Imaging Plasmamembran Verformungen Mit pTIRFM

Zusammenfassung

Polarisation-basierte Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) ermöglicht die Echtzeit-Erkennung von Zellmembrandynamik. Dieser Artikel beschreibt die Umsetzung der pTIRFM für das Studium der Membran Umbau während regulierten Exozytose. Die Technik ist generalisierbar auf andere Prozesse in der Zellbiologie, die Veränderungen in Membranform, die direkt oder indirekt beteiligen.

Zusammenfassung

Um neue Einblicke in die Dynamik der Exozytose zu gewinnen, konzentriert sich unsere Gruppe auf die Veränderungen der Lipiddoppelschicht Form, die gerade in der Verschmelzung von Vesikel und Plasmamembran reguliert werden muss. Diese rasche und lokalisierte Änderungen werden durch dynamische Wechselwirkungen zwischen Lipiden und Proteinen, die spezialisierte Membrankrümmung Steuerung erreicht. Das Fehlen solcher Wechselwirkungen nicht nur verheerende Folgen für die Fusion von Vesikeln, sondern eine Vielzahl von anderen Zellfunktionen, die Steuerung der Membranform beinhalten. In den letzten Jahren hat die Identität einer Anzahl von Proteinen mit Membran-Formgebungseigenschaften bestimmt. Was bleibt, fehlt, ist ein Fahrplan, wann, wo und wie sie als Fusions und Content-Release Fortschritte zu handeln.

Unser Verständnis der molekularen Ereignisse, die Membran zu ermöglichen Umbau ist historisch durch einen Mangel an analytischen Methoden, die empfindlich auf Membrankrümmung sind oder die zeitliche Auflösung auf trac beschränktk schnellen Veränderungen. PTIRFM erfüllt beide Kriterien. Wir diskutieren, wie pTIRFM wird implementiert, um eine schnelle, Submikron Veränderungen in der Ausrichtung der chromaffinen Zellmembranen während dichten Kern Vesikel (DCV)-Fusions visualisieren und zu interpretieren. Die chromaffinen Zellen, die wir verwenden, werden aus Rindernebennieren isoliert. Die Membran ist mit einem lipophilen Carbocyaninfarbstoff, 1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorbenzolsulfonat gefärbt, oder hat. DiD interkaliert in der Membranebene mit einem "festen"-Orientierung und ist daher empfindlich gegenüber der Polarisation des abklingenden Feldes. Die DID-gefärbten Zellmembran nacheinander aufgeregt mit orthogonalen Polarisationen eines 561-nm-Laser (p-pol, s-pol). Ein 488-nm-Laser verwendet, um Bläschen Bestandteile und Zeit visualisieren der Moment der Fusion. Exozytose durch lokal Perfusion Zellen mit einem depolarisierenden KCl-Lösung ausgelöst. Die Analyse erfolgt offline mit speziell geschriebenen Software zu verstehen, wie diD durchgeführtEmissionsintensität Änderungen betreffen Fusionspore Dilatation.

Einleitung

Die ordnungsgemäße Durchführung der Exozytose erfordert extreme Veränderungen in der Membran-Doppelschicht Form präzise orchestriert werden. Vor der Fusion lokale Biegung der Plasmamembran unter dem Granulat tritt teil um die Energiebarriere für die Wechselwirkung von Doppelschichten zu reduzieren. Später, als Membranen fusionieren, Bereiche hoher Krümmung erzeugt und stabilisiert werden müssen. Schließlich muss abgesichert Membranen aus ihrer Ausgangsform gebogen, um die Fusionspore erweitern und ermöglichen Content-Release ¹ werden. Da es unwahrscheinlich ist, solche dramatischen Veränderungen unterziehen und koordinierte Membranen allein, sind Proteine, die erforderlich sind, um Ereignisse zu vermitteln. Aber, wie sie handeln, um Änderungen in der Membrantopologie während des Fusionsprozesses beeinflussen nach wie vor sehr viel offen.

Excellent in-vitro-Modelle existieren, um Membrankrümmung zu visualisieren. Die Verwendung von Negativ-Fleck EM, zum Beispiel, hat sich für die Gestaltung der aktuellen Molekülmodelle für die Handlungen der beiden großen Handel p wichtigroteins - Synaptotagmin und Dynamin (für Übersichten siehe Chapman ² und Henshaw ^3). Die meisten Echtzeit-Assays der Exozytose Krümmung nicht direkt zu erkennen. Stattdessen wird Krümmung von Assays, die auf die Kinetik der Lumenfracht Release ^8.4 oder Änderungen in der Membranfläche ^11.9 berichten abgeleitet. PTIRFM schließt die Lücke zwischen in vivo und in vitro-Studien durch, die direkten Echtzeit-Messungen von Veränderungen in der Membran-Mikromorphologie.

