التصوير البلازما غشاء التشويهات مع pTIRFM

Summary

القائم على الاستقطاب الانعكاس الداخلي الكامل الإسفار الميكروسكوب (pTIRFM) يتيح الكشف في الوقت الحقيقي من ديناميات غشاء الخلية. توضح هذه المقالة تنفيذ pTIRFM لدراسة إعادة غشاء إيماس خلال التنظيم. والتقنية هي تعميم لعمليات أخرى في بيولوجيا الخلية التي تنطوي بصورة مباشرة أو غير مباشرة التغيرات في شكل الغشاء.

Abstract

للحصول على أفكار جديدة في ديناميات إيماس، ويركز مجموعتنا على تغييرات في شكل طبقة ثنائية المادة الدهنية التي يجب أن تنظم على وجه التحديد خلال التحام حويصلة والبلازما الأغشية. وتتحقق هذه التغيرات السريعة والمترجمة بواسطة التفاعلات الدينامية بين الدهون والبروتينات المتخصصة التي تتحكم انحناء الغشاء. ان غياب مثل هذه التفاعلات لا نملك سوى عواقب مدمرة على الانصهار الحويصلة، ولكن مجموعة كبيرة من الوظائف الخلوية الأخرى التي تنطوي على السيطرة على شكل الغشاء. في السنوات الأخيرة، وقد تم تحديد هوية عدد من البروتينات مع خصائص تشكيل الغشاء. ما تبقى في عداد المفقودين هو خارطة طريق من متى وأين، وكيف أنها بمثابة الانصهار والتقدم الإفراج المحتوى.

فهمنا من الأحداث الجزيئية التي تمكن إعادة غشاء تاريخيا محدودة بسبب عدم وجود الطرق التحليلية التي تعتبر حساسة للانحناء الغشاء أو لديك القرار الزماني لتراكك التغيرات السريعة. PTIRFM يرضي كلا من هذه المعايير. نناقش كيفية تنفيذ pTIRFM لتصور وتفسير السريع، والتغيرات submicron في اتجاه أغشية الخلايا أليفة الكروم خلال الحويصلة الأساسية كثيفة (DCV) الانصهار. الخلايا أليفة الكروم التي نستخدمها يتم عزل من الغدد الكظرية البقري. اتسخت الغشاء مع صبغة carbocyanine محبة للدهون، 1،1 '-dioctadecyl-3، 3،3'، 3'-tetramethylindodicarbocyanine، 4 chlorobenzenesulfonate، أو فعلت. لم intercalates في الطائرة الغشاء مع التوجه "ثابت" وبالتالي فهي حساسة لاستقطاب الحقل زائل. غشاء الخلية لم الملون هو متحمس بالتتابع مع الاستقطابات متعامدة ليزر 561 نانومتر (ف بول، ق بول). ويستخدم الليزر 488 نانومتر لتصور مكونات حويصلة والوقت لحظة الانصهار. يتم تشغيل إيماس بواسطة perfusing محليا الخلايا بمحلول بوكل إزالة إستقطاب. يتم إجراء تحليل متواجد حاليا باستخدام البرمجيات المكتوبة المخصصة لفهم كيفتغيرات كثافة الانبعاثات تتصل المسام الانصهار تمدد.

Introduction

حسن تنفيذ إيماس يتطلب تغييرات متطرفة في شكل طبقة ثنائية الغشاء أن مدبرة بدقة. قبل الانصهار، الانحناء المحلية من غشاء البلازما تحت الحبيبية يحدث، في جزء منه للحد من حاجز الطاقة للتفاعل من طبقات ثنائية. في وقت لاحق، ودمج الأغشية، يتم إنشاء مناطق للانحناء عالية ويجب أن يستقر. أخيرا، يجب أن تكون عازمة الأغشية تنصهر من شكلها الأولي لتوسيع المسام والانصهار تمكين المحتوى الإفراج ^1. لأن الأغشية وحده من غير المحتمل أن تخضع مثل هذه التغيرات الهائلة والمنسقة، والبروتينات ضرورية للتوسط الأحداث. ولكن كيف يتصرفون في التأثير على التغيرات في الغشاء طوبولوجيا أثناء عملية الانصهار لا يزال هناك الكثير جدا مسألة مفتوحة.

ممتازة في المختبر وجود نماذج لتصور انحناء الغشاء. استخدام السلبي وصمة عار EM، على سبيل المثال، كانت مهمة لتشكيل النماذج الجزيئية الحالي عن تصرفات الرئيسيتين الاتجار عroteins - synaptotagmin وdynamin (للمشاركات، انظر تشابمان ² و ³ هينشو). معظم المقايسات في الوقت الحقيقي من إيماس عدم الكشف عن انحناء مباشرة. بدلا من ذلك، يتم الاستدلال على ذلك من انحناء المقايسات أن يقدم تقريرا عن حركية lumenal الإفراج البضائع ^4-8 أو تغييرات في منطقة الغشاء ^9-11. PTIRFM يسد الفجوة بين المجراة في الدراسات المختبرية من خلال تمكين، والقياسات في الوقت الحقيقي مباشرة من التغييرات في micromorphology الغشاء.

