Imagem Plasma Membrane Deformações Com pTIRFM

Resumo

Baseado na polarização Reflexo Interna Total de microscopia de fluorescência (pTIRFM) permite a detecção em tempo real, a dinâmica da membrana da célula. Este artigo descreve a implementação de pTIRFM para o estudo da remodelação da membrana durante a exocitose regulada. A técnica é generalizável a outros processos em biologia celular que direta ou indiretamente envolvem mudanças na forma de membrana.

Resumo

Para ganhar novos insights sobre a dinâmica de exocitose, o nosso grupo se concentra sobre as mudanças na forma de bicamada lipídica que devem ser precisamente regulados durante a fusão das membranas das vesículas e plasma. Essas mudanças rápidas e localizadas são alcançados por meio de interações dinâmicas entre lipídios e proteínas especializadas que controlam a curvatura da membrana. A ausência de tais interações não só teria conseqüências devastadoras para a fusão da vesícula, mas uma série de outras funções celulares que envolvem o controle da forma de membrana. Nos últimos anos, a identidade de um certo número de proteínas com propriedades de formação de membrana foi determinada. O que continua faltando é um roteiro de quando, onde e como eles agem como fusão e progresso de liberação de conteúdo.

A nossa compreensão dos eventos moleculares que permitem a remodelação da membrana tem sido historicamente limitada pela falta de métodos analíticos que são sensíveis à curvatura da membrana ou com a resolução temporal de track mudanças rápidas. PTIRFM satisfaz ambos os critérios. Discutimos como pTIRFM é implementado para visualizar e interpretar mudanças rápidas e submicrométricas na orientação das membranas das células cromafins durante denso núcleo vesícula (DCV) fusão. As células cromafins que usamos são isolados a partir de glândulas supra-renais de bovinos. A membrana é marcadas com um corante de carbocianina lipofílico, 1,1 '-dioctadecilo-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-clorobenzenosulfonato, ou fez. DiD intercala no plano da membrana com uma orientação "fixo" e, portanto, é sensível à polarização do campo evanescente. A membrana celular fez-marcadas, seja sequencialmente animado com polarizações ortogonais de um laser de 561 nm (p-pol, s-pol). Um laser de 488 nm, é usado para visualizar os componentes de vesícula e tempo do momento de fusão. A exocitose é desencadeada por localmente perfusing células com uma solução de KCl despolarizante. A análise é realizada off-line utilizando software escrito sob medida para entender como é quemudanças de intensidade de emissões relacionadas com a fusão dos poros dilatação.

Introdução

A execução adequada de exocitose requer mudanças radicais na forma de bicamada de membrana para ser precisamente orquestrada. Antes da fusão, dobra local da membrana do plasma sob o grânulo ocorre, em parte para reduzir a barreira de energia para a interacção de bicamadas. Mais tarde, como membranas de fusão, as áreas de elevado grau de curvatura são geradas e devem ser estabilizados. Finalmente, as membranas fundidas devem ser dobradas para fora de sua forma inicial para expandir o poro de fusão e permitir liberação de conteúdo ^1. Porque as membranas por si só não são susceptíveis de sofrer tais mudanças dramáticas e coordenadas, as proteínas são necessárias para mediar eventos. Mas como eles agem para influenciar mudanças na topologia da membrana durante o processo de fusão continua muito uma questão em aberto.

Excelente em modelos in vitro, existe a visualizar a curvatura da membrana. O uso do EM negativo mancha, por exemplo, tem sido importante para moldar modelos moleculares atuais para as ações de dois grandes tráfico proteins - sinaptotagmina e dynamin (para revisões, ver Chapman ² e Henshaw ^3). A maioria dos ensaios em tempo real de exocitose não detectam curvatura diretamente. Em vez disso, a curvatura é inferida a partir de ensaios que informam sobre a cinética da libertação da carga de lúmen ^4-8 ou mudanças na área de membrana ^9-11. PTIRFM preenche a lacuna entre in vivo e in vitro, permitindo, medições diretas em tempo real das mudanças na micromorfologia membrana.