PTIRFM, in einer nicht-abbildenden Modus wurde von Axelrod und Kollegen Pionierarbeit geleistet, um die Ausrichtung der NPD-PE innerhalb einer Modellmembran ¹² eingebaut zu messen. Die Technik wurde dann an den dynamischen Veränderungen in lebenden Zellen mit Dii und FM1-43 ^13-18 beschriftet visualisieren. In pTIRFM werden zwei Evaneszentfeld Polarisationen verwendet werden, um sequentiell erregt eine Membran eingebettete Sonde: p-Polarisation (in der Einfallsebene) und s-Polarisation (senkrecht zur Einfallsebene). Vor der Bilderzeugung, die Sonde - in diesem Fall hat - wird kurz zum extrazellulären Medium zugegeben und kann sich in den Plasmamembranen der Zellen zu unter interkalieren. In Regionen, in denen die Membran nicht parallel zu der Deckglas (wie in einer Membran Rüschen oder Vertiefung), der tat auch nicht parallel sein. Daher werden solche Bereiche erregbar durch die p-pol Strahl sein. Die p-pol Strahl weniger effektiv anregen diD in Membranbereichen, die meist parallel zur Deckglas sind. Pixel-to-Pixel-Verhältnis Bilder (P / S) die Berichterstattung über die Emission von sequentiellen p-und s-pol Anregung der DID wird daher speziell hervorzuheben Regionen der Membranverformung. In der Theorie sind die P / S-Verhältnis lassen sich empfindlich auf kleine Winkel der Plasmamembran Abweichung vom Deckglas, mit der Amplitude der Änderungen durch Computersimulationen vorhergesagt, ^18. P / S lassen sich auch unabhängig von Fluorophor Abstand von der Deckglasoberfläche und lokalen FluorophorKonzentration. Lokale Fluorophorkonzentration anstelle von Bildern Berichterstattung über die Pixel-zu-Pixel-Summe des P-Emission und 2-fachen der S-Emissions (P +2 S) vorgesehen ist. Die P + 2S Messung empfindlich auf die genaue Geometrie der Vertiefung, wobei einige, wenig oder keine Änderung möglich. Dies kann durch Computersimulationen gezeigt werden, dass Modellübergänge einer Fusionspore von einem frühen (dh mit einem schmalen Hals) auf einen späteren Zustand ^16,18. Die P + 2S eines kondensierten Vesikel über einen schmalen Hals an der Plasmamembran gebunden (und mit mehr tat nahe der Grenzfläche) wird vorhergesagt, größer zu sein, als beispielsweise die eines Vesikel fusioniert mit einer viel breiteren Poren (wo die getan hat, ist in der dunkelsten Teil des evaneszenten Feld).

In diesem Artikel besprechen wir, wie pTIRFM implementiert und verwendet, um die schnelle, lokale Veränderungen in der Membranform, die während der Fusionspore Dilatation auftreten studieren. Während nur eine Anwendung ist ausdrücklich discussed sind die Verfahren verallgemeinerbar zu einer Vielzahl von anderen Zell biologischen Prozesse, die direkt oder indirekt mit dem Membran Umbau.

Protokoll

1. PTIRF System-Setup

Die pTIRFM Technik basiert auf einem inversen Mikroskop-Plattform gebaut. Laserstrahlen werden durch eine seitliche Beleuchtung-Port und einen nichtpolarisierender Seite gerichtete Filterwürfel gerichtet und konzentrierte sich dann auf die hintere Brennebene einer 60X NA 1.49 TIRF Ziel. Zwei zusätzliche Linsen (1,6 X und 2X) in der Emissionsbahn zwischen dem Mikroskop und EMCCD Kamera geben eine endgültige Pixelgröße von etwa 80 nm auf. Laserstrahlen werden über Software gesteuert Galvanometerspiegeln für schnelles Umschalten zwischen Epi-und Totalreflexion (TIR) ​​Beleuchtung geführt. Die unten beschriebene Protokoll geht davon aus, dass für die TIRF-Optik sind bereits auf dem Lufttisch in der optimalen Positionen für Fluorophor Anregungs-und Imaging positioniert. Es beschreibt, wie Polarisationsoptik zu einem vorhandenen TIRF-Mikroskop-Set-up zu Bildgebung von Zell-Membran Verformungen ermöglichen aufgenommen. Eine schematische Darstellung unseres Labors optische Aufbau zur Erzeugung sowohl TIR und polarizatIonenbasis TIR ist in 1A gezeigt. Das Protokoll setzt die Verwendung eines 488-nm-Laser zur Anregung der fluoreszierenden Vesikelproteinen und einen 561 nm-Laser für die Abbildung der Carbocyaninfarbstoff tat.

1. Kraftmikroskop auf alle Komponenten, Laser und Computern.
2. Direkt einen Strahl von der 488-nm-Laser zu der hinteren Brennebene (BFP) der 1,49 NA Objektiv, wie in Fig. 1A dargestellt. Wenn der Laserstrahl auf dem BFP konzentriert, wird es entstehen kollimiert und als kleine gut definierten Punkt auf der Decke unmittelbar über dem Ziel.
3. Einstellen der X Galvanometerspiegel (der Spiegel in der Probe äquivalent Ebene liegt), so daß der Laserstrahl außerhalb der Achse bewegt und tritt aus der Objektiv bei zunehmend steileren Winkeln zu der normalen Ziel.
4. Nächstes sicher, dass TIR erreicht. Werden 10 ul fluoreszierenden Mikrokügelchen mit einem Volumen von 1 ml PSS in einem Glasbodenschale. Nur Fluoreszenz von Mikrokügelchen auf der Unterseite of die Schüssel, in der Nähe des TIR-Schnittstelle, sollten erkannt werden. Nachweis von schwimmMikro anzeigt, dass der Winkel zwischen dem einfallenden Licht und objektive normalen unzureichend ist.
   