PTIRFM، في وضع nonimaging، كان رائدها أكسلرود وزملاؤه لقياس اتجاه NPD-PE أدرجت ضمن غشاء نموذج ^12. ثم تم تطبيق هذه التقنية لتصور التغيرات الدينامية في الخلايا الحية المسمى مع الجاذبة وFM1-43 ^13-18. في pTIRFM، وتستخدم اثنين من الاستقطابات الحقل زائل لإثارة بالتتابع وجزءا لا يتجزأ من غشاء التحقيق: ف الاستقطاب (في الطائرة من الإصابة) وو الاستقطاب (عمودي على الطائرة من الإصابة). قبل التصوير، والتحقيق - في هذه الحالة، هل - يضاف لفترة وجيزة إلى المتوسطة خارج الخلية ويسمح ليقحم في أغشية البلازما من الخلايا لدراستها. في المناطق التي تكون فيها غشاء هو غير متوازي إلى ساترة (كما هو الحال في غشاء كشكش أو المسافة البادئة)، وهل سيكون أيضا غير متوازي. وبالتالي، فإن هذه المناطق تكون منفعل بواسطة شعاع ف بول. سوف شعاع ف بول تثير أقل فعالية في مناطق لم الغشاء الذي يتم في الغالب موازية لساترة. الصور نسبة بكسل إلى بكسل (P / S) الإبلاغ عن الانبعاثات من الإثارة متتابعة-p و ق بول من ولتسليط الضوء على وجه التحديد سوف لم مناطق تشوه الغشاء. من الناحية النظرية، وP / S نسبة الصور حساسة لحتى زوايا صغيرة من البلازما انحراف الغشاء من ساترة، مع اتساع التغييرات التي تنبأ بها المحاكاة الحاسوبية ^18. P / S الصور هي أيضا مستقلة عن مسافة fluorophore من سطح ساترة و fluorophore المحليةالتركيز. وبدلا من ذلك قدمت تركيز fluorophore المحلية من خلال الصور الإبلاغ عن مجموع بكسل إلى بكسل من الانبعاثات P و 2 أضعاف الانبعاثات S (P +2 S). ف S +2 قياس حساسة للهندسة دقيقة من المسافة البادئة، مع بعض، قليلا، أو أي تغيير ممكن. هذا يمكن أن تظهر من خلال المحاكاة الحاسوبية أن التحولات نموذج لالمسام الانصهار من المبكر (أي مع العنق الضيق) إلى دولة في وقت لاحق ^16،18. ف +2 S من حويصلة تنصهر تعلق على غشاء البلازما عبر العنق الضيق (ومع أكثر لم مقربة من الواجهة) ومن المتوقع أن تكون أكبر، على سبيل المثال، من أن من حويصلة تنصهر مع المسام أوسع بكثير (حيث هل هو ضمن الأكثر خفوت جزء من حقل زائل).

في هذه المقالة، ونحن نناقش كيفية تنفيذ pTIRFM والاستفادة منها لدراسة، والتغيرات السريعة في الشكل المترجمة الغشاء التي تحدث أثناء الانصهار المسام تمدد. في حين طلب واحد فقط هو صراحة ديscussed، وأساليب قابلة للتعميم لمجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية الخلايا الأخرى التي تنطوي بصورة مباشرة أو غير مباشرة إعادة الغشاء.

Protocol

1. إعداد النظام PTIRF

هو مبني على تقنية pTIRFM على منصة المجهر المقلوب. يتم توجيه أشعة ليزر من خلال منفذ الإضاءة الجانبية والتي تواجه الجانب nonpolarizing مرشح مكعب، ومن ثم ركزت على المستوى البؤري الخلفي من الهدف 60X 1.49 NA TIRF. اثنين من عدسات إضافية (1.6X و2X) في المسار الانبعاثات بين المجهر والكاميرا EMCCD إعطاء حجم بكسل النهائي من حوالي 80 نانومتر. وتسترشد أشعة الليزر باستخدام البرمجيات التي تسيطر المرايا الجلفانومتر للتبديل السريع بين برنامج التحصين الموسع والانعكاس الداخلي الكامل (TIR) ​​الإضاءة. البروتوكول هو موضح أدناه يفترض أن البصريات لTIRF يتم وضع بالفعل على الطاولة الهواء في مواقف الأمثل لإثارة fluorophore والتصوير. فهو يصف كيف يتم إضافة البصريات الاستقطاب إلى المجهر TIRF انشاء القائمة لتمكين التصوير من تشوهات غشاء الخلية. والتخطيطي من مختبر لدينا البصرية مجموعة المتابعة لتوليد كل من النقل البري الدولي وpolarizatويرد النقل البري الدولي استنادا الأيوني في الشكل 1A. بروتوكول يفترض استخدام ليزر 488 نانومتر لإثارة البروتينات حويصلة الفلورسنت والليزر 561 نانومتر لتصوير الصبغة carbocyanine، فعلت.

1. السلطة على جميع مكونات المجهر، وأشعة الليزر، وأجهزة الكمبيوتر.
2. توجيه شعاع من الليزر 488 نانومتر إلى الطائرة مرة أخرى الوصل (حزب الحرية) للعدسة 1.49 NA كما هو موضح في الشكل 1A. إذا تركز شعاع الليزر على حزب الحرية، وسوف تظهر موازى وتظهر بقعة صغيرة محددة جيدا على السقف مباشرة فوق الهدف.
3. ضبط مرآة X الجلفانومتر (المرآة تقع في الطائرة العينة ما يعادلها) حتى يتم نقل أن شعاع الليزر خارج المحور ويخرج من الهدف في زوايا انحدارا تدريجيا إلى الهدف العادي.
4. المقبل، تحقق من أن يتحقق النقل البري الدولي. إضافة 10 ميكرولتر من الفلورسنت المجهرية إلى وحدة تخزين مل 1 من PSS في صحن الزجاج السفلي. مضان فقط من المجهرية على الجزء السفلي سو الطبق، أقرب إلى واجهة النقل البري الدولي، يجب أن يتم الكشف. كشف المجهرية العائمة يشير إلى أن الزاوية بين الضوء الساقط وموضوعية العادي غير كاف.
   