PTIRFM, em um modo nonimaging, foi iniciada por Axelrod e colegas para medir a orientação do NPD-PE incorporados dentro de um modelo de membrana ^12. A técnica foi então aplicado a visualizar as alterações dinâmicas em células vivas marcadas com DII e FM1-43 ^13-18. Em pTIRFM, duas polarizações campo evanescente são utilizados para excitar sequencialmente uma sonda incorporado à membrana: p-polarização (no plano de incidência) e s-polarização (perpendicular ao plano de incidência). Antes da imagiologia, a sonda - neste caso, fez - se rapidamente adicionados ao meio extracelular, e é permitido intercala nas membranas plasmáticas das células a serem estudadas. Nas regiões onde a membrana não é paralelo à lamela (como em um plissado membrana ou recuo), o fez também será não paralela. Portanto, tais regiões estarão excitável pelo feixe de p-pol. O feixe de p-pol será menos eficaz excitar fez em regiões da membrana que são na sua maioria paralelas à lamela. Imagens rácio pixel a pixel (P / S) relatórios sobre a emissão de seqüencial de excitação e p-s-pol de fez, portanto, destacar especificamente as regiões de deformação da membrana. Em teoria, as imagens relação P / S são sensíveis a pequenos ângulos de desvio da membrana plasmática da lamela, com a amplitude das mudanças previstas por simulações de computador ^18. Imagens P / S são também independentes da distância a partir da superfície do fluoróforo e lamela fluoróforo locaisconcentração. Concentração de fluoróforo local em vez disso é fornecido por meio de imagens de relatórios sobre a soma de pixel-a-pixel da emissão P e duas vezes a emissão S (P 2 S). A medição P 2 S é sensível à geometria precisa da reentrância, com algumas, pouca, ou nenhuma alteração possível. Isto pode ser demonstrado por meio de simulações de computador que modelo transições de um poro de fusão a partir de um início (ou seja, com um gargalo estreito) para um estado mais tarde ^16,18. A P 2 S de uma vesícula fundido ligado à membrana do plasma através de um pescoço estreito (e com mais fez nas proximidades da interface) está previsto para ser maior, por exemplo, do que a de uma vesícula fundida com uma poro muito mais larga (onde a Será que está dentro da parte mais fraca do campo evanescente).

Neste artigo, discutimos como pTIRFM é implementada e utilizada para estudar as mudanças rápidas, localizadas em forma de membrana que ocorrem durante a fusão dos poros dilatação. Embora apenas uma aplicação é explicitamente discussed, os métodos podem ser estendidos para uma variedade de outros processos biológicos das células que directa ou indirectamente envolvem a remodelação da membrana.

Protocolo

1. Configuração do Sistema PTIRF

A técnica pTIRFM é construído sobre uma plataforma de microscópio invertido. Os feixes de laser são dirigidos por meio de uma porta de iluminação lateral e um cubo de filtro voltado para o lado nonpolarizing, e depois concentraram-se no plano focal posterior de uma objectiva 60X 1,49 NA TIRF. Duas lentes adicionais (1,6 x e 2x) no caminho de emissão entre o microscópio e camera EMCCD dar um tamanho final do pixel de cerca de 80 nm. Feixes de laser são guiados através de software controlado espelhos galvanômetro para comutação rápida entre reflexão interna epi-e total (TIR) ​​de iluminação. O protocolo descrito abaixo assume que a óptica para TIRF já estão posicionados sobre a mesa de ar nas posições ideais para excitação fluoróforo e de imagem. Ele descreve como a óptica de polarização são adicionados a um microscópio TIRF configuração existente para permitir a imagiologia de deformações da membrana celular. Um esquema de óptica set-up do nosso laboratório para gerar tanto TIR e polarizatTIR base de iões é apresentado na Figura 1A. O protocolo assume a utilização de um laser de 488 nm para a excitação das vesículas de proteínas fluorescentes e um laser de 561 nm, para a formação de imagens do corante de carbocianina, fez.

1. Ligue todos os componentes do microscópio, lasers e computadores.
2. Dirigir um feixe de laser de 488 nm para o plano focal traseiro (BFP) da lente de 1,49 NA, tal como ilustrado na Figura 1A. Se o feixe de raios laser é focado sobre o PBF, que vai emergir colimada e aparecem como pequenas local bem definido no tecto directamente acima do objectivo.
3. Ajustar o espelho galvanómetro X (o espelho situado no plano de amostra equivalente) de modo que o feixe de laser é movido para fora do eixo e emerge do objectivo em ângulos progressivamente mais acentuada para o objectivo normais.
4. Em seguida, verifique se TIR seja alcançado. Adicionar 10 ul de microesferas fluorescentes para um volume de 1 ml do PSS em um prato de fundo de vidro. Apenas a fluorescência a partir de microesferas na parte inferior of o prato, mais próximo da interface de TIR, deve ser detectada. Detecção de microesferas flutuantes indica que o ângulo entre a luz incidente e normal objectivo é insuficiente.
   
   A seção abaixo descreve a configuração dos componentes ópticos necessários para geração de imagens baseado na polarização.
5. Utilizando o feixe de 488 nm, alinhado como um guia, ajustar a posição do feixe de laser em bruto 561 nm, de modo que se desloca ao longo de um percurso óptico idêntico. O laser de 561 nm será usado para geração de imagens do corante de carbocianina, fez.
6. Inserir uma lente divergente e espelhos jusante do laser de 561 nm. Usando os espelhos, ajustar o feixe de modo que ele é coaligned com o feixe de 488 nm e o ponto está no foco do tecto quando os espelhos galvanométricos estão na posição "0".
7. Centralize uma placa de quarto de onda (QW) no caminho do feixe imediatamente a jusante da abertura do laser. Use uma QW que seja acromático ou sintonizado o comprimento de onda de excitação.Um QW irá circular polarizar qualquer luz polarizada linearmente, que entra com um ângulo de 45 ° com o eixo óptico. Alguns componentes ópticos, tais como os cubos de polarização, tem um viés atenuação em relação a um eixo de polarização. O QW pode ser rodado para compensar esta polarização. Este ajuste irá resultar em um feixe elipticamente polarizada. Um QW é necessário porque o próprio feixe de laser é altamente polarizada linearmente (verticalmente) à medida que emerge a partir da abertura.
8. Coloque um cubo de polarização (PC1) a jusante do feixe polarizado elipticamente. O cubo de polarização reflecte o componente vertical (y) do campo eléctrico e passa a componente horizontal (x). O cubo de polarização é colocado sobre um pequeno palco traduzindo para facilitar o alinhamento subsequente dos caminhos do feixe de polarização.
9. Use um segundo cubo polarizador (PC2) e espelhos (Figura 1A) para recombinar os feixes.
10. Coloque um obturador entre o primeiro cubo de polarização (PC1) e o co verticaisespelho mponent. Coloque um segundo obturador entre o espelho componente horizontal e segundo cubo polarização (PC2). Estes obturadores são controlados pelo software de imagem que permite ao usuário selecionar rapidamente entre as polarizações de feixe.
11. Use um filtro polarizador para verificar a orientação do campo elétrico em cada caminho do feixe. Um filtro de polarização apenas irá permitir a transmissão em linha com o eixo do filtro.
12. Verificar se as componentes vertical e horizontal do feixe de laser são alinhados uns com os outros e o feixe de 488 nm. Faça os ajustes necessários. As três vigas devem ser todos focados no BFP e emergir colimado do objetivo para o mesmo ponto no teto. Este ponto pode ser assinalado por um X para facilitar o alinhamento futuro.
13. Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o objetivo. Coloque o prato contendo microesferas fluorescentes (veja o passo 4 acima) sobre o objectivo.
14. Digite TIR movendo o espelho X galvanômetro. Em TIR, o componen verticaist do feixe é a s-pol e o componente horizontal do feixe é agora o p-pol. Ajustar a intensidade relativa entre as vigas, rodando a placa QW. Ver cada campo evanescente polarizado com uma amostra de rodamina, o qual está previsto para ser orientada aleatoriamente. Gire a placa QW para coincidir com as intensidades médias de pixel. Se necessário, adicione um filtro de densidade neutra em um caminho do feixe polarizado para atenuar sua intensidade.

2. Isolamento celular Cromafim

Um procedimento para o isolamento de células cromafins saudáveis ​​a partir da glândula supra-renal de vitelo é fornecida abaixo. Adapta-se a partir de protocolos publicados anteriormente por Wick, Senter et ai. ¹⁹ e O'Connor, Mahata et al. ²⁰ Após o isolamento, as células foram electroporadas com o plasmídeo (s) de interesse, utilizando um sistema de electroporação. Este sistema resulta em 20-30% de células que expressam as proteínas fluorescentes desejados. Normalmente, 70% das células sobrevivem os eleitosprocesso roporation. Os detalhes dos componentes PSS e de mídia são fornecidos nas Tabelas 2, 3 e 4.

1. Dois dias antes da preparação celular, o tratamento de 35 mm de fundo de vidro de qualidade óptica (0,17 mm de espessura) pratos com 1 ml de poli-D-lisina (0,1 mg / ml), seguido por 1,25 ml de colagénio bovino. Deixar pratos ar seco tecido cultura capô.
2. Obter glândulas adrenais bovinas do matadouro. Mantenha as glândulas no gelo, enquanto eles são transportados para o laboratório. As glândulas supra-renais de bovinos pode ser envolto em uma espessa camada de gordura. Use uma tesoura cirúrgica para remover o excesso de gordura e expor a abertura veia adrenal. Perfundir a veia com prep-PSS repetidamente até que a glândula é removida do sangue.
3. Em seguida, pipeta-se lentamente 2 mL de solução de TH-PSS para dentro da abertura da veia, até a glândula incha. Incubar as glândulas inflados a 37 ° C durante 15 min. Repetir o tratamento TH-PSS e incubar novamente.
4. Corte através do córtex adrenal exterior em torno da borda da glândula com scissors e descascar a glândula além de expor a medula. Usar um bisturi para raspar suavemente e separar a medula do tecido cortical.
5. Picar o medula com um par de lâminas de bisturi de 5-10 min.
6. Um passo final de digestão é necessário para isolar as células cromafins individuais. Despeje a suspensão de células picadas em um balão de agitação. Encher parcialmente o recipiente com uma proporção de 2:1 de TH-PSS (30 ml) para TL-PSS (15 ml) e incubar durante 30 min a 37 ° C enquanto gira a aproximadamente 100 rpm.
7. Separam-se as células cromafins individuais de tecido não digerido por filtração através de uma malha de 400 mM. Recolhe-se o filtrado. Centrifugar a 200 xg para sedimentar as células e ressuspender em gelo PSS frio.
8. Filtrar as células através de uma malha de 250 um, pelete, e finalmente ressuspender em tampão de electroporação (ver passo 2.9).
9. Contagem de células utilizando um hemocitómetro, e preparar-se para a transfecção.
10. Transfectar células com o sistema de acordo com a electroporaçãoas recomendações do fabricante. As condições precisas para eletroporação deve ser determinada empiricamente. Nota: Os ajustes que proporcionam o melhor equilíbrio entre a eficiência de transfecção e taxa de sobrevivência celular para esta preparação de células bovinas cromafins são 1.100 V, 40 ms, e um pulso. Nós estimamos que, com estas condições, 20-30% das células são transfectadas. Cerca de 30% das células não sobrevivem ao processo de electroporação.
11. Células da placa suavemente sobre poli-D-lisina e colagénio tratado pratos em 1 ml de meio electroporating aquecidos.
12. Coloque pratos numa incubadora a 37 ° C (5% CO _2). Adicionar 1 ml de meio antibiótico 2x a cada placa, após 6 h. Troque a mídia por meios normais no dia seguinte.
13. As células de cromafina são tipicamente trabalhada de 2-5 dias após a electroporação.

3. pTIRF Aquisição de Imagem

1. Ligue o sistema de imagem e iniciar o software de aquisição.
2. Verificar que os lasers estão alinhados. Verifique evanescenteperfil de campo utilizando microesferas.
3. Prepare o sistema de perfusão global e local. Reservatórios solução limpa com filtrada deionizada H ₂ O e preencher com basal e estimulando soluções PSS.
4. Antes de imagiologia células cromafins, verificar que os p-pol e s-pol excitações iluminar a mesma região do campo de visão e as intensidades de iluminação são mais ou menos equivalentes. Para fazer isso, encher um prato com fundo de vidro com 2 ml de PSS contendo rodamina com uma concentração final de 10 mM. Sequencialmente excitar a amostra rhodamine com p-pol e luz s-pol e capturar as imagens. Na prática, as emissões de P e S de DID são normalizados ao valor médio de P e S emissões de rodamina. Consulte as seções análise de imagem e de discussão para mais detalhes.
5. Agora vá para coloração de células cromafins bovinas com fez. Enxágüe meios de cultura do prato contendo as células cromafins e substituir com 2 ml de basal-PSS. Adicionar 10 ul de 10 mM de DID (diluída em etanol)directamente para a placa contendo as células. Agite suavemente prato para 2-10 segundos e remover a solução fiz + PSS.
6. Lave o prato 3-4x com basal-PSS para remover qualquer resíduo fez. As células são agora corado e pronto para utilizar.
7. Adicionar uma gota de óleo de imersão para o objectivo. Coloque prato contendo células cromafins fez corados em cima do objetivo.
8. Visualizando o prato seja através da objectiva ou da câmara, encontrar uma célula que é transfectadas com a proteína de interesse e corados com fez. Uma célula bem coradas apresenta uma emissão P nitidamente que realça os bordos da célula; a emissão de S deverá ser aproximadamente uniforme ao longo da pegada da célula (isto é, a região da célula que está aderente ao vidro e fotografada em TIRF).
9. Posicionar a agulha de perfusão local de modo que seja mais ou menos 100 mm de distância a partir da célula.
10. Concentre-se na membrana celular e ativar o hardware autofocus imediatamente antes da aquisição estimulação das células / imagem.
11. Comece a aquisição de imagem. Perfundir células durante 10 segundos com uma solução de base e, em seguida, durante 60 segundos com uma solução despolarizante, 56 mM de KCl. Adquirir imagens enquanto rapidamente cofragem entre 561 nm p-pol, 561 nm s-pol (para monitorar as mudanças em P e S emissão de DID) e 488 nm de excitação (para a imagem da sonda vesícula transfectadas). Os exemplos de imagens obtidas durante as experiências são mostrados na Figura 2 e Figura 3.

4. Análise de Imagem

Cálculos para processamento de imagem pode ser realizada com ImageJ, mas utilizando scripts em uma linguagem de programação flexível, como IDL ou Matlab pode aumentar significativamente a análise de transferência, automatizando a tarefa. Dois tipos de imagens devem ser calculados para obter informações topológico a partir de imagens de emissão matérias -. O P / S e P 2 S P / S informa sobre deformações de membrana locais, enquanto o S +2 P soma relatórios sobre a tintura total de membrana em uma determinada regiãodo campo.