   Der folgende Abschnitt beschreibt den Aufbau der optischen Komponenten für polarisationsbasierte Bildgebung erforderlich.
5. Mit der 488-nm-Strahl ausgerichtet als ein Führer, stellen Sie die Position des Ausgangs 561 nm Laserstrahl so dass es entlang einer identischen optischen Weg fährt. Die 561-nm-Laser wird für die Bildgebung des Carbocyaninfarbstoff verwendet werden, getan hat.
6. Legen Sie eine Zerstreuungslinse und Spiegel hinter der 561-nm-Laser. Mit den Spiegeln, stellen Sie den Strahl, so dass es mit der 488 nm Strahl mitausgerichteten und der Fleck ist im Fokus an der Decke, wenn die Galvanometer-Spiegel sind in der Position "0".
7. Zentrieren einer Viertelwellenplatte (QW) im Strahlengang unmittelbar stromabwärts von der Laseröffnung. Verwenden eine QW, die entweder achromatische oder der Anregungswellenlänge abgestimmt ist.Eine QW wird zirkular polarisiert jede linear polarisierte Licht, das in einem 45 °-Winkel mit der optischen Achse eintritt. Einige optische Komponenten, wie beispielsweise die Polarisationswürfel, eine Dämpfung Vorspannung in Richtung einer Achse der Polarisation. Die QW kann gedreht werden, um diese Verzerrung zu kompensieren. Diese Einstellung wird in einem elliptisch polarisierten Strahl führen. Eine QW ist notwendig, weil der Laserstrahl selbst wird stark linear polarisiert (vertikal), wie es aus der Öffnung austritt.
8. Legen einen Polarisationswürfel (PC1) stromabwärts des elliptisch polarisierten Strahl. Die Polarisationswürfel reflektiert die vertikale (Y)-Komponente des elektrischen Feldes und gibt die horizontale (x-) Komponente. Die Polarisationswürfel auf einer kleinen Bühne platziert übersetzen, um nachfolgende Ausrichtung der Polarisationsstrahlwege zu erleichtern.
9. Verwenden Sie einen zweiten Polarisationswürfel (PC2) und Spiegel (Abbildung 1A), um die Strahlen zu rekombinieren.
10. Legen einen Verschluss zwischen dem ersten Polarisationswürfel (PC1) und dem vertikalen Zusammenmponent Spiegel. Legen Sie einen zweiten Verschluss zwischen der horizontalen Komponente Spiegel und zweiten Polarisationswürfel (PC2). Diese Rollläden werden von der Imaging-Software dem Benutzer ermöglicht, schnell zwischen Strahl Polarisationen wählen gesteuert.
11. Einen Polarisationsfilter verwenden, um die elektrische Feldorientierung in jedem Strahlengang zu überprüfen. Ein Polarisationsfilter nur Übertragung zu ermöglichen im Einklang mit der Filterachse.
12. Überprüfen, ob die vertikalen und horizontalen Komponenten des Laserstrahls miteinander und dem 488 nm-Strahl ausgerichtet. Nehmen Sie die Einstellungen nach Bedarf. Die drei Strahlen müssen alle auf dem BFP fokussiert und kollimiert austreten aus dem Ziel der gleichen Stelle an der Decke. Dieser Ort kann durch ein X markiert werden, um zukünftige Ausrichtung zu erleichtern.
13. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Ziel. Die Schale mit fluoreszierenden Mikrosphären (siehe Schritt 4 oben) auf das Ziel.
14. Geben TIR durch Bewegen der X Galvanometerspiegels. In TIR, die vertikale Komponent des Strahls ist die S-Pol und die horizontale Komponente des Strahls ist nun die p-pol. Stellen Sie die relative Intensität zwischen den Balken durch Drehen des QW Platte. Zeigen Sie jedes polarisiert evaneszente Feld mit einer Rhodamin-Probe, die vorhergesagt wird nach dem Zufallsprinzip ausgerichtet werden. Drehen Sie den QW Platte, die durchschnittlichen Pixelintensitäten entsprechen. Falls erforderlich, fügen Sie ein Neutraldichtefilter in eine polarisierte Strahlengang seiner Intensität zu dämpfen.

2. Chromaffinen Zellisolierung

Ein Verfahren zur Isolierung von gesunden chromaffinen Zellen des Nebennieren Kalb ist unten angegeben. Es ist aus der zuvor veröffentlichten Protokollen Wick, Senter et al. ¹⁹ und O'Connor angepasst, ²⁰ Mahata et al. Nach der Isolierung werden die Zellen mit dem Plasmid (e) von Interesse unter Verwendung einer Elektroporation System elektroporiert. Dieses System resultiert in 20-30% der Zellen, die die gewünschte fluoreszierende Proteine. In der Regel 70% der Zellen, die Auserwählten überlebenroporation Prozess. Details der PSS und Medien-Komponenten sind in den Tabellen 2, 3 und 4 vorgesehen.

