Imaging Plasma membrana Deformazioni Con pTIRFM

Riepilogo

Basato polarizzazione-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) permette un rilevamento in tempo reale della dinamica della membrana cellulare. Questo articolo descrive l'implementazione di pTIRFM per lo studio della membrana rimodellamento durante l'esocitosi regolata. La tecnica è generalizzabile ad altri processi in biologia cellulare che coinvolgono direttamente o indirettamente cambiamenti di forma della membrana.

Abstract

Per ottenere nuove intuizioni le dinamiche di esocitosi, il nostro gruppo si concentra sui cambiamenti di forma doppio strato lipidico che devono essere regolati proprio durante la fusione delle membrane delle vescicole e di plasma. Questi cambiamenti rapidi e localizzati sono raggiunti da interazioni dinamiche tra lipidi e proteine ​​specializzate che controllano membrana curvatura. L'assenza di tali interazioni non solo avrebbe conseguenze devastanti per la fusione delle vescicole, ma una miriade di altre funzioni cellulari che coinvolgono control forma di membrana. Negli ultimi anni, l'identità di un numero di proteine ​​con proprietà membrane-shaping è stata determinata. Ciò che rimane manca è una tabella di marcia di quando, dove e come agiscono, come la fusione e il progresso di rilascio dei contenuti.

La nostra comprensione degli eventi molecolari che consentono il rimodellamento della membrana è stato storicamente limitato dalla mancanza di metodi analitici che sono sensibili a membrana curvatura o hanno la risoluzione temporale di track rapidi cambiamenti. PTIRFM soddisfa entrambi i criteri. Discutiamo come pTIRFM viene implementato per visualizzare e interpretare i cambiamenti rapidi e inferiori al micron nell'orientamento delle membrane delle cellule cromaffini durante nucleo denso di vescicole (DCV) fusion. Le cellule cromaffini che usiamo sono isolati dalle ghiandole surrenali bovini. La membrana viene trattato con un colorante carbocyanine lipofila, 1,1 '-dioctadecil-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4 chlorobenzenesulfonate, o fatto. DiD intercala nel piano membrana con un orientamento "fisso" ed è quindi sensibile alla polarizzazione del campo evanescente. La membrana cellulare DID macchiato è sequenziale eccitato con polarizzazioni ortogonali di un laser a 561 nm (p-pol, s-pol). Un laser 488 nm è usato per visualizzare costituenti vescicole e tempo il momento della fusione. Esocitosi è innescato da localmente perfusione delle cellule con una soluzione di KCl depolarizzante. L'analisi viene eseguita offline utilizzando software personalizzato scritto per capire come ha fattoemissione cambiamenti di intensità riguardano la fusione dei pori dilatazione.

Introduzione

La corretta esecuzione della esocitosi richiede cambiamenti estremi di forma doppio strato di membrana deve essere orchestrato con precisione. Prima della fusione, curvatura locale della membrana plasmatica sotto il granulo si verifica, in parte per ridurre la barriera di energia per l'interazione di bistrati. Più tardi, come le membrane si fondono, zone di alta curvatura vengono generate e devono essere stabilizzati. Infine, le membrane fusi devono essere piegati dalla loro forma iniziale per espandere il poro di fusione e permettere il rilascio dei contenuti ^1. Poiché le membrane da soli è improbabile di sottoporsi a tali cambiamenti drammatici e coordinate, le proteine ​​sono necessarie per mediare eventi. Ma come si comportano influenzare cambiamenti di topologia di membrana durante il processo di fusione rimane molto una questione aperta.

Eccellente in modelli in vitro esistono per visualizzarne la membrana curvatura. L'uso di colorazione negativa EM, per esempio, è stato importante per plasmare modelli molecolari correnti per le azioni di due grandi traffici proteins - synaptotagmin e dynamin (per le recensioni, vedere Chapman ² e ³ Henshaw). La maggior parte delle analisi in tempo reale di esocitosi non rilevano direttamente curvatura. Invece, la curvatura è dedotto da saggi che riportano sulla cinetica di rilascio lumenal carico ^4-8 o cambiamenti nella zona della membrana ^9-11. PTIRFM colma il divario tra in vivo e in vitro, consentendo diretti, misure in tempo reale dei cambiamenti nella membrana micromorfologia.