1. Todas as imagens devem ser fundo subtraído. Escolha um ROI off-celular, medir a intensidade média dos pixels na ROI e subtraindo esse valor de todos os pixels da pilha de imagens.
2. Para calcular P / S, dividir cada "P" frame emissão pela moldura posterior "S" de emissões (pixel a pixel). P / S varia de acordo com as intensidades relativas dos p-e s-pol excitações, desvios na sistema óptico, e franjas de interferência. Para reduzir estes efeitos, normalizar as relações de P / S obtidos a partir de emissão fez com o índice obtido com uma solução contendo 10 mM rhodamine ^18.
3. Exocitose de DCV são individuais é evidente a partir de uma mudança brusca na intensidade de uma proteína fluorescente vesícula, tais como sinaptotagmina-1 pHluorin (Figura 2B). Determine mudanças em P / S e P 2 S pela média dos pixels em um raio de 240 nm ROI centrado sobre aumentos localizados na P / Sproporção em locais de exocitose. Quando a fusão ocorra sem um aumento evidente no P / S, o ROI é centrado sobre a região de fusão da DCV.
4. As simulações de computador pode ser realizada para interpretar P / S e P 2 S mudanças de intensidade de membrana em termos de geometrias simples de um poro de fusão de dilatação. Para mais informações sobre as simulações, consulte Anantharam et al. ¹⁸

Resultados

Técnicas de imagem TIRFM convencionais e polarizadas são implementados na mesma mesa de ar. A configuração dos elementos ópticos é semelhante, com a principal diferença de que a luz de excitação está polarizada (Figura 1A). A luz polarizada preferencialmente excita fluoróforos com dipolos de absorção na direção de polarização. Assim, para pTIRFM ser eficaz no acompanhamento membrana mudanças topológicas, a sonda que é usada tem de se intercalar na membrana com uma orientação fixa. Os corantes de carbocianina fluorescentes (DII, fez) intercalar em bicamadas lipídicas de forma orientada com dipolos de transição no plano da membrana (Figura 1B). Iluminação polarizada-P (Figura 1C) das membranas fez-rotulados excita seletivamente fluorophores lamela oblíqua (vermelho nas Figuras 1B e 1D).

Rotulagem membrana exuberante de células cromafins é alcançada após abincubação com rief fez Figura 2A. mostra um exemplo de uma membrana celular que é corado bem. A, células aderentes saudável irá apresentar diferenças distintas nas emissões de P e S. A imagem mostra uma emissão P fronteira celular mais brilhante em relação ao resto da célula. A imagem de emissão S mostra fluorescência aproximadamente uniforme em toda a pegada de celular. Calculado de pixel-a-pixel P / S e P 2 S imagens são sensíveis à curvatura da membrana e a concentração de corante, respectivamente. A célula cromafina mostrado também foi transfectada com sinaptotagmina-1 pHluorin (Syt-1) para rotular vesículas secretoras (Figura 2B).

A célula cromafina são estimuladas com KCl 56 mM para despolarizar a membrana da célula e desencadear a exocitose. Um número de pontos brilhantemente fluorescentes Syt-1 pHluorin de repente se tornam evidentes como as DCV são fusível (Figura 2B, painel direito). Uma caixa branca é desenhada em torno de um evento de fusão (Figura 2B, painel direito). Este evento i fusãos analisados ​​nas Figuras 2C e 2D. Figura 2C mostra quadro a quadro mudanças na Syt-1-pHluorin, P / S, e P 2 imagem S intensidades. A intensidade de fluorescência de Syt-1 diminui rapidamente como a proteína se difunde para longe do local de fusão (Figura 2D). O recuo que representa o complexo da membrana da vesícula / plasma fundido diminui a uma velocidade relativamente lenta (Nota gráficos na Figura 2D). A ilustração (Figura 2E) mostra uma interpretação dessas medidas.

As deformações de membrana rápidas e localizadas mostrados na Figura 2 é um resultado de evocado-estímulo influxo de ^{Ca2 +.} Isto é mostrado na Figura 3A. Uma célula cromafina é transfectada com a genética de Ca ^{2 +} indicador GCaMP5G ^21,22 e estimuladas com KCl 56 mM. Membrana despolarização provoca um aumento significativo na fluorescência GCaMP5G ( ng> As Figuras 3A e 3B), significando um aumento subplasmalemmal de Ca ^{2 +.} Uma região de 30 x 20 pixels da célula seleccionada e quadro-por-quadro mudanças na GCaMP5G, P / S e P 2 S intensidades de pixel são mostrados nas imagens (Figura 3B) e os gráficos (Figura 3C). Time "0" designa o quadro antes de uma mudança de P / S é evidente (ou seja, o quadro antes de exocitose). As setas brancas indicam que a deformação da membrana (aumento de P / S) é acompanhada por uma redução na emissão de P 2 S. Proteína GCaMP5G citosólica é excluído área pelo DCV fundida. Note-se também a diminuição repentina na GCaMP5G intensidade no tempo 0 na Figura 3C, o painel esquerdo. O aumento de longa duração em P / S e diminuição de P 2 S sugerir um poro de fusão que dilata lentamente (Figura 3D).

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Figura 1. Ilustrações para a técnica pTIRFM. A) Um esquema de combinação convencional com baseado na polarização TIRF de imagem é mostrado. Um quarto de onda (QW) placa é colocada na frente de uma safira do laser 561-nm para polarizar elipticamente o feixe de laser. Um cubo polarizador (PC1) é usado para separar as polarizações em componentes lineares verticais (V) e horizontal (H). As componentes vertical e horizontal tornam-se os p-pol e feixes de excitação s-pol, respectivamente, na superfície de TIR. Os caminhos p-pol e s-Pol estão fechadas de forma independente (S1 e S2). Eles são recombinados com espelhos e um segundo cubo polarizador (PC2). Juntam-se ao feixe de 488 nm (também fechou de forma independente, S3) por meio de um elemento da direcção do feixe consistindo de um espelho e nonpolarizing espelho dicróico (DC). As lentes (L) são utilizadas para expandir e concentrar as vigas. Combinado 488 nm e 561 nm vigas são dirigidos a uma porta lateral iluminação do microscópio via Galvanoespelhos metros (GM). Eles se concentram ao plano focal posterior (BFP) do objetivo. Rotulagem fotões emitidos a partir de fluoróforos são captadas com uma câmara EMCCD ligado a um PC. B) DiD é realizado através da incubação de células brevemente com o corante e lavar repetidamente para remover o excesso. DiD intercala na membrana com momentos de dipolo transição aproximadamente no plano da membrana. C) A luz incidente polarizado no plano de incidência (p-pol) cria um campo evanescente que é predominantemente polarizado normal, para a interface, como mostrado. D) Iluminação de uma membrana fez marcado com-p luz polarizada vai excitar seletivamente aqueles fluoróforos que são lamela oblíqua (RED). Se este fosse um campo evanescente polarizada s, esses fluoróforos que são paralelas à lamela que ser excitados em vez (PRETO).

Figura 2. trong> celulares Monitoramento deformações de membrana com pTIRFM. A) Raw P e S imagens de emissões calculado juntamente com P / S e P 2 imagens de emissão S são mostrados. Barra de escala, 3,2 mM. B) Uma célula chromaffin expressar Syt-1 pHluorin é despolarizada com KCl. Um número de manchas fluorescentes luminosos (painel direito) indicam a fusão de DCV são individuais. Barra de escala, 3,2 mM. C) imagens quadro a quadro de uma fusão Syt-1 pHluorin DCV. Times (acima imagens) estão em segundos. Tempo 0 designa quadro antes da fusão da DCV. Correspondente P / S e P 2 S imagens de emissões também são mostrados. . Barra de escala é 1 mícron D) Gráficos para imagens em linha C. pontilhada é no tempo 0 -. Quadro fusão E) Uma possível interpretação dos resultados em C e D é mostrado. blank "> Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Deformações são um resultado do estímulo evocados influxo de ^{Ca2 +.} A) Uma célula chromaffin transfectadas com GCaMP5G é despolarizada com KCl 56 mM. O aumento resultante em GCaMP5G fluorescência significa um aumento na subplasmalemmal Ca ^{2 +} níveis. B) imagens quadro-a-quadro de 30 x 20 pixels área de célula A. vezes acima as imagens são em segundos. Setas brancas indicam uma região de P / S aumento e diminuição P 2 S. Proteína citosólica GCaMP5G é excluído da região pela DCV fusão. Barra de escala, 1 mícron. C) Os gráficos de imagens mostradas em B. D) Uma possível interpretação dos resultados em B e C é mostrado.3highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

