージングは​​ますます神経前駆機能を理解するための重要なツールとなっています。例については、これらの参照を参照してください^{4,8,10,21-25。}いくつかの優れたプロトコルは、脳スライス^26,27の製造およびイメージングのために公開されている。しかしこれまでに、有糸分裂のイメージングおよび分析のための総合的なプロトコルは、ビデオで説明も証明されていない。

この手法は、脳切片の固定分析に比べていくつかの重要な利点を提供しています。脳スライスの経時的分析は、柔軟な方法で分析することができるかなり多くのデータ点を生成することができる。まず、データは、数分または数時間にわたって個々の時点で収集される。一つは、（静的なモンタージュを作成するために）個々の時点を分析することができるか、ムービーに異なる時点を組み合わせることができます。第二に、スライスの共焦点イメージングは​​、脳スライス内の別のZのセクションでデータを生成することができる。その結果、個々の部分を分析することができる。あるいは、個々のセクションのスタックは、最大強度投影中に組み合わせることができる。第三に、分析は、細胞が隣接細胞と構造体と比較して分割の仕方が明らかに、組織のコンテキストで実行されます。第四に、それは、有糸分裂の欠陥のいくつかの証拠を示す突然変異体の分析に理想的に適している。一緒にこのプロトコルは、独自の研究室で神経前駆有糸分裂のライブイメージングを実施したい研究者を支援するための重要なステップを明確にするのに役立ちます。

プロトコル

メディアの1。作製（図1、ステップ1）

1. スライス培養培地
   1. スライス培養培地25mlをウェル当たり2スライスを5ガラスボトムディッシュを調製するのに十分である。
   2. 50ミリリットルコニカルチューブに、100×N2液250μLおよびビタミンA 22.5ミリリットルの容積にDMEM/F12を追加することなく、50倍のB27溶液500μlを加える。
   3. フィルタは、ソリューションを殺菌し、その後、熱不活性化ウマ血清およびウシ胎児血清の1.25ミリリットルの1.25ミリリットルを追加。
   4. スライスの調製の間、37℃の水浴中で溶液をインキュベートする。
   5. 成長因子（FGFとEGF、10の最終濃度を追加 ng / mLで、それぞれ20 ng / mLの）直前に培養の開始まで。この培地の組成は培養中の細胞の生存を促進し、神経前駆細胞の増殖速度を増加させるために最適化されている。これは、このようにする可能性を最大化しますスライスに分裂細胞を観察します。
2. フルHBSS解剖ソリューション
   1. 、10×50mlのHBSS、1 M Hepes緩衝液（pH7.4、FC 2.5 mM）を1.25mlのを添加することにより、完全なHBSSを500mlを調製2.5 M D-グルコース（FC 30 mM）を6 mlの0.9 M NaHCO ₃を2.2mlの（FC 4 mM）を500 mlの最終容量までのdiH ₂ Oをオートクレーブ処理。
   2. 妊娠中のマウスから子宮角のコレクションまで4℃で濾過滅菌液と店。この溶液は、数週間、4℃に保つことができる。
   3. 全体解剖手順の間、氷上でHBSSを保管してください。
3. 埋め込みソリューション
   1. 4胚の脳の埋め込むための、完全なHBSS溶液中の3％低融点アガロースの30ミリリットルを用意。 50ミリリットルコニカルチューブに、30ミリリットルに低融点アガロースとフルのHBSS 0.9グラムを加える。
   2. ボルテックスミキサーで溶液を混合し、チューブに立って、キャップ開放と電子レンジで溶かす。
   3. マイクロ波中、pまで溶液をモニターしながら過度の沸騰によるreventにオーバーフロー。開始沸騰する場合は、電子レンジを止めて、解決策をボルテックスする。
   4. すべてのアガロースが溶融するまで、これらの手順を繰り返します。
   5. 42℃の水浴中でチューブを格納