PTIRFM, in un modo nonimaging, è stato lanciato da Axelrod e colleghi per misurare l'orientamento della NPD-PE incorporato all'interno di un modello di membrana ^12. La tecnica è stata poi applicata per visualizzare i cambiamenti dinamici nelle cellule viventi etichettati con DII e FM1-43, ^13-18. In pTIRFM, due polarizzazioni campo evanescente sono utilizzate per eccitare sequenzialmente una sonda membrana incorporato: p-polarizzazione (nel piano di incidenza) e s-polarizzazione (perpendicolare al piano di incidenza). Prima di imaging, la sonda - in questo caso, DID - viene brevemente aggiunto al mezzo extracellulare ed è permesso di intercalare nelle membrane plasmatiche delle cellule da studiare. Nelle regioni in cui la membrana è non paralleli al coprioggetti (come in un volant membrana o rientro), il DID sarà anche non paralleli. Pertanto, tali regioni saranno eccitabile dal fascio p-pol. Il fascio p-pol sarà meno efficacemente eccitare ha fatto nelle regioni di membrana che sono per lo più paralleli al coprioggetti. Immagini rapporto pixel-to-pixel (P / S) relazioni sulle emissioni da sequenziale p-e s-pol eccitazione Lo sarà quindi in particolare evidenza le regioni di membrana deformazione. In teoria, le immagini rapporto P / S sono sensibili anche a piccoli angoli di deviazione dalla membrana plasmatica coprioggetti, con l'ampiezza dei cambiamenti previsti da simulazioni al computer ^18. Immagini P / S sono indipendenti le fluoroforo distanza dalla superficie coprioggetti e fluoroforo localeconcentrazione. Concentrazione del fluoroforo locale è invece fornito da segnalare immagini sulla somma pixel-per-pixel dell'emissione P e 2 volte l'emissione S (P +2 S). Il P +2 misure S è sensibile alla geometria precisa del rientro, con qualche, poco o nessun cambiamento possibile. Questo può essere dimostrato da simulazioni al computer che modellano le transizioni di un poro di fusione da un precoce (cioè con un collo stretto) ad uno stato più tardi ^16,18. Il P +2 S di una vescicola fuso attaccato alla membrana plasmatica tramite un collo stretto (e con più DID vicino all'interfaccia) è previsto per essere maggiore, ad esempio, a quella di una vescicola fuso con un poro molto più ampia (dove l' Lo è all'interno della parte più debole del campo evanescente).

In questo articolo, vedremo come pTIRFM viene implementato e utilizzato per studiare i cambiamenti rapidi e localizzati in forma di membrana che si verificano durante la fusione dei pori dilatazione. Mentre una sola applicazione è esplicitamente discussed, i metodi sono generalizzabili a una varietà di altri processi biologici cellulari che coinvolgono direttamente o indirettamente membrana rimodellamento.

Protocollo

1. Configurazione PTIRF sistema

La tecnica pTIRFM è costruito su una piattaforma microscopio invertito. I raggi laser sono diretti attraverso una porta illuminazione laterale e una nonpolarizing orientati lateralmente filtro cubo, e poi concentrati sul piano focale posteriore di un obiettivo 60X 1,49 NA TIRF. Due lenti addizionali (1,6 x e 2x) nel percorso di emissione tra il microscopio e telecamera EMCCD danno una dimensione finale del pixel di circa 80 nm. I raggi laser sono guidati mediante specchi galvanometro software controllata per un rapido passaggio tra riflessione interna-epi e totale (TIR) ​​illuminazione. Il protocollo descritto di seguito presuppone che ottiche per TIRF sono già posizionati sul tavolo aria nelle posizioni ottimali per eccitazione fluoroforo e imaging. Esso descrive come ottiche di polarizzazione vengono aggiunti ad un esistente microscopio TIRF set-up per consentire l'imaging di deformazioni della membrana cellulare. Uno schema di set-up ottico del nostro laboratorio per la generazione sia per TIR e polarizatTIR base ION è mostrato nella Figura 1A. Il protocollo presuppone l'utilizzo di un laser a 488 nm per l'eccitazione di proteine ​​vescicole fluorescenti e un laser 561 nm per l'imaging del colorante carbocyanine, DID.

1. Accendere tutti i componenti del microscopio, laser e computer.
2. Dirigere un fascio dal laser 488 nm al piano focale posteriore (BFP) della lente 1,49 NA come illustrato nella Figura 1A. Se il fascio laser viene focalizzato sulla BFP, esso emergerà collimato e appaiono come piccolo punto ben definito sul soffitto direttamente sopra l'obiettivo.
3. Regolare lo specchio X galvanometro (specchio situato nel piano del campione equivalente) in modo che il raggio laser viene spostato fuori asse e fuoriesce dall'obiettivo del perpendicolarmente progressivamente più ripidi al normale obiettivo.
4. Avanti, verificare che TIR è raggiunto. Aggiungere 10 ml di microsfere fluorescenti ad un volume di 1 ml PSS in un piatto fondo di vetro. Fluorescenza solo da microsfere sul fondo of il piatto, più vicino all'interfaccia TIR, dovrebbe essere rilevata. Rilevamento di microsfere flottanti significa che l'angolo tra la luce incidente e la normale obiettivo è insufficiente.
   