   يصف المقطع أدناه مجموعة المتابعة من المكونات البصرية اللازمة للتصوير قائم على الاستقطاب.
5. باستخدام محاذاة شعاع 488 نانومتر كدليل، وضبط الموقف من 561 نانومتر الخام شعاع الليزر بحيث يسافر على طول مسار بصري متطابقة. سيتم استخدام الليزر 561 نانومتر للتصوير من الصبغة carbocyanine، فعلت.
6. إدراج عدسة المتباينة والمرايا المصب من الليزر 561 نانومتر. باستخدام المرايا، وضبط شعاع بحيث يتم coaligned مع شعاع 488 نانومتر، والبقعة هو في التركيز على السقف عندما المرايا الجلفانومتر هي في موقف "0".
7. توسيط لوحة ربع موجة (كو) في مسار الشعاع المصب على الفور من الفتحة الليزر. استخدام QW الذي هو إما مصاب بعمى الألوان أو ضبطها لطول موجة الإثارة.وهناك QW استقطاب دائري أي ضوء مستقطب خطيا الذي يدخل في زاوية 45 درجة مع المحور البصري. بعض المكونات البصرية، مثل مكعبات الاستقطاب، لديها تحيز توهين نحو محور واحد من الاستقطاب. يمكن للQW استدارة للتعويض عن هذا التحيز. هذا التعديل سوف يؤدي إلى الاستقطاب شعاع إيجازا. A QW ضروري لأن شعاع الليزر نفسه هو الاستقطاب خطيا للغاية (عموديا) وهو يخرج من الفتحة.
8. وضع مكعب الاستقطاب (PC1) المصب من شعاع الاستقطاب إيجازا. يعكس المكعب الاستقطاب العمودي (ص) المكون من الحقل الكهربائي ويمر (خ) المكون الأفقي. يتم وضع المكعب الاستقطاب في مرحلة ترجمة صغيرة لتسهيل المواءمة اللاحقة من مسارات شعاع الاستقطاب.
9. استخدام المكعب الثاني الاستقطاب (PC2) والمرايا (الشكل 1A) لإعادة تجميع الحزم.
10. وضع مصراع بين أول مكعب الاستقطاب (PC1) وشارك العموديمرآة mponent. وضع مصراع الثاني بين المرآة المكون الأفقي والاستقطاب المكعب الثاني (PC2). يتم التحكم في هذه مصاريع من برامج التصوير تمكين المستخدم لتحديد بسرعة بين الاستقطابات شعاع.
11. استخدام مرشح استقطاب للتحقق من التوجه الحقل الكهربائي في كل مسار الشعاع. وهناك مرشح الاستقطاب تسمح الإرسال فقط تماشيا مع محور التصفية.
12. تحقق من أن مكونات الرأسي والأفقي لشعاع الليزر تتماشى مع بعضها البعض وشعاع 488 نانومتر. إجراء تعديلات عند الضرورة. ينبغي أن تركز جميع الحزم الثلاث على حزب الحرية والخروج عن الهدف موازى لنفس المكان على السقف. هذه البقعة يمكن أن تكون علامة من قبل X لتسهيل المواءمة في المستقبل.
13. وضع قطرة من زيت الغمر على الهدف. وضع صحن يحتوي المجهرية الفلورسنت (راجع الخطوة 4 أعلاه) على الهدف.
14. ادخل النقل البري الدولي عن طريق تحريك المرآة X الجلفانومتر. في النقل البري الدولي، وcomponen العمودير من الحزم هو ق بول والمكون الأفقي لشعاع هو الآن ف بول. ضبط الكثافة النسبية بين الحزم عن طريق تناوب لوحة QW. عرض كل حقل زائل الاستقطاب مع عينة رودامين، والتي يتوقع أن تكون موجهة بشكل عشوائي. تدوير لوحة QW لتتناسب مع متوسط ​​كثافة بكسل. إذا لزم الأمر، إضافة عامل تصفية الكثافة محايدة في مسار واحد شعاع الاستقطاب لتخفيف حدته.

2. أليف للكروم عزل الخليوي

ويرد الإجراء لعزل الخلايا أليفة الكروم صحية من الغدة الكظرية العجل أدناه. وتكييفه من البروتوكولات نشرت سابقا من قبل ويك، SENTER، وآخرون. ^و19 أوكونور، المحطة آخرون ²⁰ بعد العزلة، وelectroporated الخلايا مع البلازميد (ق) من الفائدة باستخدام نظام التثقيب الكهربائي. نتائج هذا النظام في 20-30٪ من الخلايا معربا عن البروتينات الفلورية المطلوب. عادة، و 70٪ من خلايا البقاء على قيد الحياة المنتخبعملية roporation. وتقدم تفاصيل عن مكونات جهاز الأمن الوقائي وسائل الإعلام في الجدولين 2 و 3 و 4.