胚の2。解剖（図1、ステップ2）

1. 妊娠中のマウスを慎重に安楽死の後、子宮角を収集し、冷たいフル1X HBSSを含む10cm ^2のペトリ皿にそれらを転送します。胚の年齢は、研究に応じて変えることができる。このプロトコルは、E17.5に、胚日E12.5から脳スライスの培養に成功して使用されてきた。サイズによっては、若い脳を用いて動作することがより困難になる傾向がある。
2. 2大脳半球と後脳および前脳を含む完全な胚の脳が得られるまで、胚を収集し、ラットおよびマウス^26,27で前述したように、胚の脳を解剖する。これらは、することができますすべての脳を解剖されるまで、室温に保った。
3. 2大脳半球と後脳および前脳を含む完全な胚の脳が得られるまで、胚を収集し、ラットおよびマウス^26,27で前述したように、胚の脳を解剖する。全ての脳を解剖されるまで、これらは、RTに保つことができる。

3。胚の脳の埋め込み（図1、工程3）

1. バケット含む氷に埋め込み金型に挿入した氷に穴を作成します。
2. プラスチック金型内に、3％アガロース培地を注ぎ、氷で下穴にその金型を配置します。
3. 温度が35℃に達するまで、デジタル温度計の先端でアガロース培地をかき混ぜる
4. 速やかに埋媒体中に脳を移す。
5. 重要なステップ：慎重に、脳とアガロースとの間の界面に過剰のHBSSを削除するには、ゆっくりと繰り返し/脳を回転タンブルピンセットで埋め込み、溶液中。
6. アガロースゲル化のクッションは、氷と接触して、金型の底に形成することになる。脳を撹拌しながらクッションが鉗子の先で感じることができるようになると、背側を上にして、脳を配置。脳は、金型の非常に底に沈むべきではありません。

アガロースブ​​ロックの4。作製（図1、ステップ4）

1. アガロースは、少なくとも5分間氷で硬化してみましょう。
2. カミソリの刃を使用して、セクションの金型の隅。
3. 慎重にカミソリの刃を用いて脳の周りにアガロースブ​​ロックを彫る。埋め込まれた脳への影響を回避するためにするためにカット数を最小限に抑えるようにしてください。
4. 切片台座の上にブロックの安定性を高めるために（ 図1、ステップ4を参照して、吻側部位に対して）ブロックは、脳の尾領域でのより大きな表面積を有することを確認してください。
5. 最後のカット​​は、脳の尾側の1でなければなりません。このカットは、ビブラトームで正しい切片平面を定義します。
6. 脳とアガロースブ​​ロックの吻側 - 尾側軸に垂直な刃を合わせて行ってください。吻側 - 尾側軸に沿って尾側に刃を下にスライドさせ、約5ミリメートル離れて、脳の最も尾側の領域から最後のカット​​を行います。
7. 余談アガロース/脳ブロックを設定し、他の脳の埋め込みを繰り返します。

ビブラトームのトレイに組み込み脳の5。転送（図1、ステップ5）

1. ビブラトームトレイの底部に接着剤の滴を追加します。アガロースブ​​ロックが振動する刃の届く範囲に配置されるように接着剤を配置します。
2. ヘラの端にブロック転倒の約50％で、ヘラの端にアガロース/脳ブロック尾側を下に置きます。
3. のりにアガロースブ​​ロックの尾の顔を適用し、Sとトレーの底部までのアガロースブ​​ロックを維持し、離れてヘラをスライドピンセットのhoulder。ヘラを直接接着剤に連絡させてはいけない。
4. 接着剤は、5分間室温で固化う。

組み込みの脳の6。セクショニング（図1、ステップ6）

1. HBSSでビブラトレイを埋める。
2. ビブラトームブレードの開始と終了位置を定義します。
3. 250ミクロンのスライス - 200を生成します。 - 4、周波数8速度2：VT1000sのビブラトームで、次のパラメータを使用します。
4. これらがカットされるように、慎重にビブラトームからスライスを削除します。フルHBSSで満たされた12ウェル皿にヘラやピンセットのバックエンドとスライスを転送します。別の方法として、いくつかの研究者は、ピンセットの代わりに絵筆を使用しているツボを：転送中、脳スライスは、周囲のアガロースに付着したまま、その世話をする。