   La sezione seguente descrive la configurazione dei componenti ottici necessari per l'imaging basato polarizzazione.
5. Utilizzando il fascio allineato 488 nm come guida, regolare la posizione del greggio raggio laser 561 nm per cui sta viaggiando lungo un percorso ottico identico. Il laser 561 nm verrà utilizzata per l'imaging del colorante carbocyanine, DID.
6. Inserire una lente divergente e specchi valle del laser 561 nm. Utilizzando gli specchi, regolare il fascio in modo che sia coaligned con il fascio 488 nm e il punto è a fuoco sul soffitto quando gli specchi galvanometro sono in posizione "0".
7. Centrare una lamina a quarto d'onda (QW) nel percorso ottico immediatamente a valle dell'apertura laser. Utilizzare un QW che è o acromatica o sintonizzato sulla lunghezza d'onda di eccitazione.Un QW sarà circolarmente polarizzare qualsiasi luce linearmente polarizzata che entra ad un angolo di 45 ° con l'asse ottico. Alcuni componenti ottici, come i cubetti di polarizzazione, vi è una propensione attenuazione verso un asse di polarizzazione. Il QW può essere ruotata per compensare questa distorsione. Tale adeguamento si tradurrà in un fascio ellitticamente polarizzato. Un QW è necessario perché il fascio laser stesso altamente è polarizzata linearmente (verticale) come emerge dalla apertura.
8. Collocare un cubo polarizzazione (PC1) a valle del fascio polarizzato ellitticamente. Il cubo polarizzazione riflette la (y) componente verticale del campo elettrico e passa il (x) componente orizzontale. Il cubo polarizzazione è posto su un piccolo palco traslante per facilitare la successiva allineamento dei percorsi ottici di polarizzazione.
9. Utilizzare un secondo cubo polarizzatore (PC2) e specchi (Figura 1A) per ricombinare le travi.
10. Posizionare un otturatore tra il primo cubo di polarizzazione (PC1) e il co verticalespecchio mponent. Posizionare un secondo scatto tra lo specchio componente orizzontale e secondo cubo di polarizzazione (PC2). Queste persiane sono controllati dal software di imaging che consente all'utente di selezionare rapidamente tra polarizzazioni fascio.
11. Utilizzare un filtro polarizzatore per verificare l'orientamento del campo elettrico in ciascun percorso ottico. Un filtro polarizzatore solo consentirà trasmissione in linea con l'asse del filtro.
12. Verificare che i componenti verticale ed orizzontale del fascio laser sono allineati tra loro e il fascio 488 nm. Effettuare le regolazioni necessarie. I tre fasci dovrebbero essere concentrati sul BFP ed emergono collimata dall'obiettivo allo stesso punto sul soffitto. Questo punto può essere contrassegnato da una X per facilitare l'allineamento futuro.
13. Mettere una goccia di olio di immersione sull'obiettivo. Porre la capsula contenente microsfere fluorescenti (vedi punto 4) sull'obiettivo.
14. Inserisci TIR spostando lo specchio X galvanometro. In TIR, la componen verticalet del fascio è la s-pol e la componente orizzontale del fascio è ora il p-pol. Regolare l'intensità relativa tra le travi ruotando la piastra QW. Visualizzare ogni campo evanescente polarizzata con un campione rodamina, che si prevede sia orientato in modo casuale. Ruotare la piastra QW per abbinare le intensità media dei pixel. Se necessario, aggiungere un filtro neutro in un percorso di fascio polarizzato per attenuare l'intensità.

2. Isolamento delle cellule cromaffini

Una procedura per isolare cellule cromaffini sane dalla ghiandola surrenale vitello è il seguente. Si è adattato da protocolli precedentemente pubblicati da Wick, Senter, et al. ¹⁹ e O'Connor, Mahata et al. ²⁰ Dopo l'isolamento, le cellule sono elettroporate con il plasmide (s) di interesse utilizzando un sistema di elettroporazione. Risultati di questo sistema in 20-30% di cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti desiderati. In genere, il 70% delle cellule sopravvivono elettiprocesso roporation. I dettagli dei componenti PSS e multimediali sono ottenute nelle tabelle 2, 3 e 4.

1. Due giorni prima della preparazione delle cellule, il trattamento di 35 mm piatti con fondo di vetro qualità ottica (0,17 mm di spessore) con 1 ml di poli-D-lisina (0,1 mg / ml) seguita da 1,25 ml collagene bovino. Lasciare asciugare i piatti in cappa di coltura tissutale.
2. Ottenere ghiandole surrenali bovini da macello. Mantenere le ghiandole sul ghiaccio mentre sono trasportati al laboratorio. Le ghiandole surrenali bovina possono essere racchiusi in uno spesso strato di grasso. Usare le forbici chirurgiche per rimuovere il grasso in eccesso ed esporre l'apertura vena surrenalica. Profumato la vena con prep-PSS ripetutamente fino a quando la ghiandola viene spurgato di sangue.
3. Successivamente, pipettare lentamente 2 ml di soluzione TH-PSS nell'apertura vena fino agli ghiandola si gonfia. Incubare le ghiandole gonfiate a 37 ° C per 15 min. Ripetere il trattamento TH-PSS e incubare di nuovo.
4. Tagliare attraverso la corteccia surrenale esterno intorno al bordo della ghiandola con scissors e sbucciare la ghiandola a parte per esporre il midollo. Utilizzare un bisturi per raschiare delicatamente e separare il midollo dal tessuto corticale.
5. Tritare il midollo con una coppia di lame di bisturi per 5-10 min.
6. Una fase di digestione finale è necessario isolare cellule cromaffini individuali. Versare la sospensione cellulare macinata in un pallone filatrice. Riempire parzialmente il pallone con un rapporto 2:1 di TH-PSS (30 ml) di TL-PSS (15 ml) e incubare per 30 min a 37 ° C, mentre la filatura a circa 100 rpm.
7. Separare le singole cellule cromaffini dal tessuto non digerito filtrando attraverso una maglia 400 micron. Raccogliere il filtrato. Centrifugare a 200 xg per far sedimentare le cellule e risospendere in ghiaccio PSS freddo.
8. Filtrare le cellule attraverso una maglia 250 micron, pellet, e, infine, risospendere in tampone elettroporazione (vedi passo 2.9).
9. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e preparare per la trasfezione.
10. Trasfettare cellule con il sistema di elettroporazione secondoraccomandazioni del fabbricante. Le condizioni precise per l'elettroporazione devono essere determinati empiricamente. Nota: Le impostazioni che offrono il miglior rapporto tra efficienza di trasfezione e la cella tasso di sopravvivenza per questa preparazione di cellule bovine cromaffini sono 1.100 V, 40 msec e 1 impulso. Stimiamo che con queste condizioni, il 20-30% delle cellule sono transfettate. Circa il 30% delle cellule non sopravvivono al processo di elettroporazione.
11. Cellule piastra delicatamente su poli-D-lisina e collagene trattati piatti in 1 ml di mezzi di comunicazione electroporating riscaldati.
12. Posizionare piatti in un incubatore a 37 ° C (5% CO _2). Aggiungere 1 ml di mezzi di antibiotici 2x per ogni piatto dopo 6 ore. Modificare il supporto ai media normale il giorno successivo.
13. Cellule cromaffini sono tipicamente esposte 2-5 giorni dopo l'elettroporazione.

3. pTIRF Acquisizione Immagine

1. Accendere il sistema di imaging e avviare il software di acquisizione.
2. Verificare che i laser siano allineati. Controllare evanescenteProfilo campo utilizzando microsfere.
3. Preparare il sistema di perfusione globale e locale. Serbatoi di soluzione puliti con filtrata deionizzata H ₂ O e si riempiono di basale e stimolanti soluzioni PSS.
4. Prima di imaging cellule cromaffini, verificare che i p-pol e s-pol eccitazioni illuminano la stessa regione del campo visivo e che le intensità di illuminazione sono più o meno equivalenti. A tale scopo, riempire un piatto fondo di vetro con 2 ml di PSS contenenti rodamina ad una concentrazione finale di 10 mM. Sequenzialmente eccitare il campione rhodamine con p-pol e la luce s-pol e catturare le immagini. In pratica, le emissioni P e S da DID sono normalizzati per la media della P e S emissioni rodamina. Vedere le sezioni di analisi di immagine e di discussione per ulteriori dettagli.
5. Ora procedere alla colorazione delle cellule cromaffini bovine con DID. Risciacquare coltura dal piatto contenente le cellule cromaffini e sostituire con 2 ml di basal-PSS. Aggiungere 10 ml di 10 mM DID (diluito in etanolo)direttamente al piatto contenente le cellule. Agitare delicatamente piatto per 2-10 secondi e rimuovere la DID soluzione + PSS.
6. Lavare il piatto 3-4x con basale-PSS per rimuovere eventuali residui DID. Le cellule sono ora macchiati e pronto all'uso.
7. Aggiungere una goccia di olio di immersione all'obiettivo. Porre piatto contenente cellule cromaffini DID colorate sulla parte superiore dell'obiettivo.
8. Visualizzazione del piatto sia attraverso l'obiettivo o la fotocamera, trovare una cella che è trasfettate con la proteina di interesse e colorate con DID. Una cella ben colorato presenta un'emissione P che evidenzia vividamente i bordi della cella; l'emissione S dovrebbe essere all'incirca uniforme attraverso l'impronta cella (cioè la regione della cella che si aderisce al vetro e ripreso in TIRF).
9. Posizionare l'ago perfusione locale in modo che sia circa 100 micron dalla cella.
10. Concentrarsi sulla membrana cellulare ed attivare l'hardware autofocus immediatamente prima dell'acquisizione stimolazione cellulare / immagine.
11. Inizia l'acquisizione delle immagini. Perfusione cellule per 10 secondi con una soluzione basale e poi per 60 secondi con una soluzione depolarizzante 56 mM KCl. Acquisire immagini mentre rapidamente casseforme tra 561 nm p-pol, 561 nm s-pol (per monitorare i cambiamenti in P e S emissione di fatto) e 488 nm di eccitazione (per l'immagine della sonda vescicola transfettate). Esempi di immagini acquisite durante gli esperimenti sono mostrati in Figura 2 e Figura 3.

4. Image Analysis

I calcoli per l'elaborazione delle immagini possono essere effettuate con ImageJ, ma gli script che utilizzano in un linguaggio di programmazione flessibile come IDL o Matlab possono aumentare notevolmente la velocità di analisi automatizzando il compito. Due tipi di immagini devono essere calcolati per ottenere informazioni topologiche da immagini di emissione prime. - P / S e P +2 S P / S riferisce su deformazioni della membrana locali mentre il P +2 S somma riferisce sulla colorante membrana totale in una data regionedel campo.

1. Tutte le immagini devono essere sottratti sfondo. Scegliere un ROI off-cella, misurare l'intensità media dei pixel nella ROI, e sottraendo tale valore da tutti i pixel della serie di immagini.
2. Per calcolare P / S, dividere ogni "P" frame emissione dal successivo frame "S" emissione (pixel-per-pixel). P / S varia con le intensità relative dei p-e s-pol eccitazioni, distorsioni nel sistema ottico, e frange di interferenza. Per ridurre questi effetti, normalizzare i rapporti P / S dal ottenuti da Lo emissione al rapporto ottenuto con una soluzione contenente rodamina mm 10 ^18.
3. Esocitosi dei singoli DCVs è evidente da un improvviso cambiamento di intensità di una proteina fluorescente vescicola, come sinaptotagmina-1 pHluorin (Figura 2B). Determinare le variazioni di P / S e P +2 S facendo la media dei pixel in una ROI raggio 240 nm centrata su aumenti localizzati di P / Srapporto in siti di esocitosi. Quando si verifica la fusione senza un evidente aumento P / S, il ROI sia centrato sulla regione del DCV fusione.
4. Simulazioni al computer possono essere eseguite per interpretare +2 S membrana variazioni di intensità P / S e P in termini di semplici forme geometriche di un poro dilatazione fusione. Per i dettagli delle simulazioni, vedere Anantharam et al ^18.

Risultati

Tecniche di imaging TIRFM convenzionali e polarizzati sono implementati sullo stesso tavolo aria. La configurazione degli elementi ottici è simile, con la differenza che la luce di eccitazione è polarizzato (Figura 1A). La luce polarizzata eccita preferenzialmente fluorofori con dipoli di assorbimento in direzione di polarizzazione. Così, per pTIRFM sia efficace a monitorare membrana cambiamenti topologici, la sonda utilizzata deve intercalare nella membrana con un orientamento fisso. I coloranti fluorescenti carbocyanine (DII, DID) intercalare in doppi strati lipidici in modo orientato con dipoli di transizione nel piano della membrana (Figura 1B). P-polarizzato illuminazione (Figura 1C) di membrane DID-etichettati eccita selettivamente coprioggetto-obliquo fluorofori (RED nelle figure 1B e 1D).

Etichettatura membrana esuberante di cellule cromaffini si raggiunge dopo abincubazione rief con DID. Figura 2A mostra un esempio di una membrana cellulare che è macchiata bene. A, di cellule aderenti sano esporrà differenze tra le P e S emissioni. L'immagine emissione P presenta un bordo cella luminoso rispetto al resto della cellula. L'immagine emissione di S mostra fluorescenza all'incirca uniforme su tutta l'impronta delle cellule. +2 Immagini elaborate P pixel-per-pixel / S e P s sono sensibili a membrana curvatura e concentrazione di colorante, rispettivamente. La cella cromaffini visualizzato è stato anche trasfettate con sinaptotagmina-1 pHluorin (Syt-1) per etichettare vescicole secretorie (Figura 2B).

La cella cromaffini viene stimolato con 56 mM KCl per depolarizzare la membrana cellulare e innescare esocitosi. Una serie di vivaci macchie fluorescenti Syt-1 pHluorin improvvisamente diventato evidente come fusibile DCVs (Figura 2B, pannello di destra). Una casella bianca è disegnato intorno a un evento di fusione (Figura 2B, pannello di destra). Questo evento i fusions analizzato nelle figure 2C e 2D. figura 2C mostra i cambiamenti fotogramma per fotogramma in Syt-1-pHluorin, P / S e P 2 intensità di immagine S. Intensità di fluorescenza di Syt-1 diminuisce rapidamente la proteina diffonde lontano dalla sede di fusione (Figura 2D). Il rientro rappresenta il complesso membrana della vescicola / plasma fuso diminuisce a un ritmo relativamente lento (Nota grafici nella Figura 2D). L'illustrazione (Figura 2E) raffigura una interpretazione di queste misure.

Le deformazioni della membrana rapide e localizzate mostrati nella Figura 2 sono il risultato di stimolo evocato Ca ^{2 +} afflusso. Ciò è mostrato nella Figura 3A. Una cella cromaffini è trasfettate con la genetica Ca ^{2 +} indicatore GCaMP5G ^21,22 e stimolate con 56 mM KCl. Depolarizzazione della membrana provoca un aumento significativo GCaMP5G fluorescenza ( ng> Figure 3A e 3B) significa un aumento subplasmalemmal Ca ^{2 +} livelli. Una regione 30 x 20 pixel della cella viene selezionata e cambia fotogramma per fotogramma in GCaMP5G, P / S e P 2 S intensità dei pixel sono presenti nelle immagini (Figura 3B) e grafici (Figura 3C). Time "0" indica telaio prima un modificare un P / S evidente (ossia telaio prima esocitosi). Le frecce bianche indicano che la deformazione della membrana (aumento di P / S) è accompagnato da una diminuzione della P +2 emissione S. La proteina citoplasmatica GCaMP5G è esclusa dalla zona del DCV fuso. Si noti anche l'improvviso calo di intensità GCaMP5G al tempo 0 in figura 3C, pannello di sinistra. La lunga durata aumento di P / S e la diminuzione in P 2 S suggeriscono un poro di fusione che dilata lentamente (Figura 3D).