1. قبل يومين من الإعدادية الخلية، وعلاج 35 ملم الجودة البصرية الزجاجية القاع (0.17 مم) الأطباق مع 1 مل بولي-D-يسين (0.1 ملغ / مل)، يليه 1.25 مل الكولاجين البقري. ترك الأطباق في الهواء الجاف في الأنسجة الثقافة غطاء محرك السيارة.
2. الحصول على الغدد الكظرية الأبقار من مسلخ. الحفاظ على الغدد على الجليد بينما يتم نقلها إلى المختبر. قد تكون المغطى الغدد الكظرية البقري في طبقة سميكة من الدهون. استخدام مقص جراحي لإزالة الدهون الزائدة وفضح فتح الوريد الكظرية. يروي الوريد مع الإعدادية-PSS بشكل متكرر حتى يتم إزالة الغدة الدم.
3. المقبل، ماصة ببطء 2 مل من محلول TH-PSS في افتتاح الوريد حتى تتضخم الغدة. احتضان الغدد تضخم عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تكرار العلاج TH-PSS واحتضان مرة أخرى.
4. قطع طريق قشرة الغدة الكظرية الخارجي حول حافة الغدة مع لياليcissors وقشر الغدة بعيدا لفضح النخاع. استخدام مشرط لكشط بلطف وفصل النخاع من الأنسجة القشرية.
5. تخطر على النخاع مع زوج من شفرات المشرط لمدة 5-10 دقيقة.
6. والخطوة النهائية الهضم هو ضروري لعزل الخلايا أليفة الكروم الفردية. صب تعليق خلية المفروم في قارورة الدوار. ملء جزئيا القارورة مع نسبة 2:1 من TH-PSS (30 مل) إلى TL-PSS (15 مل)، واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حين الغزل في حوالي 100 دورة في الدقيقة.
7. فصل الخلايا أليفة الكروم الفردية من الأنسجة غير مهضوم من خلال تصفية من خلال 400 شبكة ميكرون. جمع الراشح. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لخلايا بيليه، وresuspend في PSS الجليد الباردة.
8. تحديد الخلايا من خلال 250 شبكة ميكرون، بيليه، و resuspend أخيرا في المخزن التثقيب الكهربائي (انظر الخطوة 2.9).
9. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات والاستعداد لترنسفكأيشن.
10. بالنقل الخلايا مع نظام التثقيب الكهربائي وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. يجب تحديد شروط دقيقة ل electroporation تجريبيا. ملاحظة: الإعدادات التي توفر أفضل توازن بين الكفاءة ترنسفكأيشن الخلية ومعدل البقاء على قيد الحياة لهذا المستحضر من الخلايا أليفة الكروم البقري هي 1،100 V، 40 ميللي ثانية، و 1 النبض. ونحن نقدر أنه مع هذه الظروف، و transfected 20-30٪ من الخلايا. حوالي 30٪ من الخلايا لا تنجو من عملية التثقيب الكهربائي.
11. خلايا لوحة بلطف على بولي-D-يسين والكولاجين أطباق تعامل في 1 مل من وسائل الإعلام electroporating تحسنت.
12. وضع الأطباق في الحاضنة 37 درجة مئوية (5٪ CO _2). إضافة 1 مل من وسائل الإعلام المضادات الحيوية 2X إلى كل طبق بعد 6 ساعة. تغيير وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام العادية في اليوم التالي.
13. وعادة ما يتم تصوير الخلايا أليفة الكروم بعد 2-5 أيام التثقيب الكهربائي.

3. pTIRF الحصول على صورة

1. الطاقة على نظام التصوير والبدء في برنامج الاستحواذ.
2. تحقق من أن يتم محاذاة الليزر. تحقق زائلالملف الشخصي الحقل باستخدام المجهرية.
3. إعداد نظام نضح العالمية والمحلية. حل الخزانات نظيفة مع تصفيتها منزوع الأيونات H ₂ O وملء مع القاعدية وتحفيز الحلول PSS.
4. قبل التصوير الخلايا أليفة الكروم، تحقق من أن ف ق بول وبول الإثارات إلقاء الضوء على نفس المنطقة من مجال رؤية وأن شدة الإضاءة هي ما يعادل تقريبا. للقيام بذلك، وملء طبق من الزجاج السفلي مع 2 مل من PSS تحتوي رودامين في تركيز النهائي من 10 ملم. بالتتابع تثير العينة رودامين مع ف بول وضوء ق بول والتقاط الصور. في الممارسة العملية، وP و S الانبعاثات الناتجة عن فعل هي طبيعية إلى متوسط ​​ف وانبعاثات رودامين S. راجع تحليل الصور والمقاطع مناقشة لمزيد من التفاصيل.
5. الآن انتقل إلى تلطيخ الخلايا أليفة الكروم البقري مع فعلت. شطف سائل الإعلام والثقافة من الطبق الذي يحتوي على الخلايا أليفة الكروم واستبدالها مع 2 مل من القاعدية PSS. إضافة 10 ميكرولتر من 10 ملي هل (مخففة في الإيثانول)مباشرة إلى الطبق الذي يحتوي على الخلايا. تستنهض الهمم بلطف طبق ل2-10 ثانية وإزالة هل الحل + PSS.
6. غسل الطبق 3-4X مع القاعدية PSS لإزالة أي فعل المتبقية. هي ملطخة الخلايا الآن وجاهزة للاستخدام.
7. إضافة قطرة من زيت الغمر إلى الهدف. وضع صحن يحتوي على الخلايا أليفة الكروم لم الملون على أعلى من الهدف.
8. عرض الطبق إما من خلال الهدف أو على الكاميرا، والعثور على الخلايا التي transfected مع البروتين من الفائدة وملطخة فعلت. خلية ملطخة جيدا يسلك الانبعاثات P تبرز بوضوح حواف الخلية؛ ينبغي أن تكون الانبعاثات S موحدة تقريبا في جميع أنحاء البصمة الخلية (أي منطقة من الخلية التي تم الالتزام بها الزجاج وتصويرها في TIRF).
9. وضع إبرة نضح المحلية بحيث يكون ما يقرب من 100 ميكرون بعيدا عن الخلية.
10. التركيز على غشاء الخلية وتفعيل الأجهزة ضبط تلقائي للصورة مباشرة قبل الاستحواذ تحفيز الخلية / الصورة.
11. بدء الحصول على الصور. يروي الخلايا لمدة 10 ثانية بمحلول القاعدية ثم لمدة 60 ثانية مع 56 ملي بوكل حل إزالة إستقطاب. الحصول على صور في حين اغلاق بسرعة بين 561 نانومتر ف بول، 561 نانومتر ق بول (لرصد التغيرات في P و S انبعاث لم) و 488 نانومتر الإثارة (لصورة التحقيق حويصلة transfected). وترد أمثلة من الصور المكتسبة خلال التجارب في الشكل 2 والشكل 3.

4. تحليل صورة

قد يتم تنفيذ العمليات الحسابية لمعالجة الصور مع يماغيج، ولكن يمكن استخدام البرامج النصية في لغة البرمجة المرنة مثل IDL أو مطلب زيادة كبيرة في تحليل الإنتاجية من خلال أتمتة المهام. يجب أن تحسب نوعين من الصور الطوبوغرافية للحصول على معلومات من الانبعاثات الصور الخام - وP / S و ف +2 S P / S تقارير على غشاء التشوهات المحلية في حين أن P +2 S مبلغ تقارير عن مجموع صبغ الغشاء في منطقة معينةمن الحقل.