スライスの7。Syto11染色（図1、ステップ7）

1. の最終濃度にSyto11を希釈0.5 - 成長因子を補充したスライス培養培地中に1μM。
2. 12ウェルプレートのウェル中で、37℃で1時間染色溶液2.5mlを、1つの脳からのスライスをインキュベートする
3. 20分間溶液を染色することなく、スライス培養培地の2.5ミリリットルのスライスを洗ってください。

8。（図1、ステップ8 9）ガラスボトムディッシュにスライスをマウントする

1. スライスごとのコラーゲン溶液を埋め込む15μLを準備します。 10×DMEM、1 MのNaOH 9.4μlを、そしてH ₂の290μlのO. 75μlの3 mg / mlのコラーゲンタイプI溶液の375μLを混合することにより、1.5 mg / mlのコラーゲン溶液を調製氷の上に保管してください。
2. 35ミリメートルのガラス底マイクロウェル皿の底のコラーゲン溶液の15μlのドロップを置きます。スライスのサイズに合わせて、ピペットチップとそれを広げる。
3. ピンセットのヘラやペアでのコラーゲンの減少にスライスを転送キーポイント：異なるにおける複数のスライスをマウントするENT料理はイメージングに適したスライスを取得する可能性が高くなります。異なるスライスを介してスクリーンと最高の「代表的な結果」に以下の基準を満たすものを選択。
4. 切片を、5％CO _2、37℃のインキュベーターにそれらを転送する前に室温で10分間インキュベートしましょう。
5. 20分後、グラスボトムマイクロウェル皿にスライス培養培地の1.2ミリリットルを追加。一度の培地600μLを加え、ピペットチップとそれを広げる。
6. スライスの解剖学的レベルと整合性を記録するために脳切片の低倍率の画像をキャプチャします。

スライスの9。ライブイメージング（図1、10、11をステップ）

1. スライスはライブイメージングの前に、5％CO _2、37℃で少なくとも1時間、30分間培養器で回復しよう。
2. Syto11は光退色に非常に傾向があることを念頭に置いて選択した顕微鏡画像のスライス、。ここにインバーテッド·スピニングディスク共焦点顕微鏡が（アンドールXD回転スピニングディスク共焦点顕微鏡）に使用されます。あるいはレーザー走査共焦点顕微鏡を使用することができる。以下のパラメータは、スピニングディスク顕微鏡セットアップのためのものである。
3. 全体ライブイメージングセッションの間に、顕微鏡に取り付けられた加湿培養室で、37℃、5％CO ₂でスライスを維持する。
4. 300μmの作動距離60Xシリコンオイル対物レンズと、1.3の開口数を持つ画像セル（例については、 図3B、図3C、3E、3F、4A、4Bを参照のこと）。 130ミクロンの作動距離を有する100×油浸対物1.4の開口数（例えば、 図4Cを参照）を使用することもできる。カメラの解像度は512×512である。
5. 約40μmのスライスの表面の下にあるzスタックの中心と画像が30μmのzスタック内のセル、。深部組織にイメージしようとする目的は、追加することがありますスライス上機械的圧力。これは、脳切片の完全性に影響を与えることができる。細胞の3次元再構成を行うことを計画している場合は、これ以上2μm以下のz間隔を使用しています。
6. 光退色を制限するために、レーザパワーと露光時間を調整する。 Syto11信号の強度に応じて、30から200ミリ秒までの露光時間を使用。
7. 電動ステージで、複数のスライス間での画像の複数の位置は、1皿に取り付けられた。例えば、画像1つの皿に4異なるスライスに散らばって20箇所まで。
8. ライブイメージングのために、有糸分裂の異なる相の同定を可能にするために5分未満の時間分解能を使用しています。 Syto11および/またはヒストンH2B-EGFPを使用して、4 - ライブイメージングの5時間は、有糸分裂細胞のかなりの数を観察するのに十分である。イメージングはまばら（例えば子宮内電気穿孔インによって実現されるような）有糸分裂細胞をラベルされた場合は、より長い撮像パラメータは、（一晩）が適切であると私たちの作品LL。
   注意：このプロトコルを使用して、我々は一般的に、位置毎の平均10有糸分裂細胞で観察します。上述したように、複数の撮像スライスが成功した実験を有する確率を増大取り付けられている。このアプローチでは、我々は一般的にSyto11またはヒストンH2B-EGFPで行わ事実上、全ての実験において有糸分裂細胞を同定。