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Figura 1. Illustrazioni per la tecnica pTIRFM. A) è mostrato uno schema per combinare convenzionale con base polarizzazione-imaging TIRF. Una piastra a quarto d'onda (QW) è posto di fronte a un laser zaffiro 561-nm per polarizzare ellitticamente il fascio laser. Un cubo di polarizzazione (PC1) viene utilizzato per separare le polarizzazioni in (v) e orizzontale (h) componenti verticali lineari. I componenti verticali e orizzontali diventano il p-pol e travi eccitazione s-pol, rispettivamente, alla superficie TIR. I percorsi p-pol e s-Pol sono chiuse in modo indipendente (S1 e S2). Essi sono ricombinati con specchi e un secondo cubo polarizzatore (PC2). Si uniscono il fascio di 488 nm (anche indipendentemente persiane, S3) tramite un elemento a trave direttivo composto da uno specchio e nonpolarizing specchio dicroico (DC). Lenti (L) sono utilizzati per espandere e mettere a fuoco le travi. Combinata 488 nm e 561 nm travi sono guidate da una porta illuminazione laterale del microscopio via galvanospecchi metro (GM). Essi si concentrano al piano focale posteriore (BFP) dell'obiettivo. Etichettatura fotoni emessi da fluorofori vengono catturati su una fotocamera EMCCD collegato ad un PC. B) DID viene eseguita incubando brevemente cellule con il colorante e lavare ripetutamente per rimuovere l'eccesso. DiD intercala nella membrana con i suoi momenti di dipolo di transizione all'incirca nel piano di membrana. C) La luce incidente polarizzata nel piano di incidenza (p-pol) crea un campo evanescente che è prevalentemente polarizzata normale all'interfaccia, come mostrato. D) L'illuminazione di una membrana DID marcato con la luce p-polarizzata selettivamente eccitare i fluorofori che sono coprioggetti-obliqua (RED). Se questo fosse un campo evanescente s-polarizzata, tali fluorofori che sono parallele alla coprioggetti sarebbero eccitati invece (NERO).

Figura 2. trong> cellulari Monitoring deformazioni della membrana con pTIRFM. A) sono mostrati Raw P e S immagini emissioni insieme calcolato P / S e P 2 immagini emissioni S. Barra della scala, 3.2 micron. B) Una cellula cromaffine esprime Syt-1 pHluorin è depolarizzata con KCl. Un certo numero di macchie fluorescenti vivaci (pannello di destra) indica la fusione di singoli DCVs. Barra della scala, 3.2 micron. C) frame-by-frame immagini di una fusione Syt-1 pHluorin DCV. Tempi (sopra le immagini) sono in secondi. Tempo 0 indica fotogramma prima fusione del DCV. Sono indicate anche due immagini di emissione S corrispondente P / S e P. . Bar scala è 1 micron D) Grafici per le immagini in linea C. tratteggiata è al tempo 0 - mostra il fotogramma di fusione E) Una possibile interpretazione dei risultati in C e D.. blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Deformazioni sono il risultato di stimolo evocato Ca ^{2 +} afflusso. A) Una cellula cromaffini trasfettate con GCaMP5G è depolarizzata con 56 mM KCl. Il conseguente aumento GCaMP5G fluorescenza indica un aumento subplasmalemmal Ca ^{2 +} livelli. B) le immagini fotogramma per fotogramma di 30 x 20 pixel nell'area di cellula in A. I tempi di cui sopra sono immagini in pochi secondi. Frecce bianche indicano una regione di incremento P / S e P +2 diminuzione S. Proteina citoplasmatica GCaMP5G è escluso dalla regione dal DCV fusione. Barra della scala, 1 micron. C) grafici per le immagini mostrate in B. D) viene mostrata Una possibile interpretazione dei risultati in B e C.3highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Camera iXon3 EMMCD	Andor	897
IX81 invertito Microscopio	Olimpo		Laterale Filtercube Assemblea
Laser 43 Serie Ar-Ion	CVI Milles Griot ottica laser	543-AP-A01	Sintonizzabile a 488 nm
Sapphire 561 LP diodo laser	Coerente		561 nm
Scansione Galvo sistema di Mirror	Thorlabs	GVS102
VC 3 Channel Focal sistema di perfusione	ALA Scientific Instruments	ALA VC3X4PP
QMM quarzo MicroManifold	ALA Scientific Instruments	ALA QMM-4
10 psi Regolatore di pressione	ALA Scientific Instruments	ALA PR10
Manipolatore	Burleigh	TS 5000-150
Montato acromatico Quarter-Wave Piatto	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680 nm polarizzante beamsplitter Cube	Thorlabs	PBS201
Sei Stazione Wheel Neutral Density	Thorlabs	FW1AND
Motore passo-passo Driven SmartShutter	Strumenti Sutter	IQ25-1219
HQ412lp Dichroic Filter	Chroma	NC255583	Unisce 488 nm e 561 nm travi
Coated Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 100 millimetri VIS 0	Diverge 488 fascio nm
Coated Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 250 millimetri VIS 0	Diverge 561 fascio nm
Coated Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 125 millimetri VIS 0	Si concentra entrambi i fasci
Coated Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 50 millimetri VIS 0	Cementato per filtrare l'assemblaggio del cubo
z488/561rpc Dichroic	Chroma	z488/561rpc	Filtercube dicroici
z488/561_TIRF Emission Filter	Chroma	z488/561m_TIRF	Emissione Filtercube
UIS2 60X Obiettivo	Olimpo	UPLSAPO 60XO	NA 1.37
Neon Transfezione sistema	Invitrogen	MPK 5000
MetaMorph software di imaging	Molecular Devices
DII membrana Dye	Invitrogen	V-22885	Ai fini dell'allineamento
TH Liberase	Roche	5401135001
TL Liberse	Roche	5401020001
DNAse I Tipo IV da bovini	Sigma	D5025
Emocitometro	Pescatore	0267110
DiD membrana Dye	Invitrogen	D-7757
Rhodamine	Invitrogen	R634
0,22 micron Unità filtro a membrana siringa	Millipore	SLGS033SS
Fluoresbrite policromatici Red Microspheres	Polysciences	19507	0,5 micron
Immersione in olio	Sigma	56.822
LabVIEW	National Instruments		Controlli Galvo specchi
Spinner Flask	Bellco	1965-00250