1. Zwei Tage vor der Zelle prep, behandeln 35-mm-optische Qualität mit Glasboden (0,17 mm dick) Gerichte mit 1 ml Poly-D-Lysin (0,1 mg / ml), gefolgt von 1,25 ml Rinder-Kollagen. Lassen Gerichte an der Luft trocknen in der Gewebekultur Kapuze.
2. Erhalten Rinder-Nebennieren vom Schlachthof. Halten Sie die Drüsen auf Eis, während sie zurück ins Labor transportiert werden. Die Rinder-Nebennieren kann in einer dicken Fettschicht ummantelt werden. Verwenden chirurgische Schere, um überschüssiges Fett zu entfernen und setzen die Nebennierenvenenöffnung. Perfundieren die Vene mit prep-PSS wiederholt, bis die Drüse von Blut gereinigt.
3. Nächstes langsam pipettieren 2 ml TH-PSS-Lösung in die Vene Öffnung, bis die Drüse schwillt an. Der aufgeblasene Drüsen bei 37 ° C für 15 min. Wiederholen Sie den TH-PSS-Behandlung und wieder inkubiert.
4. Durch das äußere Nebennierenrinde um den Rand der Drüse mit s abgeschnittencissors und schälen die Drüse auseinander, um die Medulla aussetzen. Verwenden Sie ein Skalpell vorsichtig abkratzen und trennen Sie die Medulla aus dem Rindengewebe.
5. Mince das Mark mit einem Paar von Skalpellklingen für 5-10 min.
6. Ein letzter Schritt zur Digestion erforderlich, einzelne chromaffinen Zellen zu isolieren. Gießen Sie das Hackfleisch Zellsuspension in einer Spinnerflasche. Teil des Kolbens mit einem 2:1-Verhältnis von TH-PSS (30 ml) TL-PSS (15 ml) zu füllen und Inkubation für 30 min bei 37 ° C beim Spinnen bei etwa 100 Umdrehungen pro Minute.
7. Trennen Sie die einzelnen chromaffinen Zellen aus unverdauten Gewebe durch Filtrieren durch eine 400 um Maschen. Das Filtrat. Zentrifuge bei 200 xg, um die Zellen zu pelletieren, und resuspendieren in eiskaltem PSS.
8. Filtern Sie die Zellen durch ein 250 &mgr; m-Mesh-, Pellet, und schließlich in Puffer resuspendieren Elektroporation (siehe Schritt 2.9).
9. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer und die Vorbereitungen für die Transfektion.
10. Transfektion von Zellen mit der Elektroporation System nachEmpfehlungen des Herstellers. Die genauen Bedingungen für die Elektroporation muss empirisch ermittelt werden. Hinweis: Die Einstellungen, die die beste Balance zwischen Transfektionseffizienz und Zellüberlebensrate für diese Zubereitung von Rinderchromaffinen Zellen bereitzustellen sind 1.100 V, 40 ms und 1 Impuls. Wir schätzen, dass mit diesen Bedingungen 20-30% der Zellen transfiziert werden. Etwa 30% der Zellen nicht die Elektroporation überleben.
11. Platten Zellen vorsichtig auf Poly-D-Lysin und Kollagen behandelten Geschirr in 1 ml Medium erwärmt Elektroporation.
12. Setzen Gerichte in einer 37 ° C-Inkubator (5% CO _2). 1 ml 2x Antibiotikum Medien zu jeder Schale nach 6 Stunden. Ändern Sie die Medien in den normalen Medien am nächsten Tag.
13. Chromaffinen Zellen typischerweise 2-5 Tage nach der Elektroporation abgebildet.

3. pTIRF Image Acquisition

1. Power on Imaging-System und starten Erfassungssoftware.
2. Stellen Sie sicher, dass Laser ausgerichtet sind. Abklingenden prüfenFeld-Profil mit Mikrosphären.
3. Bereiten Sie die globalen und lokalen Perfusion System. Lösungsbehälter reinigen mit gefiltertem deionisiertem H ₂ O und füllen mit basalen und anregende PSS-Lösungen.
4. Vor Abbilden chromaffinen Zellen, zu überprüfen, dass die p-Pol und S-Pol-Anregungen beleuchten den gleichen Bereich des Sichtfeldes, und daß die Beleuchtungsstärken sind in etwa gleichwertig. Um dies zu tun, füllen eine Glasbodenschale mit 2 ml PSS enthält Rhodamin in einer Endkonzentration von 10 mM. Nacheinander die Rhodamin-Probe mit p-pol-und s-pol Licht begeistern und fangen die Bilder. In der Praxis sind die P-und S-Emissionen aus diD normalisiert zum Mittel des P-und S-Rhodamin-Emissionen. Siehe die Bildanalyse und Diskussion Abschnitte für weitere Details.
5. Nun zur Färbung Rinderchromaffinen Zellen mit diD fortzufahren. Spülen Kulturmedien von der Schale die chromaffinen Zellen, und ersetzen mit 2 ml basal-PSS. In 10 ul 10 mM DID (in Ethanol verdünnt)direkt in die Schale mit den Zellen. Leicht bewegen Gericht für 2-10 sec und entfernen Sie die diD + PSS-Lösung.
6. Waschen Sie die Teller 3-4x mit basal-PSS zu entfernen jegliche Rest taten. Die Zellen werden nun gefärbt und einsatzbereit.
7. Fügen Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Ziel. Zeigen Schale mit diD-gefärbten chromaffinen Zellen auf der Oberseite des Objektivs.
8. Anzeigen der Schale entweder durch das Objektiv oder in der Kamera, finden Sie eine Zelle, die mit dem Protein von Interesse transfiziert und mit diD gefärbt. Ein gut gefärbten Zelle weist einen P-Emission, die anschaulich zeigt die Kanten der Zelle; die S-Emissions sollte ungefähr gleichförmig über die Grundfläche Zelle (dh der Bereich der Zelle, die zu dem Glas anhaftet und in TIRF abgebildet).
9. Positionieren Sie die lokale Durchblutung Nadel, so dass es etwa 100 um weg von der Zelle.
10. Konzentrieren Sie sich auf der Zellmembran und aktivieren Sie die Autofokus-Hardware unmittelbar vor der Zellstimulation / Bildaufnahme.
11. Start der Bildaufnahme. Perfundieren Zellen für 10 sec mit einer Grundlösung und dann für 60 Sekunden mit einem depolarisierenden 56 mM KCl-Lösung. Erwerben Sie Bilder schnell Schalung während zwischen 561 nm p-pol, 561 nm s-pol (Änderungen in P-und S-Emission von diD überwachen) und 488 nm-Anregung (Bild, um die transfizierte Vesikel Sonde). Beispiele von Bildern während der Versuche erworbenen sind in Fig. 2 und 3 gezeigt.

4. Bildanalyse

Die Berechnungen für die Bildverarbeitung kann mit ImageJ durchgeführt werden, aber unter Verwendung von Skripten in eine flexible Programmiersprache wie IDL oder Matlab kann die Analyse Durchsatz deutlich erhöhen durch die Automatisierung der Aufgabe. Zwei Typen der Bilder berechnet werden müssen, topologische Informationen von Rohemission Bilder zu erhalten -. P / S und P 2 S P / S berichtet über lokale Verformungen Membran, während die P 2 S Summe berichtet über die gesamte Membranfarbstoff in einer bestimmten Regiondes Feldes.

1. Alle Bilder sollten Hintergrund subtrahiert werden. Wählen Sie eine Aus-Zelle ROI, messen die Durchschnittspixelintensität in der ROI, und anschließendes Subtrahieren des Wertes von allen Pixeln in dem Bildstapel.
2. Zu berechnen, P / S, teilen jeden "P" Emissionsrahmen durch die nachfolgende "S" Emissionsrahmen (Pixel-zu-Pixel). P / S hängt von den relativen Intensitäten der P-und S-Pol-Anregungen, spannt in der Optisches System, und Interferenzstreifen. Um diese Effekte zu reduzieren, normalisieren die P / S-Verhältnisse von von DID Emission auf das Verhältnis mit einer Lösung, enthaltend 10 mM Rhodamin ¹⁸ erhalten wird.
3. Exozytose einzelner DCVS ist aus einer plötzlichen Änderung der Intensität einer Fluoreszenz Vesikelprotein wie Synaptotagmin-1 pHluorin (2B) offensichtlich. Ermitteln Änderungen in P / S und P 2 S durch Mittelwertbildung der Pixel in einem 240 nm Radius ROI über lokalisierte Erhöhung des P / S zentriertVerhältnis an den Standorten der Exozytose. Wenn Fusions tritt ohne einen offensichtlichen Anstieg der P / S wird der ROI über dem Bereich des Schmelz DCV zentriert.
4. Computersimulationen durchgeführt werden können, um in Form von einfachen Geometrien einer Fusionspore dilatierenden interpretieren P / S und P 2 S Membran Intensitätsänderungen. Details zu den Simulationen finden Sie ¹⁸ Anantharam et al.

Ergebnisse

Herkömmliche und polarisierte TIRFM Abbildungstechniken sind auf dem gleichen Luft Tabelle implementiert. Die Konfiguration der optischen Elemente ist ähnlich, mit dem Hauptunterschied, dass das Anregungslicht polarisiert ist (Fig. 1A). Polarisiertes Licht bevorzugt regt Fluorophore mit Absorption Dipole in der Polarisationsrichtung. So kann pTIRFM wirksam bei der Überwachung Membran topologische Veränderungen sein, die Sonde, die verwendet wird, muss in der Membran mit einer festen Orientierung einzulagern. Die fluoreszierenden Carbocyaninfarbstoffe (dii, DID) einlagern in einem orientiert mit Übergangs Dipole in der Membranebene (Abbildung 1B) in Lipiddoppelschichten. P-polarisierte Beleuchtung (1C) der DID-markierten Membranen regt selektiv Deckglas-Schräg Fluorophore (RED in den 1B und 1D).

Ausgelassene Membran Kennzeichnung von chromaffinen Zellen erreicht wird, nachdem abRief Inkubation mit taten. Fig. 2A zeigt ein Beispiel einer Zellmembran, auch gefärbt wird. Eine gesunde, adhärenten Zell werden deutliche Unterschiede in P-und S-Emissionen aufweisen. Die P Emissionsbild zeigt eine hellere Zellrahmen in Bezug auf den Rest der Zelle. Die S-Emission Bild zeigt grob einheitlichen Fluoreszenz über die Zelle Fußabdruck. Berechnete Pixel-zu-Pixel-P / S-und P + 2S Bilder sind empfindlich gegenüber Membrankrümmung und der Farbstoffkonzentration auf. Die dargestellte chromaffinen Zellen wurde auch mit Synaptotagmin-1 pHluorin (SYT-1) transfiziert wurden, um sekretorische Vesikel (2B) zu kennzeichnen.

Die chromaffinen Zellen mit 56 mM KCl stimuliert, um die Zellmembran depolarisiert und lösen Exozytose. Eine Reihe von hell fluoreszierende Syt-1 pHluorin Flecken plötzlich klar, wie dcvs Sicherung (2B, rechts). Ein weißes Feld ist um ein Fusionsereignis (2B, rechts) gezogen. Diese Fusion Ereignis is in den 2C und 2D analysiert. 2C zeigt Frame-by-Frame-Veränderungen in Syt-1-pHluorin, P / S und P 2 S Bildintensitäten. Die Fluoreszenzintensität von Syt-1 schnell abnimmt, wenn das Protein diffundiert von der Fusionsstelle (2D). Die Vertiefung, die die Vesikel fusioniert / Plasma-Membran-Komplex vermindert sich auf einem relativ langsamer (Anmerkung Graphen in 2D). Die Abbildung (Abb. 2E) zeigt eine Interpretation dieser Messungen.

Die in Fig. 2 gezeigte schnelle und lokalisierte Membranverformungen sind ein Ergebnis der Stimulus hervorgerufene Ca ^{2 +-Einstroms.} Dies ist in Fig. 3A gezeigt ist. Ein chromaffinen Zellen mit dem genetischen Ca ^{2 +-Indikator} GCaMP5G ^21,22 transfiziert und mit 56 mM KCl stimuliert. Membrandepolarisation führt zu einer signifikanten Zunahme der Fluoreszenz GCaMP5G ( ng> Fig. 3a und 3b) bedeutet eine Erhöhung der subplasmalemmalen Ca ^{2 +-Spiegel.} Eine 30 x 20 Pixel-Bereich der Zelle ausgewählt ist, und Rahmen-für-Rahmen wechselt in GCaMP5G, P / S, P und S +2 Pixelintensitäten in den Bildern (3B) und Graphiken (Fig. 3C) gezeigt. Zeit "0" bezeichnet den Rahmen vor einem Wechsel ein P / S ist offensichtlich (dh der Rahmen vor der Exozytose). Die weißen Pfeile zeigen an, dass die Membranverformung (Erhöhung der P / S) wird durch eine Abnahme der P +2 S-Emissions begleitet. Die zytosolischen GCaMP5G Protein von dem von dem kondensierten DCV ausgeschlossen. Beachten Sie auch die plötzliche Abnahme GCaMP5G Intensität zum Zeitpunkt 0 in 3C, linken Bereich aus. Die langlebigen Erhöhung P / S und die Abnahme der P +2 S schlagen eine Fusionspore, die langsam erweitert (Fig. 3D).