iXon3 EMMCD Camera	Andor	897
IX81 Microscópio invertido	Olimpo		Montado na lateral Assembléia Filtercube
Laser Série 43 Ar-Ion	CVI Milles Griot Laser Optics	543-AP-A01	Ajustável para 488 nm
Safira 561 LP Diode Laser	Coerente		561 nm
Digitalizando Galvo Espelho Sistema	Thorlabs	GVS102
VC 3 Channel Focal Perfusão Sistema	ALA Scientific Instruments	ALA VC3X4PP
QMM Quartz MicroManifold	ALA Scientific Instruments	ALA QMM-4
Regulador de pressão de 10 psi	ALA Scientific Instruments	ALA PR10
Manipulador	Burleigh	TS 5000-150
Montada Achromatic Placa Quarter-Wave	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680 nm Polarização Refletor Cube	Thorlabs	PBS201
Seis Estação Roda Densidade Neutra	Thorlabs	FW1AND
Stepper motor Impulsionada SmartShutter	Instrumentos Sutter	IQ25-1219
Filtro HQ412lp dicróica	Chroma	NC255583	Junta-se 488 nm e 561 nm vigas
Revestido Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 100 milímetros VIS 0	Diverge 488 nm feixe
Revestido Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 250 milímetros VIS 0	Diverge 561 nm feixe
Revestido Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 125 milímetros VIS 0	Concentra-se ambos os feixes
Revestido Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 50 milímetros VIS 0	Cimentada para filtrar montagem cubo
z488/561rpc dicróica	Chroma	z488/561rpc	Filtercube dicróica
Filtro z488/561_TIRF Emission	Chroma	z488/561m_TIRF	Emissão Filtercube
UIS2 60X Objective	Olimpo	UPLSAPO 60XO	NA 1,37
Neon transfecção Sistema	Invitrogen	MPK 5000
MetaMorph Software Imaging	Molecular Devices
DII Membrane Dye	Invitrogen	V-22885	Para o alinhamento Fins
TH Liberase	Roche	5401135001
TL Liberse	Roche	5401020001
DNAse I Tipo IV de bovinos	Sigma	D5025
Hemocitômetro	Pescador	0267110
DiD Membrane Dye	Invitrogen	D-7757
Rhodamine	Invitrogen	R634
Unidade de Filtro de 0,22 de membrana Seringa	Millipore	SLGS033SS
Fluoresbrite policromático Microesferas vermelhos	Polysciences	19507	0,5 mM
Óleo de Imersão	Sigma	56822
LabVIEW	National Instruments		Controles galvo espelhos
Spinner Flask	Bélico	1965-00250

Tabela 1. Equipamento pTIRF Microscopia.

Conteúdo	Prep-PSS	Basal-PSS	Stim-PSS
NaCl	145 mM	145 mM	95 mM
KCl	5,6 mM	5,6 mM	56 mM
MgCl2	-	0,5 mM	0,5 mM
CaCl2	-	2,2 mM	5 mM
HEPES	15 mM	15 mM	15 mM
pH	7.4	7.4	7.4
Glicose	2,8 mM	5,6 mM	5,6 mM
Pen-Strep	1x	-	-

Tabela 2. Perfusão e soluções de preparação de células cromafins.

Conteúdo	Electroporating Mídia	Normal chapeamento de mídia	2x antibiótico Mídia
1x DMEM/F-12	1 ml / placa	2 ml / prato	1 ml / placa
FBS	10%	10%	10%
Cytosine arabinofuranoside (CAF)	-	1 ul / ml de 10 mM da	-
Penicilina	-	100 unidades / ml	200 unidades / ml
Estreptomicina	-	100 ug / ml	200 ug / ml
Gentamycin	-	25 ng / mL	50 ng / mL

Tabela 3. Mídia celular Cromafim.

Conteúdo	TH-PSS	TL-PSS
Liberase TH	2 ml	-
Liberase TL	-	0,85 ml
Prep-PSS	98,0 ml	84,0 ml
DNase	8,75 mg	7,4 mg

Tabela 4. TH-PSS e TL-PSS Soluções.

Discussão

TIRFM baseado na polarização detecta alterações rápidas e submicroscópicas na topologia da membrana. Implementar a técnica é relativamente simples, especialmente se TIRF ótica já estão em vigor. Tudo o que é necessário é uma placa de quarto de onda, dois cubos de polarização, e persianas para separar p-pol e iluminação s-pol caminhos. A posição precisa destes componentes na tabela é geralmente ditado pelo espaço disponível.

A fim de obter informação topológica de membrana, a sonda fluorescente utilizado deve intercala com uma orientação fixa, ou conhecido. A técnica, tal como descrito neste artigo, pressupõe o uso de corantes de carbocianina mas outros corantes, tais como FM1-43 ^14, pode também ser usado. O próprio procedimento de coloração membrana é simples. Células cultivadas exigem apenas uma breve exposição (menos de 10 segundos) a uma pequena quantidade de DII / fez para obter a rotulagem exuberante da membrana. Adicionando o excesso de corante leva à dispersão de luz AGGREGates no vidro que diminuem a qualidade de imagem. Over-incubação de células com corante leva a tingir interiorização que tem efeitos prejudiciais sobre a qualidade da imagem e, possivelmente, a viabilidade celular. Se uma célula é bem coradas, haverá distinção clara nas imagens de emissão de P e S. Como mostrado na Figura 2A, a emissão de P será nitidamente destacar as áreas da membrana que são oblíqua lamela (isto é, as bordas da pegada da célula), enquanto que a intensidade da emissão S será de aproximadamente uniforme ao longo da pegada da célula. Se uma distinção clara entre P e S não é aparente, então é possível que a célula é fracamente aderidas ao substrato ou a membrana celular não é saudável, e a célula não é usada para as experiências.