1. جميع الصور يجب طرح الخلفية. اختيار العائد على الاستثمار خارج الخلية، وقياس متوسط ​​كثافة بكسل في العائد على الاستثمار، ومن ثم طرح تلك القيمة من جميع بكسل في الصورة المكدس.
2. لحساب P / S، تقسيم كل "P" الإطار الانبعاثات من قبل لاحقة "S" الإطار الانبعاثات (بكسل إلى بكسل). P / S يختلف مع شدة النسبي للف ق بول والإثارات، التحيز في النظام البصري، وهامش التدخل. للحد من هذه الآثار، وتطبيع نسب P / S من الحصول عليها من لم الانبعاثات إلى نسبة تم الحصول عليها مع محلول يحتوي على 10 ملي رودامين ^18.
3. إيماس من DCVs الفرد هو واضح من التغيير المفاجئ في شدة بروتين فلوري حويصلة، مثل Synaptotagmin-1 pHluorin (الشكل 2B). تحديد التغيرات في P / S و ف +2 S عن طريق حساب متوسط ​​وحدات البكسل في دائرة نصف قطرها 240 نانومتر ROI طيرانها فوق الزيادات المترجمة في P / Sنسبة في مواقع إيماس. عندما يحدث الانصهار دون زيادة واضحة في P / S، وتتركز العائد على الاستثمار أكثر من منطقة DCV الصمامات.
4. المحاكاة الحاسوبية لا يمكن أن يؤديها لتفسير P / S و ف +2 S غشاء التغييرات كثافة من حيث هندستها بسيطة من المسام معلقا الانصهار. للحصول على تفاصيل من المحاكاة، يرجى الاطلاع Anantharam آخرون ¹⁸

النتائج

يتم تطبيق تقنيات التصوير TIRFM التقليدية والاستقطاب على الطاولة الهواء نفسه. تكوين العناصر البصرية يشبه، مع الفارق الكبير الذي الاستقطاب في ضوء الإثارة (الشكل 1A). الضوء المستقطب يثير تفضيلي fluorophores مع ثنائيات الاقطاب الاستيعاب في اتجاه الاستقطاب. وبالتالي، لpTIRFM أن تكون فعالة في رصد التغيرات الطوبوغرافية الغشاء، والتحقيق يجب أن يستخدم يقحم في الغشاء مع التوجه الثابتة. الأصباغ carbocyanine الفلورسنت (الجاذبة، لم) يقحم في طبقات ثنائية الدهون بطريقة المنحى مع ثنائيات الاقطاب الانتقال في الطائرة غشاء (الشكل 1B). الاستقطاب P الإضاءة (الشكل 1C) الأغشية هل المسمى يثير انتقائي-ساترة منحرف fluorophores (RED في أرقام 1B و 1D).

ويتحقق وضع العلامات غشاء الخلايا أليفة الكروم مندفعا من أساسها بعدالحضانة مع ريف فعلت. 2A الشكل يظهر مثال على غشاء الخلية التي اتسخت أيضا. وهناك، خلية ملتصقة صحية تظهر اختلافات واضحة في P و S الانبعاثات. يظهر الصورة الانبعاثات P حدود الخلية أكثر إشراقا مع الاحترام لبقية الخلايا. يظهر الصورة S الانبعاثات مضان موحدة تقريبا في جميع أنحاء البصمة الخلية. تحسب بكسل إلى بكسل P / S و ف +2 S الصور حساسة للانحناء الغشاء وتركيز الصبغة، على التوالي. كما تم transfected الخلية أليفة الكروم تظهر مع Synaptotagmin-1 pHluorin (SYT-1) لتسمية حويصلات إفرازية (الشكل 2B).

يتم تحفيز الخلايا أليفة الكروم مع 56 ملي بوكل ليزيل الاستقطاب في غشاء الخلية وتؤدي إيماس. وهناك عدد من البقع الفلورسنت الزاهية SYT-1 pHluorin تصبح فجأة كما يتضح DCVs الصمامات (الشكل 2B، اللوحة اليمنى). يتم رسم مربع أبيض حول الانصهار حدث واحد (الشكل 2B، اللوحة اليمنى). هذا أنا الحدث الانصهارق تحليلها في أرقام 2C و 2D. ويبين الشكل 2C الإطار حسب الإطار التغييرات في SYT-1-pHluorin، P / S، P و+2 شدة S الصورة. كثافة مضان من SYT-1 تتناقص بسرعة كما ينشر البروتين بعيدا عن موقع الانصهار (الشكل 2D). المسافة البادئة تمثل مجمع غشاء الحويصلة / البلازما تنصهر يقلل بمعدل أبطأ نسبيا (لاحظ الرسوم البيانية في الشكل 2D). التوضيح (الشكل 2E) يصور تفسير واحد من هذه القياسات.

التشوهات غشاء السريع والمترجمة هو مبين في الشكل 2 هي نتيجة لأثار-التحفيز كا ^{2 +} تدفق. ويظهر هذا في الشكل 3A. وtransfected خلية أليف للكروم مع الوراثية كا ^{2 +} المؤشر GCaMP5G ^21،22 وحفز مع 56 ملي بوكل. يسبب غشاء الاستقطاب زيادة كبيرة في GCaMP5G مضان ( نانوغرام> أرقام 3A 3B و) مما يدل على زيادة في subplasmalemmal كا ^{2 +} المستويات. يتم اختيار المنطقة بكسل 30 × 20 خلية ويتم عرض الإطار حسب الإطار التغييرات في GCaMP5G، P / S، P و+2 شدة S بكسل في الصور (الشكل 3B) والرسوم البيانية (الشكل 3C). الوقت "0" يعين الإطار قبل التغيير P / S هو واضح (أي الإطار قبل إيماس). وتشير السهام البيضاء التي تشوه الغشاء (زيادة في P / S) يرافقه انخفاض في الانبعاثات S P +2. يتم استبعاد البروتين GCaMP5G عصاري خلوي من منطقة من قبل DCV تنصهر. نلاحظ أيضا انخفاض مفاجئ في كثافة GCaMP5G في الوقت 0 في الشكل 3C، اللوحة اليسرى. زيادة طويلة الأمد في P / S وانخفاض P +2 S تشير المسام الانصهار أن يتوسع ببطء (الشكل 3D).