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Fig. 1 ist. Illustrationen für die pTIRFM Technik. A) Eine schematische Darstellung für die Kombination mit herkömmlichen Polarisationsgestütztes TIRF Bildgebung gezeigt. Eine Viertelwellen (QW) Platte vor einem 561-nm-Saphir-Laser in elliptisch polarisieren den Laserstrahl platziert. Ein Polarisationswürfel (PC1) wird verwendet, um lineare Polarisation in vertikaler (V) und horizontalen (h)-Komponenten zu trennen. Die vertikalen und horizontalen Komponenten werden der p-Pol-und S-Pol-Anregungsstrahlen, die jeweils an der TIR-Oberfläche. Die p-und s-pol pol Pfade unabhängig Läden (S1 und S2). Sie sind mit Spiegeln und einem zweiten Polarisationswürfel (PC2) kombiniert. Sie schließen die 488 nm-Strahl (auch unabhängig Läden, S3) über einen Strahllenkelements, bestehend aus einem Spiegel und nichtpolarisierenden dichroischen Spiegel (DC). Objektive (L) werden verwendet, um zu erweitern und konzentrieren die Strahlen. Kombination 488-nm-und 561 nm-Strahlen mit einer Seitenbeleuchtungsöffnung des Mikroskops über Galvano gelenktMeter-Spiegel (GM). Sie konzentrieren sich an der hinteren Brennebene (BFP) des Objektivs. Photonen von Fluorophoren emittiert werden, auf einem EMCCD Kamera an einen PC. B verbunden fangen) Hat Kennzeichnung durch kurzes Inkubieren der Zellen mit dem Farbstoff und das Waschen wiederholt, um überschüssiges zu entfernen. DiD interkaliert in der Membran mit Übergangsdipolmomente etwa in der Membranebene. C) Das einfallende Licht in der Einfallsebene (p-pol) polarisiert erzeugt eine abklingende Feld, das überwiegend polarisiert senkrecht zu der Oberfläche ist, wie gezeigt. D) Die Beleuchtung des DID-markierten Membran mit p-polarisiertes Licht wird selektiv anzuregen, diese Fluorophore, die Deckglas-schräge (RED) sind. Wenn dies eine s-polarisierte evaneszenten Feldes, würden diese Fluorophore, die parallel zur Deckgläser sind anstelle angeregt werden (schwarz).

2. Trong> Monitoring Zellmembran Verformungen mit pTIRFM. A) rohes P und S-Emissions Bilder zusammen mit berechneten P / S und P 2 S-Emissions Bilder angezeigt werden. Maßstabsbalken, 3,2 um. B) Ein chromaffinen Zelle, Syt-1 pHluorin mit KCl depolarisiert. Eine Reihe von hell fluoreszierende Flecken (rechts) zeigen die Fusion der einzelnen dcvs. Maßstabsbalken, 3,2 um. C) Frame-by-Frame-Bildern einer Fusion Syt-1 pHluorin DCV. Zeiten (Bilder oben) sind in Sekunden. Zeit 0 bezeichnet Rahmen vor der Fusion des DCV. Entsprechenden P / S und P 2 S-Emissions Bilder werden auch gezeigt. . Maßstab 1 um D) Diagramme für Bilder in C. Die gestrichelte Linie ist zum Zeitpunkt 0 -. Rahmen die Fusion E) Eine mögliche Interpretation der Ergebnisse in C und D gezeigt. blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Deformationen sind eine Folge von Stimulus hervorgerufene Ca ^{2 +-Einstroms.} A) Eine chromaffinen Zelle mit GCaMP5G transfiziert mit 56 mM KCl depolarisiert. Die daraus resultierende Erhöhung der GCaMP5G Fluoreszenz bedeutet eine Erhöhung subplasmalemmalen Ca ^{2 +-Niveaus} B). Bild-für-Frame-Bilder von 30 x 20 Pixel-Bereich von Zell A. in Zeiten oben Bilder sind in Sekunden. Weiß Pfeilspitzen zeigen einen Bereich der P / S-und P-2 Anstieg S Abnahme. Cytosolischen GCaMP5G Protein von dem von der Schmelz DCV ausgeschlossen. Maßstabsbalken, 1 um. C) Graphen für Bilder in B gezeigt D) Eine mögliche Interpretation der Ergebnisse in B und C gezeigt.3highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