Nossos estudos anteriores que descrevem pTIRFM utilizado DII como a sonda de membrana fluorescente. Aqui, utilizamos o fez porque ele é adequado para experimentos com imagens de duas cores que empregam GFP / pHluorin como o outro fluoróforo. Nós excitar fez with um laser de 561 nm, em vez de 640 a laser nm (o que está mais perto de seu pico de excitação), porque os alvejantes fluoróforo mais rapidamente em 640 nm. Apesar do facto de que o laser de 561 nm é a cauda de DID do espectro de excitação publicada, a fluorescência emitida de forma eficiente. Outra vantagem do laser nm 561 é que ela excita tanto Dii e fiz o que nos permite usar a mesma configuração de polarização para ambas as sondas. Note-se que a orientação do fluoróforo na membrana irá afectar a interpretação de topologia de membrana. Por exemplo, se um fluoróforo foram orientadas com os seus dipolos transição perpendicular ao plano da membrana (em vez de em paralelo, ou aproximadamente paralelo, como é o caso com DII ou fiz), então as regiões não planares da membrana será mais facilmente destacada pelo S em vez a emissão de P.

Também foram descritas técnicas para o isolamento e a electroporação de células cromafins supra-renais de origem bovina. A célula chromaffin bovina é um excelente secretory modelo. Tem a vantagem de ser fácil de manter em cultura, em resposta a uma variedade de secretagogos, e possuindo grandes vesículas secretoras que podem ser facilmente visualizadas por microscopia de luz convencional. Para expressar as proteínas fluorescentes, as células são electroporados na suspensão antes do plaqueamento em placas de cultura tratadas com colagénio. Na nossa experiência, a eficiência de expressão é muito mais elevado do que com a electroporação tanto com Ca ^{2 +-fosfato} ou reagentes LipofectAMINE. A desvantagem de electroporação é que ele requer mais células (como muitos não sobrevivem ao processo) e reagentes comerciais caros. Por razões que não são claras para nós, nem todos os membrana incorpora fez. Além disso, apenas uma fracção das células sobre o prato são transfectadas. Encontrar células que são transfectadas e estão manchados bem com DID pode ser demorado e é por isso otimizando as condições para coloração e eletroporação vale bem a pena o esforço.

Em resumo, este umArtigo descreve como pTIRFM é implementado para monitorar as deformações de membrana rápidas e localizadas que ocorrem durante a fusão de vesículas de núcleo denso em células cromafins bovina. Embora uma única aplicação é discutida, a técnica é ideal para o estudo de outros processos biológicos que envolvem alterações em forma de membrana, incluindo endocitose, a citocinese e a motilidade celular.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
iXon3 EMMCD Camera	Andor	897
IX81 Inverted Microscope	Olympus		Side-mounted Filtercube Assembly
43 Series Ar-Ion Laser	CVI Milles Griot Laser Optics	543-AP-A01	Tunable to 488nm
Sapphire 561 LP Diode Laser	Coherent		561nm
Scanning Galvo Mirror System	Thorlabs	GVS102
VC3 Channel Focal Perfusion System	ALA Scientific Instruments	ALA VC3X4PP
QMM Quartz MicroManifold	ALA Scientific Instruments	ALA QMM-4
10 PSI Pressure Regulator	ALA Scientific Instruments	ALA PR10
Manipulator	Burleigh	TS 5000-150
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube	Thorlabs	PBS201
Six Station Neutral Density Wheel	Thorlabs	FW1AND
Stepper-motor Driven SmartShutter	Sutter Instruments	IQ25-1219
HQ412lp Dichroic Filter	Chroma	NC255583	Joins 488nm and 561nm beams
Coated Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 100mm VIS 0	Diverges 488nm beam
Coated Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 250mm VIS 0	Diverges 561nm beam
Coated Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 125mm VIS 0	Focuses both beams
Coated Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 50mm VIS 0	Cemented to filter cube assembly
z488/561rpc Dichroic	Chroma	z488/561rpc	Filtercube dichroic
z488/561_TIRF Emission Filter	Chroma	z488/561m_TIRF	Filtercube emission
UIS2 60x Objective	Olympus	UPLSAPO 60XO	NA 1.37
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK 5000
MetaMorph Imaging Software	Molecular Devices
DiI Membrane Dye	Invitrogen	V-22885	For Alignment Purposes
TH Liberase	Roche	5401135001
TL Liberse	Roche	5401020001
DNAse I Type IV from bovine	Sigma	D5025
Hemocytometer	Fisher	0267110
DiD Membrane Dye	Invitrogen	D-7757
Rhodamine	Invitrogen	R634
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit	Millipore	SLGS033SS
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres	Polysciences	19507	0.5 microns
Immersion Oil	Sigma	56822
LabVIEW	National Instruments		Controlls galvo mirrors
Spinner Flask	Bellco	1965-00250