/ files/ftp_upload/51334/51334fig1.jpg "/>
الشكل 1. الرسوم التوضيحية لتقنية pTIRFM. A) ويرد التخطيطي للجمع بين التقليدية مع القائم على الاستقطاب التصوير TIRF. يتم وضع ربع موجة (كو) لوحة أمام الياقوت الليزر 561 نانومتر إلى استقطاب إيجازا شعاع الليزر. ويستخدم المكعب الاستقطاب (PC1) لفصل الاستقطابات في خطي العمودي (ت) والأفقي (ح) المكونات. مكونات الرأسي والأفقي تصبح ف ق بول وبول الحزم الإثارة، على التوالي، على السطح النقل البري الدولي. وأغلقت مستقل مسارات ف ق بول وبول (S1 و S2). ومعاد أنهم مع المرايا ومكعب الاستقطاب الثاني (PC2). انضمامهم شعاع 488 نانومتر (كما أغلقت بشكل مستقل، S3) عن طريق توجيه شعاع عنصر يتكون من مرآة ومرآة مزدوج اللون nonpolarizing (DC). وتستخدم العدسات (L) لتوسيع وتركيز الحزم. يتم توجيه مجتمعة 488 نانومتر و 561 نانومتر الحزم إلى جانب منفذ إضاءة المجهر عبر GALVANOمتر المرايا (GM). أنها تركز على المستوى البؤري الخلفي (حزب الحرية) من الهدف. يتم تنفيذ يتم التقاط الفوتونات المنبعثة من fluorophores على الكاميرا EMCCD صله بجهاز كمبيوتر. B) هل وضع العلامات التي يحتضنها لفترة وجيزة مع خلايا الصبغة وغسل مرارا وتكرارا لإزالة الزائدة. لم intercalates في الغشاء مع لحظات ثنائي القطب انتقالها تقريبا في الطائرة الغشاء. C) والضوء الساقط الاستقطاب في الطائرة من الإصابة (ف بول) يخلق مجال زائل التي هي في الغالب طبيعية الاستقطاب إلى الواجهة، كما هو مبين. D) سوف يضيء غشاء هل المسمى مع الاستقطاب ع ضوء تثير انتقائي تلك fluorophores التي هي ساترة-منحرف (RED). إذا كان هذا حقل زائل الاستقطاب ثانية، تلك fluorophores التي هي موازية لساترة سيتم متحمس بدلا من ذلك (BLACK).

الشكل 2. ترونج> خلية رصد التشوهات الغشاء مع pTIRFM. أ) ترد الخام P و S الانبعاثات الصور جنبا إلى جنب مع حساب P / S و ف +2 صور S الانبعاثات. شريط النطاق، 3.2 ميكرون. ب) يتم استقطابها خلية أليف للكروم معربا عن SYT-1 pHluorin مع بوكل. وهناك عدد من البقع الفلورسنت الزاهية (اللوحة اليمنى) تشير إلى انصهار DCVs الفردية. شريط النطاق، 3.2 ميكرون. C) الإطار حسب الإطار الصور من الصمامات SYT-1 pHluorin DCV. مرات (فوق الصور) هي في ثوان. الوقت 0 يعين الإطار قبل التحام DCV. وتبين ايضا المقابلة P / S و ف +2 صور الانبعاثات S. . شريط النطاق هو 1 ميكرون D) الرسوم البيانية للصور في خط منقط هو C. في الوقت 0 - يظهر الإطار الانصهار E) أحد التفسيرات المحتملة لنتائج في C و D. بياض "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3. التشويهات هي نتيجة لأثار-التحفيز كا ^{2 +} تدفق. أ) يتم استقطابها خلية أليف للكروم transfected مع GCaMP5G مع 56 ملي بوكل. الزيادة الناتجة في GCaMP5G مضان يعني زيادة في subplasmalemmal كا ^{2 +} المستويات. ب) الإطار حسب الإطار الصور 30 × 20 بكسل المنطقة من الخلايا في A. تايمز أعلاه هي الصور في ثوان. السهام البيضاء تدل على وجود منطقة P / S الزيادة والنقصان S P +2. يتم استبعاد البروتين عصاري خلوي GCaMP5G من المنطقة بحلول DCV الصمامات. شريط النطاق، 1 ميكرون. C) الرسوم البيانية للصور هو مبين في B. D) يظهر أحد التفسيرات المحتملة لنتائج في B و C.3highres.jpg "الهدف =" _blank "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