10。有糸分裂のポスト獲得分析（図2）

このセクションのすべての手順は、無料のオープンソースソフトウェアであるため、有利であるフィジー（ImageJの）に最適化されています。他のソフトウェア·ソリューションは、をMetamorph、IMARIS、およびアミラとして、同じタスクを実行するために利用可能である。

1. フィジーの有糸分裂像の同定
   1. 「hyperstack」として一つの位置のデータセットを開いた後に、組織、細胞が健康に見える場所（ディスカッションセクションの基準を参照）（スクロールバーの位置については、図2A参照 ）1 z平面を選択します。それが識別するための最も簡単な分裂期であるように、後期を経由する細胞を同定するために時間次元をスクロール。
   2. 細胞が有糸分裂（DNA凝縮）に入る時点を識別するために、時間を遡ってスクロールします。細胞は、z平面を横切って移動することができるが、時間分解能及び前述のzスタックパラメータは、このプロセスを有効にするために最適化されている。
   3. スプレッドシートでは、有糸分裂に入ると（フィジーインタフェースでこれらの数字の位置を可視化するために、図2Aを参照して、X、Y、Zおよび時間）4Dはhyperstackのセルの座標を記録する。これらの座標を知ることは、同じセルに数回を数えなくなります。
   4. 時間内に前方にスクロールし、細胞を別の段階まで進行時間を記録します。 1指定されたセルのための各分裂期の期間を文書化します。
   5. フルセット（ポジション内および全体で複数のセル）間で、他のセルに進みます。
2. 3D再構築細胞のイオンと中期中の回転の定量（ヘイダルら 、2003年から適応）（ 図2B）。
   1. 中期の初めまで、複数の有糸分裂細胞を同定した後、セルの座標を使用し、時間内に前方にスクロール。
   2. 心室の境界線は、（「イメージ/変形/回転...」コマンドを使用して）、平面になるように全体を「hyperstack」を回転させます。この回転のために適用するために角度を決定するために、「角」ツールを使用します。
   3. 目的の細胞が最も表示されているz平面を特定します。その面では、全細胞が含まれる選択を描画するために「矩形選択」ツールを使用します。
   4. 目的の細胞を含み、Z平面を特定します。 「サブスタック」を作成するために「イメージ/複製」コマンドを使用します。ダイアログボックスで、チェックする「重複hyperstack "を残す。 「スライス（Z）」パラメータは、全体のCEを含むZ-平面に対応しているllの、および「フレーム（t）は "パラメータは、現在の時刻に対応する。
   5. 分解能が悪い場合には、「画像/調整/サイズ... "コマンドを使用して「サブスタック」のサイズを増やします。
   6. 「Image/Stacks/3Dプロジェクト...」コマンドを使用して、現在の時点での細胞の3次元再構成を生成します。このコマンドのパラメータは、 図2（b）に表示されます。 「スライス間隔は、「z平面画像（μm）とのそれぞれの間の間隔に対応する。重要：サブスタックの物理的な寸法（μm）が保存されていることを確認してください。そうでない場合は、z次元における画素の補間は不正確になり、3次元再構成は不正確になります。
   7. 中期板の縁部が見えるようにスクロールバーを用いて、得られた三次元再構成を回転させる。フレームの数は、 図3（b）に記載されベータ角に対応し、この番号を記録します。使い方「角」ツールと「分析/測定...」コマンド、水平および中期板に垂直（ 図2B）を二等分線との間の角度を測定します。これは、角度αである。
   8. 目的の細胞の全て中期時点について、これらの角度を記録します。時点（t）および（t-1）との間の回転角（t）における角度との差の絶対値に等しく、（t-1）と少なくともこの角度。
3. 切断面の配向を測定する
   1. 図3Dは、中期板の3D再構成のために記載の指示に従って、後期中に1つの時点で目的の細胞を再構成する。
   2. 分離染色体によって形成された2枚のエッジが表示されるまで再構築を回転させます。
   3. 水平（心室エッジ）と分離染色体によって形成された2枚の平行な線の間の角度を測定するために、角度ツールを使用して、。これは、劈開面（ 図2C）の角度である。
4. 作品の生成
   1. 細胞は多くの場合、異なるZ-プレーンにわたって移動すると、ライブイメージングセッション中にセルが占有するZプレーンを識別します。 「イメージ/スタック/ Zプロジェクト...」コマンドを使用して、これらのz-平面の「最大強度投影」を生成します。 「。TIF」ファイルとして結果のスタックを保存します。
   2. フィジーようにImageJの1.45バージョンでこのファイルを開く」。MOV "や"。AVI」ファイルを生成するための安定したプラグインが含まれていません。
   3. 「ファイル/ / ...名前を付けて保存」あなたのダウンストリーム·アプリケーションと互換性のある形式でムービーを生成するためにはImageJのコマンドを使用します。