Tabella 1. attrezzature pTIRF Microscopia.

Contenuto	Prep-PSS	Basale-PSS	Stim-PSS
NaCl	145 mm	145 mm	95 mm
KCl	5.6 mM	5.6 mM	56 mm
MgCl 2	-	0,5 mm	0,5 mm
CaCl 2	-	2,2 mm	5 mM
HEPES	15 MM	15 MM	15 MM
pH	7.4	7.4	7.4
Glucosio	2,8 mm	5.6 mM	5.6 mM
Pen-Strep	1x	-	-

Tabella 2. Perfusione e soluzioni di preparazione delle cellule cromaffini.

Contenuto	Electroporating media	Normale placcatura media	2x Antibiotico media
1x DMEM/F-12	1 ml / piastra	2 ml / piastra	1 ml / piastra
FBS	10%	10%	10%
Citosina arabinofuranoside (CAF)	-	1 ml / ml di 10 mM Archivio	-
Penicillina	-	100 unità / ml	200 unità / ml
Streptomicina	-	100 pg / ml	200 mg / ml
Gentamycin	-	25 mcg / ml	50 mg / ml

Tabella 3. Media Cella cromaffini.

Contenuto	TH-PSS	TL-PSS
Liberase TH	2 ml	-
Liberase TL	-	0.85 ml
Prep-PSS	98,0 ml	84,0 ml
DNasi	8.75 mg	7.4 mg

Tabella 4. TH-PSS e TL-PSS Solutions.

Discussione

TIRFM base di polarizzazione rileva cambiamenti rapidi e submicroscopici nella topologia di membrana. Implementare la tecnica è relativamente semplice, soprattutto se l'ottica TIRF sono già in atto. Tutto quello che serve è un piatto a quarto d'onda, due cubi polarizzatori, e tapparelle per separare i percorsi p-pol e illuminazione s-pol. La posizione precisa di questi componenti sul tavolo è solitamente dettata dalla spazio disponibile.

Per ottenere informazioni membrana topologica, la sonda fluorescente utilizzato deve intercalare con un orientamento fisso o conosciuto. La tecnica, come descritto in questo articolo, presuppone l'utilizzo di coloranti carbocyanine ma altri coloranti, come FM1-43 ^14, possono anche essere utilizzati. La procedura di colorazione membrana stessa è semplice. Cellule coltivate richiedono solo una breve esposizione (meno di 10 sec) ad una piccola quantità di DII / DID per ottenere l'etichettatura esuberante della membrana. L'aggiunta di colorante in eccesso porta alla luce dispersione AGGREGAtes sul vetro che diminuiscono la qualità dell'immagine. Over-incubando le cellule con colorante porta a tingere di interiorizzazione che ha effetti dannosi sulla qualità dell'immagine e possibilmente la vitalità cellulare. Se una cella è macchiato bene, ci sarà chiara distinzione nelle immagini di emissione P e S. Come mostrato in Figura 2A, l'emissione P sarà vividamente evidenziare aree della membrana che sono oblique coprioggetto (cioè i bordi del footprint cella) mentre l'intensità di emissione S sarà all'incirca uniforme su impronta cella. Se una chiara distinzione tra P e S non è evidente, allora è possibile che la cellula è scarsamente aderire al substrato o la membrana cellulare non è sano, e la cella non viene utilizzato per esperimenti.

Nostri studi precedenti che descrivono pTIRFM utilizzati Dii come la sonda fluorescente membrana. Qui, utilizziamo fatto perché è adatto per gli esperimenti di imaging a due colori che impiegano GFP / pHluorin come l'altro fluoroforo. Si eccitano DID wi° Un laser 561 nm anziché 640 nm laser (che è più vicino al suo picco eccitazione) perché i candeggianti più rapidamente fluoroforo a 640 nm. Nonostante il fatto che il laser 561 nm è sulla coda Lo spettro di eccitazione pubblicato, la fluorescenza emessa efficiente. Un altro vantaggio del laser 561 nm è che si eccita entrambi i Dii e ha fatto ci permette di utilizzare la stessa configurazione di polarizzazione per entrambe le sonde. Notare che l'orientamento del fluoroforo nella membrana influenzerà l'interpretazione della topologia membrana. Ad esempio, se un fluoroforo erano orientati con i suoi dipoli di transizione perpendicolare al piano di membrana (anziché parallelo, o quasi parallelo, come è il caso con DII o DID), poi regioni di membrana non planari saranno più facilmente evidenziata dalla S anziché l'emissione P.

Abbiamo anche descritto le tecniche per l'isolamento e l'elettroporazione di cellule cromaffini surrenali bovine. La cella cromaffine bovina è un ottimo smodello ecretory. Ha il vantaggio di essere facile da mantenere in coltura, sensibile ad una varietà di secretogogues, e possedendo grandi vescicole secretorie che sono prontamente visualizzabili alla microscopia ottica convenzionale. Per esprimere proteine ​​fluorescenti, le cellule sono elettroporati in sospensione prima di placcatura sulla cultura piatti collagene trattati. Nella nostra esperienza, efficienza espressione è molto più alto con elettroporazione che sia con Ca ^{2 +-fosfato} o reagenti lipofectamina. Lo svantaggio di elettroporazione è che richiede più celle (come molti non sopravvivere al processo) e reagenti commerciali costosi. Per ragioni che non sono chiare per noi, non ogni membrana incorpora DID. Inoltre, solo una frazione delle cellule sul piatto vengono transfettate. Trovare cellule che sono transfettate E sono macchiati bene con Lo può richiedere molto tempo, che è il motivo per ottimizzare le condizioni per la colorazione ed elettroporazione è valsa la pena.

In sintesi, unArticolo descrive come pTIRFM viene implementato per monitorare le deformazioni della membrana rapidi e localizzati che si verificano durante la fusione delle vescicole nucleo denso di cellule cromaffini bovine. Anche se una sola applicazione è discusso, la tecnica è ideale per lo studio di altri processi biologici che coinvolgono cambiamenti nella forma di membrana, tra cui l'endocitosi, citochinesi, e la motilità cellulare.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
iXon3 EMMCD Camera	Andor	897
IX81 Inverted Microscope	Olympus		Side-mounted Filtercube Assembly
43 Series Ar-Ion Laser	CVI Milles Griot Laser Optics	543-AP-A01	Tunable to 488nm
Sapphire 561 LP Diode Laser	Coherent		561nm
Scanning Galvo Mirror System	Thorlabs	GVS102
VC3 Channel Focal Perfusion System	ALA Scientific Instruments	ALA VC3X4PP
QMM Quartz MicroManifold	ALA Scientific Instruments	ALA QMM-4
10 PSI Pressure Regulator	ALA Scientific Instruments	ALA PR10
Manipulator	Burleigh	TS 5000-150
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube	Thorlabs	PBS201
Six Station Neutral Density Wheel	Thorlabs	FW1AND
Stepper-motor Driven SmartShutter	Sutter Instruments	IQ25-1219
HQ412lp Dichroic Filter	Chroma	NC255583	Joins 488nm and 561nm beams
Coated Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 100mm VIS 0	Diverges 488nm beam
Coated Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 250mm VIS 0	Diverges 561nm beam
Coated Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 125mm VIS 0	Focuses both beams
Coated Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 50mm VIS 0	Cemented to filter cube assembly
z488/561rpc Dichroic	Chroma	z488/561rpc	Filtercube dichroic
z488/561_TIRF Emission Filter	Chroma	z488/561m_TIRF	Filtercube emission
UIS2 60x Objective	Olympus	UPLSAPO 60XO	NA 1.37
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK 5000
MetaMorph Imaging Software	Molecular Devices
DiI Membrane Dye	Invitrogen	V-22885	For Alignment Purposes
TH Liberase	Roche	5401135001
TL Liberse	Roche	5401020001
DNAse I Type IV from bovine	Sigma	D5025
Hemocytometer	Fisher	0267110
DiD Membrane Dye	Invitrogen	D-7757
Rhodamine	Invitrogen	R634
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit	Millipore	SLGS033SS
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres	Polysciences	19507	0.5 microns
Immersion Oil	Sigma	56822
LabVIEW	National Instruments		Controlls galvo mirrors
Spinner Flask	Bellco	1965-00250