iXon3 EMMCD كاميرا	أندور	897
IX81 مجهر مقلوب	اوليمبوس		الجمعية Filtercube الجانب محمولة
ليزر 43 سلسلة سورة ايون	السيدا ميلز Griot البصريات الليزر	543-AP-A01	الانضباطي إلى 488 نانومتر
الياقوت 561 ليرة لبنانية ليزر ديود	متماسك		561 نانومتر
مسح Galvo نظام مرآة	Thorlabs	GVS102
VC 3 قناة اتصال نظام الإرواء	ALA الأدوات العلمية	ALA VC3X4PP
QMM كوارتز MicroManifold	ALA الأدوات العلمية	ALA QMM-4
10 رطل منظم الضغط	ALA الأدوات العلمية	ALA PR10
مناور	بيرلي	TS 5000-150
شنت لا لونية ربع الموجة بلايت	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680 نانومتر مكعب الإستقطاب Beamsplitter	Thorlabs	PBS201
ستة محطة الكثافة المحايدة مدخل ل	Thorlabs	FW1AND
السائر بالمواتير SmartShutter	أدوات سوتر	IQ25-1219
HQ412lp مزدوج اللون تصفية	صفاء	NC255583	ينضم 488 نانومتر و 561 نانومتر الحزم
المغلفة بلانو عدسة مقعرة	ادموند البصريات	PCV 100MM VIS 0	يحيد 488 نانومتر شعاع
المغلفة بلانو عدسة مقعرة	ادموند البصريات	PCV 250MM VIS 0	يحيد 561 نانومتر شعاع
المغلفة بلانو عدسة محدبة	ادموند البصريات	PCX قذائف 125mm VIS 0	ويركز كل من الحزم
المغلفة بلانو عدسة محدبة	ادموند البصريات	PCX 50MM VIS 0	عزز لتصفية التجمع مكعب
z488/561rpc مزدوج اللون	صفاء	z488/561rpc	Filtercube مزدوج اللون
z488/561_TIRF الانبعاثات تصفية	صفاء	z488/561m_TIRF	الانبعاثات Filtercube
UIS2 60X الهدف	اوليمبوس	UPLSAPO 60XO	NA 1.37
النيون نظام ترنسفكأيشن	إينفيتروجن	MPK 5000
MetaMorph برامج التصوير	الأجهزة الجزيئية
الجاذبة غشاء صبغ	إينفيتروجن	V-22885	لمحاذاة أغراض
TH Liberase	روش	5401135001
TL Liberse	روش	5401020001
الدناز أنا النوع الرابع من الأبقار	سيغما	D5025
عدادة الكريات	الصياد	0267110
هل غشاء صبغ	إينفيتروجن	D-7757
رودامين	إينفيتروجن	R634
0.22 ميكرون وحدة تصفية غشاء الحقنة	ميليبور	SLGS033SS
Fluoresbrite متعدد الألوان الحمراء المجهرية	Polysciences	19507	0.5 ميكرومتر
النفط الغمر	سيغما	56822
ابفيف	الصكوك الوطنية		ضوابط galvo المرايا
الدوار قارورة	Bellco	1965-00250

<الدفتيريا> <آر>

الجدول 1. المعدات pTIRF المجهر.

محتويات	الإعدادية-PSS	القاعدية PSS	STIM-PSS
كلوريد الصوديوم	145 ملي	145 ملي	95 ملي
بوكل	5.6 ملي	5.6 ملي	56 ملي
MgCl 2	-	0.5 ملي	0.5 ملي
و CaCl 2	-	2.2 ملي	5 ملي
HEPES	15 ملي	15 ملي	15 ملي
درجة الحموضة	7.4	7.4	7.4
جلوكوز	2.8 ملي	5.6 ملي	5.6 ملي
القلم بكتيريا	1X	-	-

الجدول 2. الإرواء والحلول الإعدادية الخلايا أليفة الكروم.

محتويات	Electroporating وسائل الإعلام	طبيعي تصفيح وسائل الإعلام	2X المضادات الحيوية وسائل الإعلام
1X DMEM/F-12	1 مل / لوحة	2 مل / لوحة	1 مل / لوحة
FBS	10٪	10٪	10٪
السيتوزين Arabinofuranoside (CAF)	-	1 ميكرولتر / مل من 10 ملي الأسهم	-
بنسلين	-	100 وحدة / مل	200 وحدة / مل
الستربتومايسين عقار طبي	-	100 ميكروغرام / مل	200 ميكروغرام / مل
الجنتاميسين	-	25 ميكروغرام / مل	50 ميكروغرام / مل

الجدول 3. أليف للكروم وسائل الإعلام خلية.

محتويات	TH-PSS	TL-PSS
Liberase TH	2 مل	-
Liberase TL	-	0.85 مل
الإعدادية-PSS	98.0 مل	84.0 مل
الدناز	8.75 ملغ	7.4 ملغ

الجدول 4. TH-PSS وTL-PSS حلول.

Discussion

TIRFM القائم على الاستقطاب بالكشف، والتغيرات غير مرئي بالمجهر السريع في طوبولوجيا الغشاء. تنفيذ الأسلوب هو بسيط نسبيا، لا سيما إذا البصريات TIRF هي بالفعل في المكان. كل ما هو مطلوب هو لوحة الربع الموجة، واثنين من مكعبات استقطاب، ومصاريع لفصل ف ق بول وبول إضاءة مسارات. وعادة ما تمليه الموقف الدقيق لهذه المكونات على طاولة قرب المساحة المتوفرة.

من أجل الحصول على المعلومات الطوبوغرافية الغشاء، يجب التحقيق الفلورسنت المستخدمة يقحم مع التوجه ثابتة أو معروفة. هذه التقنية، كما هو موضح في هذه المقالة، يفترض استخدام الأصباغ carbocyanine ولكن الأصباغ الأخرى، مثل FM1-43 ^14، ويمكن أيضا أن تستخدم. الإجراء تلطيخ غشاء نفسها واضح ومباشر. الخلايا المستزرعة تتطلب سوى التعرض قصيرة جدا (أقل من 10 ثانية) على كمية صغيرة من الجاذبة / هل للحصول على وضع العلامات مندفعا من الغشاء. مضيفا الصبغة الزائدة يؤدي إلى تشتت الضوء المجاميع وآتش على الزجاج الذي يقلل من جودة الصورة. الإفراط في احتضان الخلايا مع صبغة يؤدي إلى صبغ الداخلي والتي لها آثار ضارة على جودة الصورة، وربما بقاء الخلية. إذا اتسخت خلية جيدا، وسوف يكون هناك تمييز واضح في الصور الانبعاثات P و S، كما هو مبين في الشكل 2A، فإن الانبعاثات P تسليط الضوء بشكل واضح مجالات الغشاء المائل التي هي ساترة (أي حواف البصمة الخلية) في حين أن كثافة الانبعاثات S سوف تكون موحدة تقريبا خلال البصمة الخلية. إذا هناك تمييز واضح بين P و S ليست واضحة، فمن الممكن أن الخلية يتم الالتزام سيئة إلى الركيزة أو غشاء الخلية ليست صحية، وعدم استخدام الخلايا للتجارب.

لدينا دراسات سابقة تصف pTIRFM تستخدم الجاذبة كما المسبار الغشاء الفلورسنت. هنا، ونحن لم تستخدم لأنها مناسبة للتجارب التصوير ثنائي اللون التي توظف GFP / pHluorin كما fluorophore الأخرى. نحن لم تثير وايال ليزر 561 نانومتر بدلا من 640 نانومتر ليزر (والذي هو أقرب إلى ذروة الإثارة به) لأن التبييض fluorophore بسرعة أكبر في 640 نانومتر. على الرغم من حقيقة أن نانومتر ليزر 561 على ذيل هل في الطيف الإثارة المنشورة، تنبعث مضان بكفاءة. ميزة أخرى من الليزر نانومتر 561 هو أنه يثير على حد سواء والجاذبة لم تمكننا من استخدام نفس الإعداد الاستقطاب لكلا تحقيقات. نلاحظ أن التوجه من fluorophore في الغشاء سوف تؤثر على تفسير طوبولوجيا الغشاء. على سبيل المثال، إذا كانت موجهة لfluorophore مع ثنائيات الاقطاب انتقالها عموديا على مستوى الغشاء (بدلا من موازية، أو موازية تقريبا، كما هو الحال مع الجاذبة أو لم)، ثم المناطق غشاء nonplanar سيتم تسليط الضوء من قبل S بسهولة أكبر بدلا من انبعاث P.

وصفناها أيضا تقنيات لعزل و electroporation الخلايا أليفة الكروم الكظرية البقري. الخلية أليفة الكروم البقري هو ق ممتازةنموذج ecretory. أنه يحتوي على مزايا كونها سهلة للحفاظ في الثقافة، استجابة لمجموعة متنوعة من secretogogues، وحيازة حويصلات إفرازية الكبيرة التي هي تصور بسهولة مع المجهر الضوئي التقليدية. للتعبير عن البروتينات الفلورية، وelectroporated الخلايا في التعليق قبل الطلاء على أطباق ثقافة المعالجة الكولاجين. في تجربتنا، وكفاءة التعبير هو أعلى من ذلك بكثير مع التثقيب الكهربائي مع أي من كا ^{2 +} فوسفات أو الكواشف Lipofectamine. العيب من التثقيب الكهربائي هو أنه يتطلب المزيد من الخلايا (كما العديد من البقاء على قيد الحياة لا عملية) والكواشف التجارية باهظة الثمن. وذلك لأسباب غير واضحة لنا، يشتمل يست كل غشاء فعلت. بالإضافة إلى ذلك، و transfected سوى جزء صغير من الخلايا على الطبق. يمكن العثور على الخلايا التي وو transfected ملطخة بشكل جيد مع هل يكون مضيعة للوقت وهذا هو السبب تحسين الظروف لتلطيخ و electroporation تستحق الجهد.

باختصار، هذايصف rticle كيفية تنفيذ pTIRFM لرصد تشوهات غشاء السريع والمترجمة التي تحدث أثناء اندماج الحويصلات الأساسية في الخلايا أليفة الكروم كثيفة البقري. على الرغم من أن تناقش طلب واحد فقط، هي مناسبة بشكل مثالي لهذه التقنية لدراسة العمليات البيولوجية الأخرى التي تنطوي على تغييرات في شكل الغشاء، بما في ذلك الإلتقام، الانقسام السيتوبلازمي، وحركية الخلية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
iXon3 EMMCD Camera	Andor	897
IX81 Inverted Microscope	Olympus		Side-mounted Filtercube Assembly
43 Series Ar-Ion Laser	CVI Milles Griot Laser Optics	543-AP-A01	Tunable to 488nm
Sapphire 561 LP Diode Laser	Coherent		561nm
Scanning Galvo Mirror System	Thorlabs	GVS102
VC3 Channel Focal Perfusion System	ALA Scientific Instruments	ALA VC3X4PP
QMM Quartz MicroManifold	ALA Scientific Instruments	ALA QMM-4
10 PSI Pressure Regulator	ALA Scientific Instruments	ALA PR10
Manipulator	Burleigh	TS 5000-150
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube	Thorlabs	PBS201
Six Station Neutral Density Wheel	Thorlabs	FW1AND
Stepper-motor Driven SmartShutter	Sutter Instruments	IQ25-1219
HQ412lp Dichroic Filter	Chroma	NC255583	Joins 488nm and 561nm beams
Coated Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 100mm VIS 0	Diverges 488nm beam
Coated Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 250mm VIS 0	Diverges 561nm beam
Coated Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 125mm VIS 0	Focuses both beams
Coated Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 50mm VIS 0	Cemented to filter cube assembly
z488/561rpc Dichroic	Chroma	z488/561rpc	Filtercube dichroic
z488/561_TIRF Emission Filter	Chroma	z488/561m_TIRF	Filtercube emission
UIS2 60x Objective	Olympus	UPLSAPO 60XO	NA 1.37
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK 5000
MetaMorph Imaging Software	Molecular Devices
DiI Membrane Dye	Invitrogen	V-22885	For Alignment Purposes
TH Liberase	Roche	5401135001
TL Liberse	Roche	5401020001
DNAse I Type IV from bovine	Sigma	D5025
Hemocytometer	Fisher	0267110
DiD Membrane Dye	Invitrogen	D-7757
Rhodamine	Invitrogen	R634
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit	Millipore	SLGS033SS
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres	Polysciences	19507	0.5 microns
Immersion Oil	Sigma	56822
LabVIEW	National Instruments		Controlls galvo mirrors
Spinner Flask	Bellco	1965-00250