iXon3 EMMCD Kamera	Andor	897
IX81 Inverses Mikroskop	Olymp		Seitliche FILTERCUBE Versammlung
43 Serie Ar-Ionen-Laser	CVI Milles Griot Laser Optics	543-AP-A01	Abstimmbar bis 488 nm
Sapphire 561 LP Diodenlaser	Kohärent		561 nm
Scannen Galvo-Spiegel-System	Thorlabs	GVS102
VC 3 Kanal Focal Perfusionssystem	ALA Scientific Instruments	ALA VC3X4PP
QMM Quartz MicroManifold	ALA Scientific Instruments	ALA QMM-4
10 psi Druckregler	ALA Scientific Instruments	ALA PR10
Manipulator	Burleigh	TS 5000-150
Montiert Achromatic Viertelwellenplatte	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680 nm Polarisationsstrahlteilerwürfel	Thorlabs	PBS201
Sechs Bahnhof Neutral Density Rad	Thorlabs	FW1AND
Stepper-Motor Driven SmartShutter	Sutter Instruments	IQ25-1219
HQ412lp Dichro Filter	Chroma	NC255583	Joins 488 nm und 561 nm Strahlen
Coated Plankonkavlinse	Edmund Optics	PCV 100mm VIS 0	Divergiert 488 nm Strahl
Coated Plankonkavlinse	Edmund Optics	PCV 250mm VIS 0	Divergiert 561 nm-Strahl
Coated plan-konvexen Linse	Edmund Optics	PCX 125mm VIS 0	Konzentriert sich beide Strahlen
Coated plan-konvexen Linse	Edmund Optics	PCX 50mm VIS 0	Zementiert Würfel Montage filtern
z488/561rpc Dichroic	Chroma	z488/561rpc	FILTERCUBE dichroitischen
z488/561_TIRF Emissionsfilter	Chroma	z488/561m_TIRF	FILTERCUBE Emissions
UIS2 60X Ziel	Olymp	UPLSAPO 60XO	NA 1.37
Neon Transfektionssystems	Invitrogen	MPK 5000
MetaMorph Imaging Software	Molecular Devices
Dil Membran Dye	Invitrogen	V-22885	Zur Ausrichtung
TH Liberase	Roche	5401135001
TL Liberse	Roche	5401020001
DNAse I Typ IV aus Rinder	Sigma	D5025
Hämozytometers	Fischer	0267110
DiD Membran Dye	Invitrogen	D-7757
Rhodamin	Invitrogen	R634
0,22 um Membranfiltereinheit Spritze	Millipore	SLGS033SS
Fluoresbrite Polychromatischer Red Mikrosphären	Polysciences	19507	0,5 um
Immersionsöl	Sigma	56822
LabVIEW	National Instruments		Steuert GALVO Spiegel
Spinner Flask	Bellco	1965-00250

Tabelle 1. pTIRF Mikroskopie Ausrüstung.

Inhalt	Prep-PSS	Basal-PSS	Stim-PSS
NaCl	145 mM	145 mM	95 mM
KCl	5,6 mM	5,6 mM	56 mM
MgCl 2	-	0,5 mM	0,5 mM
CaCl2	-	2.2 mM	5 mM
HEPES	15 mM	15 mM	15 mM
pH-Wert	7.4	7.4	7.4
Glucose	2,8 mM	5,6 mM	5,6 mM
Pen-Strep	1x	-	-

Tabelle 2. Perfusion und chromaffinen Zellen prep-Lösungen.

Inhalt	Elektroporation Medien	Normale Überzug Medien	2x Antibiotika-Medien
1x DMEM/F-12	1 ml / Platte	2 ml / Platte	1 ml / Platte
FBS	10%	10%	10%
Cytosinarabinofuranosid (CAF)	-	1 ul / ml von 10 mM Lizenz	-
Penicillin	-	100 Einheiten / ml	200 Einheiten / ml
Streptomycin	-	100 &mgr; g / ml	200 &mgr; g / ml
Gentamycin	-	25 &mgr; g / ml	50 &mgr; g / ml

Tabelle 3. Chromaffinen Zellen-Medien.

Inhalt	TH-PSS	TL-PSS
Liberase TH	2 ml	-
Liberase TL	-	0,85 ml
Prep-PSS	98,0 ml	84,0 ml
DNase	8,75 mg	7,4 mg

Tabelle 4. TH und TL-PSS-PSS-Lösungen.

Diskussion

Polarisation basierende TIRFM erkennt schnell, submikroskopische Veränderungen in der Membran-Topologie. Die Umsetzung der Technik ist relativ einfach, insbesondere, wenn TIRF-Optik sind bereits vorhanden. Alles, was benötigt wird, ist eine Viertelwellenplatte, zwei Polarisationswürfel, und Fensterläden zu p-pol-und s-pol Beleuchtung Wege zu trennen. Die genaue Position dieser Komponenten auf dem Tisch ist in der Regel von Speicherplatz bestimmt.

Um die Membran topologische Informationen zu erhalten, sollte die fluoreszierende Sonde verwendet mit einer festen oder bekannten Orientierung einzulagern. Die Technik, wie in diesem Artikel beschrieben wird, nimmt die Verwendung Carbocyaninfarbstoffen aber auch andere Farbstoffe, wie FM1-43 ^14, können ebenfalls verwendet werden. Die Membran Färbeverfahren selbst ist unkompliziert. Kultivierte Zellen benötigen nur eine sehr kurze Exposition (weniger als 10 Sek.), um eine kleine Menge der Dii / tat, um üppige Kennzeichnung der Membran zu erhalten. Hinzufügen von überschüssiger Farbstoff führt zu Lichtstreuung AGGREGAtes auf dem Glas, die Bildqualität zu verringern. Über Inkubieren von Zellen mit Farbstoff führt zur Internalisierung, die nachteilige Auswirkungen auf die Bildqualität und möglicherweise die Lebensfähigkeit der Zellen hat zu färben. Wenn eine Zelle ist gut gefärbt, gibt es klare Unterscheidung in der P-und S-Emission-Bildern. Wie in 2A gezeigt, wird die P-Emissions anschaulich markieren Bereiche der Membran, die Deck schräge (dh die Kanten der Zelle Fußabdruck) sind, während der S-Emissionsintensität annähernd gleichförmig über die Grundfläche Zelle sein. Wenn ein deutlicher Unterschied zwischen P und S, ist nicht ersichtlich, ist es möglich, dass die Zelle nur schlecht auf dem Substrat haften oder die Zellmembran nicht gesund ist, und die Zelle ist nicht für die Experimente verwendet.

Unsere bisherigen Studien beschreiben pTIRFM genutzt DII als Fluoreszenzsonde Membran. Hier nutzen wir das gemacht haben weil es für Dual-Farb-Imaging Experimente, die GFP / pHluorin wie die anderen Fluorophor beschäftigen ist. Wir begeistern diD with ein 561-nm-Laser statt 640 nm Laser (die näher an seine Anregung Gipfel ist), weil die Fluorophor Bleichmittel schneller bei 640 nm auf. Trotz der Tatsache, dass der 561-nm-Laser ist auf dem Schwanz tat veröffentlicht Anregungsspektrum, Fluoreszenz effizient emittiert. Ein weiterer Vorteil der 561-nm-Laser ist, dass es regt beide Dii Und hat es uns ermöglicht, die gleiche Polarisation Setup für die beiden Sonden zu verwenden. Man beachte, dass die Orientierung des Fluorophors in der Membran wird die Auslegung der Membrantopologie beeinflussen. Wenn beispielsweise ein Fluorophor wurden mit Übergangsdipole senkrecht zur Membranebene orientiert ist (anstatt parallel oder nahezu parallel, wie es der Fall mit DII oder hat), dann nicht planaren Membranregionen werden leichter durch die S markiert werden, anstatt die P-Emission.

Wir haben auch für die Isolierung und Elektroporation von Rinder-Nebennieren-chromaffinen Zellen beschriebenen Techniken. Die Rinderchromaffinen Zellen ist ein hervorragendes secretory Modell. Es hat die Vorteile, dass sie leicht in Kultur, die auf einer Vielzahl von Sekretagogen halten und besitzen große sekretorische Vesikel, die ohne weiteres mit konventionellen Lichtmikroskopie sichtbar gemacht werden. Fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, werden die Zellen in Suspension vor dem Beschichten auf Kollagen behandelten Kulturschalen elektroporiert. Nach unserer Erfahrung ist Expressionseffizienz mit Elektroporation viel höher als entweder mit Ca ^{2 +-Phosphat-oder} Lipofectamine Reagenzien. Der Nachteil der Elektroporation ist, dass es mehr Zellen benötigt (wie viele den Prozess nicht überleben), kommerziellen und teuren Reagenzien. Aus Gründen, die uns unklar sind, beinhaltet nicht jede Membran taten. Außerdem wird nur ein Bruchteil der Zellen auf der Schale transfiziert. Die Suche nach Zellen, die transfiziert werden und sind mit diD befleckt kann zeitaufwendig sein, weshalb die Optimierung Bedingungen für die Färbung und Elektroporation ist die Mühe wert.

Zusammenfassend, das einArtikel beschreibt, wie pTIRFM wird implementiert, um die rasche und lokalisierte Membran Verformungen, die bei der Fusion von Vesikeln dichten Kern in Rinderchromaffinen Zellen auftreten überwachen. Obwohl nur eine Anwendung beschrieben, ist die Technik ideal für die Untersuchung von anderen biologischen Prozessen, Veränderungen in Membranform, einschließlich Endozytose, Zytokinese und Zellmotilität beinhalten geeignet.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
iXon3 EMMCD Camera	Andor	897
IX81 Inverted Microscope	Olympus		Side-mounted Filtercube Assembly
43 Series Ar-Ion Laser	CVI Milles Griot Laser Optics	543-AP-A01	Tunable to 488nm
Sapphire 561 LP Diode Laser	Coherent		561nm
Scanning Galvo Mirror System	Thorlabs	GVS102
VC3 Channel Focal Perfusion System	ALA Scientific Instruments	ALA VC3X4PP
QMM Quartz MicroManifold	ALA Scientific Instruments	ALA QMM-4
10 PSI Pressure Regulator	ALA Scientific Instruments	ALA PR10
Manipulator	Burleigh	TS 5000-150
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube	Thorlabs	PBS201
Six Station Neutral Density Wheel	Thorlabs	FW1AND
Stepper-motor Driven SmartShutter	Sutter Instruments	IQ25-1219
HQ412lp Dichroic Filter	Chroma	NC255583	Joins 488nm and 561nm beams
Coated Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 100mm VIS 0	Diverges 488nm beam
Coated Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 250mm VIS 0	Diverges 561nm beam
Coated Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 125mm VIS 0	Focuses both beams
Coated Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 50mm VIS 0	Cemented to filter cube assembly
z488/561rpc Dichroic	Chroma	z488/561rpc	Filtercube dichroic
z488/561_TIRF Emission Filter	Chroma	z488/561m_TIRF	Filtercube emission
UIS2 60x Objective	Olympus	UPLSAPO 60XO	NA 1.37
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK 5000
MetaMorph Imaging Software	Molecular Devices
DiI Membrane Dye	Invitrogen	V-22885	For Alignment Purposes
TH Liberase	Roche	5401135001
TL Liberse	Roche	5401020001
DNAse I Type IV from bovine	Sigma	D5025
Hemocytometer	Fisher	0267110
DiD Membrane Dye	Invitrogen	D-7757
Rhodamine	Invitrogen	R634
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit	Millipore	SLGS033SS
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres	Polysciences	19507	0.5 microns
Immersion Oil	Sigma	56822
LabVIEW	National Instruments		Controlls galvo mirrors
Spinner Flask	Bellco	1965-00250