結果

このアッセイの成功と1のライブイメージングセッション中に複数の有糸分裂細胞の観察は、主整合性や買収が行われたスライスの解剖学的なレベルの両方に依存します。以下に説明するように、スライスの解剖学的レベルが重要な因子であり、図3Aは吻側-尾側を示し、内側-外側我々は、最も成功している場所。このテーマの追加の議論についてはNoctor ^26を参照してくだ?...

ディスカッション

我々が記載したプロトコルの主な利点は、それが神経前駆細胞の有糸分裂の動的な時間分解能を提供することである。典型的には、発達中の脳における有糸分裂を可視化するためのアッセイは、固定組織切片の免疫蛍光を用いて行われる。しかし、このアプローチは、1つの時点での有糸分裂のスナップショットを提供する。

脳スライス内の有糸分裂を画像化するための?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100X N2	Life technologies	17502048	for culture medium
50X B27 without vitamin A	Life technologies	12587010	for culture medium
DMEM/F12	Life technologies	11320033	for culture medium
Heat-inactivated horse serum	Sigma Aldrich	H1138-500ml	for culture medium
Heat-inactivated calf serum	Sigma Aldrich	F4135-500ML	for culture medium
FGF	R&D Sytems	3139-FB-025	for culture medium
EGF			for culture medium
10X HBSS	Life technologies	14065-056	for the dissection of the embryos
Hepes Free Acid	Sigma Aldrich	H4034	dilute to 1 M (pH 7.4)
2.5 M D-Glucose	Sigma Aldrich	G8769	for the dissection of the embryos
0.9 M NaHCO3	Life technologies	25080-094	for the dissection of the embryos
Low-melting agarose	Fisher	BP165-25	for generating slices
Syto11	Life technologies	S7573	Make 5µl aliquots
3 mg/ml collagen type I	Life technologies	A1048301	for culturing slices
Glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	for culturing slices
Petri dishes			for dissection of the embryos
Digital thermometer			to measure the temperature of the agarose
Spatula			to transfer brains
Paintbrush			alternative to transfer brains
Vibratome	Leica	VT1000s	for generating slices
Dissecting microscope			dissecting out embryos
Imaging microscope			A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber