הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם pTIRFM

Summary

ההשתקפות הפנימית מוחלטת המבוסס על קיטוב מיקרוסקופ פלואורסצנטי (pTIRFM) מאפשר זיהוי של דינמיקת קרום תא בזמן אמת. מאמר זה מתאר את היישום של pTIRFM לחקר שיפוץ קרום במהלך exocytosis המוסדר. הטכניקה היא להכליל לתהליכים אחרים בביולוגיה של תא באופן ישיר או עקיף כרוך בשינויים בצורת קרום.

Abstract

כדי לקבל תובנה חדשות על הדינמיקה של exocytosis, הקבוצה שלנו מתמקדת בשינויים בצורת bilayer שומנים שחייבים להיות מוסדר דווקא בהיתוך של קרום שלפוחית ​​ופלזמה. שינויים מהירים ומקומיים אלה מושגים על ידי אינטראקציות דינמיות בין שומנים וחלבונים מיוחדים השולטים בעקמומיות בממברנה. היעדר אינטראקציות מסוג זה לא רק תוצאות הרסניות לאיחוי שלפוחית, אבל שורה של תפקודים תאיים אחרים המעורבות בשליטה של ​​צורת קרום. בשנים האחרונות, את זהותו של מספר החלבונים בעלי תכונות עיצוב קרום כבר נקבעה. מה שנותר חסר הוא מפת דרכים של מתי, איפה, ואיך הם מתנהגים כמו היתוך והתקדמות שחרורו תוכן.

ההבנה של האירועים המולקולריים, המאפשרים שיפוץ קרום שלנו מבחינה היסטורית הייתה מוגבלת על ידי חוסר של שיטות אנליטיות, כי הם רגישים לעקמומיות הממברנה או שיש הפתרון הזמני לטראקk שינויים מהירים. PTIRFM מספק את שני הקריטריונים האלה. אנחנו דנים כיצד pTIRFM מיושם לדמיין ולפרש, שינויי submicron מהירים בכיוון של קרום תא chromaffin בשלפוחית ​​ליבה צפופה היתוך (DCV). תאי chromaffin אנו משתמשים מבודדים מבלוטת יותרת הכליה שור. הקרום מוכתם בצבע carbocyanine lipophilic, 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3 ", 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4 chlorobenzenesulfonate, או עשה. עשה intercalates במישור הקרום עם אורינטציה "קבועה", ולכן הוא רגיש לקיטוב של שדה חלוף. קרום התא עשה הצבעוני הוא ברצף נרגש עם קיטובים מאונך של לייזר 561 ננומטר (p-Pol, s-POL). לייזר 488 ננומטר משמש כדי לחזות מרכיבים וזמן שלפוחית ​​הרגע של היתוך. Exocytosis מופעל על ידי מקומי מרוססים תאים עם פתרון KCl depolarizing. ניתוח מתבצע במצב לא מקוון באמצעות תוכנה אישית בכתב כדי להבין איךשינויי עוצמת פליטה מתייחסים להתרחבות נקבובית היתוך.

Introduction

הביצוע הנכון של exocytosis דורש שינויים קיצוניים בצורת bilayer קרום להיות מתוזמרים בדיוק. לפני האיחוי, כיפוף מקומי של קרום הפלזמה תחת גרגיר מתרחש, בין שאר כדי להפחית את מחסום האנרגיה לאינטראקציה של bilayers. מאוחר יותר, כקרומים למזג, אזורים של עקמומיות גבוהה נוצרים ויש התייצבו. לבסוף, קרומים התמזגו חייבים להיות כפופים בכושר הראשוני שלהם להרחבת הנקבובית ההיתוך ולאפשר תוכן שחרורו ^1. מכיוון שקרומים לבד צפויים לעבור שינויים דרמטיים ומתואם כאלה, חלבונים נחוצים כדי לתווך אירועים. אבל איך הם פועלים כדי להשפיע על שינויים בטופולוגיה הקרום במהלך תהליך ההיתוך נשאר מאוד שאלה פתוחה.

מצוין במודלים חוץ גופית קיימות כדי להמחיש עקמומיות בממברנה. השימוש בEM שלילי כתם, למשל, לא היה חשוב לעיצוב מודלים מולקולריים הנוכחיים על מעשיהם של שני p הסחר העיקריroteins - synaptotagmin וdynamin (לביקורות, ראו צ'פמן ² וHenshaw ^3). רוב מבחני של exocytosis בזמן אמת אינם מזהים עקמומיות באופן ישיר. במקום זאת, עקמומיות היא להסיק ממבחנים שידווחו על קינטיקה של שחרור lumenal מטען ^4-8 או שינויים באזור קרום ^9-11. PTIRFM מגשר על הפער בין in vivo ו במבחנה על ידי המאפשר מדידות של שינויים במיקרומורפולוגיה קרום ישירות, בזמן אמת.

PTIRFM, במצב nonimaging, היה חלוץ ידי אקסלרוד ועמיתיו כדי למדוד את הכיוון של NPD-PE משולב בתוך קרום מודל ^12. הטכניקה הייתה לאחר מכן להחיל לדמיין שינויים דינמיים בתאים חיים שכותרתו עם DiI וFM1-43 ^13-18. בpTIRFM, שני קיטובי שדה חלוף משמשים כדי לעורר בדיקה מוטבעת קרום ברצף: p-קיטוב (במישור של שכיחות) ו-S-קיטוב (בניצב למישור של שכיחות). לפני ההדמיה, הבדיקה - במקרה הזה, עשה - הוא הוסיף בקצרה למדיום תאי ומותר intercalate בקרום הפלזמה של התאים כדי להיחקר. באזורים שבם הקרום הוא nonparallel לcoverglass (כמו בלפרוע קרום או כניסה), האם יהיה גם nonparallel. לכן, אזורים כגון יהיו להתרגש על ידי אלומת p-Pol. קרן p-Pol פחות יעילה תלהיב עשתה באזורי קרום הבעיקר במקביל לcoverglass. תמונות יחס פיקסל לפיקסל (P / S) דיווח על הפליטה מעירור p-ו-S-Pol הרציף של האם ולכן יהיה דווקא להדגיש אזורים של עיוות בממברנה. בתאוריה, את תמונות יחס P / S רגישות אפילו זוויות קטנות של סטיית פלזמה קרום מcoverglass, עם משרעת של השינויים הצפויים על ידי סימולציות מחשב ^18. תמונות P / S הן גם בלתי תלויות במרחק fluorophore ממשטח coverglass ו fluorophore המקומיריכוז. ריכוז fluorophore מקומי מסופק במקום על ידי תמונות שדיווחו על סכום פיקסל לפיקסל של פליטת P ו2 פעמים פליטת S (P +2 S). +2 מדידת S P רגישה לגיאומטריה המדויקת של הכניסה, עם כמה, שינוי קטן, או לא אפשרי. זה יכול להיות מוצג על ידי סימולציות מחשב שמעברי מודל של נקבובית היתוך מ( כלומר עם צוואר צר) מוקדם למדינה מאוחר יותר ^16,18. P +2 S של שלפוחית ​​התמזגו מצורף קרום הפלזמה באמצעות צוואר צר (ועם יותר עשה קרוב לממשק) צפוי להיות גדול יותר, למשל, מזו של שלפוחית ​​התמזגו עם נקבוביות רחבות הרבה יותר (שבו האם נמצא בחלק הקלוש ביותר של שדה חלוף).

במאמר זה, אנו דנים כיצד pTIRFM מיושם ומנוצלת ללימוד השינויים מהירים, מקומיים בצורת קרום המתרחשים במהלך התרחבות נקבובית היתוך. בעוד שרק יישום אחד הוא באופן מפורש discussed, השיטות הן להכליל את מגוון רחב של תהליכים בתא אחרים ביולוגיים שאופן ישיר או עקיף כרוך בשיפוץ בממברנה.

Protocol

1. הגדרת מערכת PTIRF

טכניקת pTIRFM בנויה על פלטפורמת מיקרוסקופ הפוכה. קרן לייזר מכוונת דרך יציאת תאורת צד וקוביית מסנן מול צד nonpolarizing, ולאחר מכן התמקדה על מישור המוקד האחורי של אובייקטיבי 60x 1.49 NA TIRF. שתי עדשות נוספות (1.6x ו2X) בנתיב הפליטה בין המיקרוסקופ והמצלמה EMCCD לתת גודל פיקסל סופי של כ 80 ננומטר. קרן לייזר הם מודרכים על שימוש במראות גלונומטר תוכנה מבוקרת למיתוג מהיר בין ההשתקפות פנימית עלית וסך הכל תאורה (TIR). הפרוטוקול המתואר להלן מניח כי אופטיקה לTIRF כבר מוצבות על שולחן האוויר בעמדות אופטימליות לעירור fluorophore והדמיה. הוא מתאר כיצד אופטיקה הקיטוב מתווספות להגדרת מיקרוסקופ TIRF קיים כדי לאפשר הדמיה של עיוותים קרום תא. סכמטי של ההגדרה האופטית של המעבדה שלנו ליצירה שני TIR וpolarizatTIR מבוסס יון מוצג באיור 1 א. הפרוטוקול מניח את השימוש בליזר 488 ננומטר לעירור של חלבוני שלפוחית ​​ניאון וליזר 561 ננומטר להדמיה של צבע carbocyanine, עשה.

1. כוח על כל רכיבי מיקרוסקופ, הלייזרים, ומחשבים.
2. לכוון את אלומת הלייזר מ488 ננומטר למטוס בחזרה המוקד (BFP) של עדשת 1.49 NA כפי שמודגמים באיור 1 א. אם קרן הלייזר על BFP ממוקד, שיצוף collimated ומופיע נקודה מוגדרת היטב קטנה כמו על התקרה ישירות מעל המטרה.
3. התאם את מראה גלונומטר X (הראי ממוקם במטוס המדגם שווה הערך), כך שקרן הלייזר עברה מחוץ ציר ועולה מן האובייקטיבי בזוויות תלולה יותר בהדרגה לנורמלית אובייקטיבי.
4. בשלב הבא, לוודא שטיר מושגת. הוסף 10 μl של microspheres ניאון למיליליטר נפח 1 של PSS בצלחת זכוכית תחתונה. רק הקרינה מזעירה בתחתית oו הצלחת, הקרוב ביותר לממשק טיר, צריך להיות מזוהה. איתור של זעירים צף מצביע על כך שהזווית בין אור האירוע והנורמלי אובייקטיבי אינה מספקת.
   
   הקטע הבא מתאר את ההגדרה של הרכיבים אופטיים הדרושים להדמיה המבוסס על קיטוב.
5. באמצעות קרן 488 ננומטר מיושר כמדריך, להתאים את המיקום של קרן לייזר 561 ננומטר גלם, כך שהוא נוסע לאורך נתיב אופטי זהה. לייזר 561 ננומטר ישמש להדמיה של צבע carbocyanine, עשה.
6. הכנס עדשה לסטות ומראות במורד הזרם של לייזר 561 ננומטר. שימוש במראות, לכוון את הקרן, כך שהוא coaligned עם קורה 488 ננומטר והמקום הוא בפוקוס על התקרה כאשר מראות גלונומטר נמצאות בעמדה "0".
7. מרכז צלחת רבע גל (QW) בנתיב הקרן מייד במורד הזרם של צמצם הלייזר. השתמש QW אשר הוא או אכרומטית או מכוון לגל העירור.QW מעגלית יהיה לקטב את כל אור מקוטב ליניארי שנכנס בזווית של ° 45 עם הציר האופטי. חלק מהרכיבים אופטיים, כגון קוביות הקיטוב, יש הטיה לכיוון הנחתה ציר אחד של קיטוב. QW ניתן לסובב כדי לפצות על הטיה זו. התאמה זו תגרום לאלומה מקוטבת elliptically. QW הוא הכרחי, מכיוון שקרן הלייזר עצמו מקוטב מאוד באופן ליניארי (במאונך) כפי שהוא עולה מהצמצם.
8. מניחים קוביית קיטוב (PC1) במורד הזרם של האלומה מקוטבת elliptically. קוביית הקיטוב משקפת את המרכיב האנכי (y) של השדה החשמלי ומעבירה את הרכיב האופקי (x). קוביית הקיטוב מושם על שלב תרגום קטן כדי להקל על היישור הבא של נתיבי קורה קיטוב.
9. השתמש בקובייה שנייה קיטוב (PC2) ומראות (איור 1 א) ללשלב מחדש קורות.
10. הנח תריס בין הקובייה הראשונה קיטוב (PC1) והשיתוף האנכימראה mponent. הנח תריס שני בין מראה הרכיב האופקי והקובייה שנייה קיטוב (PC2). תריסים אלה נשלטים על ידי תוכנת ההדמיה המאפשרת למשתמש לבחור במהירות בין קיטובי קורה.
11. שימוש במסנן מקטב כדי לוודא את כיוון השדה החשמלי בכל נתיב קרן. מסנן קיטוב רק יאפשר שידור בקו אחד עם הציר של המסנן.
12. ודא שהרכיבים האנכיים ואופקיים של קרן הלייזר מיושרים אחד עם השני ואת קרן 488 ננומטר. בצע התאמות לפי צורך. שלוש הקורות צריכות להיות ממוקדות בBFP ולצאת collimated מהאובייקטיבי לאותה נקודה על התקרה. המקום הזה יכול להיות מסומן על ידי X כדי להקל על יישור עתיד.
13. מניחים ירידה של שמן טבילה על המטרה. מניחים את הצלחת המכילה זעירים מניאון (ראה שלב 4 לעיל) במטרה.
14. הזן טיר על ידי הזזת מראה גלונומטר X. בטיר, componen האנכילא של הקרן הוא s-Pol והרכיב האופקי של הקרן הוא החברה P-Pol. התאם את העצמה היחסית בין הקורות על ידי החלפה של צלחת QW. הצג את כל שדה חלוף מקוטב עם מדגם rhodamine, אשר צפוי להיות מכוונים באופן אקראי. סובב את צלחת QW כדי להתאים את עוצמות פיקסל הממוצעת. במידת צורך, להוסיף מסנן צפיפות ניטראלי בנתיב קרן מקוטב אחד כדי להחליש את עוצמתו.

2. בידוד תא chromaffin

הליך לבידוד תאי chromaffin בריאים מבלוטת יותרת הכליה העגל מובא בהמשך. הוא מותאם מפרוטוקולים שפורסמו בעבר על ידי וויק, Senter, et al. ¹⁹ ואוקונור, מהטה et al. ²⁰ לאחר בידוד, תאי electroporated עם פלסמיד (ים) של עניין באמצעות מערכת electroporation. תוצאות מערכת זו ב20-30% מתאים המבטאים את חלבוני ניאון הרצויים. בדרך כלל, 70% מתאים לשרוד הנבחרתהליך roporation. פירוט מרכיבי PSS ותקשורת מסופק בלוחות 2, 3, ו -4.

1. יומיים לפני הכנת התא, טיפול בזכוכית תחתונה 35 מ"מ איכות אופטית (0.17 מ"מ עובי) מנות עם 1 מיליליטר פולי-D-ליזין (0.1 מ"ג / מיליליטר) ואחריו 1.25 מיליליטר קולגן שור. עזוב את מנות אוויר יבש במכסת מנוע בתרבית רקמה.
2. השג בלוטת יותרת הכליה שור מבית השחיטה. שמור את הבלוטות על קרח בזמן שהם מועברים למעבדה. בלוטת יותרת הכליה השור עשויה להיות עטופה בשכבה עבה של שומן. השתמש במספריים כירורגי כדי להסיר עודפי שומן ולחשוף את פתיחת וריד הכליה. Perfuse הווריד עם prep-PSS שוב ושוב עד שבלוטת מטוהר של דם.
3. בשלב בא, פיפטה לאט 2 מיליליטר של תמיסת TH-PSS לתוך הפתח הווריד עד שמתנפח הבלוטה. דגירה הבלוטות מנופחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. יש לחזור על טיפול TH-PSS ולדגור שוב.
4. לחתוך את קליפת יותרת הכליה החיצונית מסביב לקצה של הבלוטה עם scissors ולקלף את הבלוטה מלבד לחשוף את הלשד. השתמש באזמל כדי לגרד בעדינות ולהפריד את הלשד מרקמת קליפת המוח.
5. ברר בלשד עם זוג להבי אזמל ל5-10 דקות.
6. צעד עיכול סופי יש צורך לבודד את תאי chromaffin בודדים. יוצקים את ההשעיה התא הטחון לתוך בקבוק טווה. באופן חלקי למלא את הבקבוק עם יחס של 2:1 של TH-PSS (30 מיליליטר) ל TL-PSS (15 מיליליטר) ו דגירה במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס בזמן מסתובב בכ 100 סל"ד.
7. הפרד את תאי chromaffin הבודדים מרקמות מעוכלת על ידי סינון דרך רשת מיקרומטר 400. אסוף את התסנין. צנטריפוגה ב XG 200 עד גלולה התאים, ו resuspend ב PSS הקר כקרח.
8. סנן את התאים דרך 250 רשת מיקרומטר, גלולה, ולבסוף resuspend במאגר electroporation (ראה שלב 2.9).
9. ספירת תאים באמצעות hemocytometer ולהתכונן לtransfection.
10. Transfect תאים עם מערכת electroporation פיהמלצות היצרן. התנאים המדויקים לelectroporation צריכים להיקבע באופן אמפירי. הערה: ההגדרות המספקות את האיזון הטוב ביותר בין יעילות transfection ושיעור הישרדות תא להכנה זו של תאי שור chromaffin הן 1,100 V, 40 אלפיות שני, ודופק 1. אנו מעריכים כי בתנאים אלה, 20-30% מתאי transfected. אודות 30% מהתאים לא שורדים את תהליך electroporation.
11. פלייט תאים בעדינות על פולי-D-ליזין וקולגן טופלו מנות ב 1 מיליליטר של תקשורת חיממה electroporating.
12. הנח כלים בחממה 37 ° C (5% CO _2). הוסף 1 מיליליטר של תקשורת האנטיביוטיקה 2x לכל מנה לאחר 6 שעות. לשנות את התקשורת לתקשורת רגילה ביום שלמחרת.
13. תאי chromaffin הם צילמו בדרך כלל 2-5 ימים לאחר electroporation.

3. רכישת תמונת pTIRF

1. כוח במערכת הדמיה ולהתחיל רכישת תוכנה.
2. ודא שלייזרים מיושרים. בדוק חלוףפרופיל שדה באמצעות זעירים.
3. הכן את מערכת זלוף המקומית והעולמית. מאגרי פתרון נקיים עם H ₂ O deionized המסונן ולמלא עם בסיס ועידוד פתרונות PSS.
4. לפני ההדמיה תאי chromaffin, ודא שעירורי p-Pol ו-S-Pol להאיר אותו האזור של שדה הצפייה ושעוצמות התאורה הן בערך שווה ערך. כדי לעשות זאת, למלא צלחת זכוכית תחתונה עם 2 מיליליטר של PSS מכיל rhodamine בריכוז סופי של 10 מ"מ. רצף לרגש מדגם rhodamine עם p-Pol ו-S-Pol אור וללכוד את התמונות. בפועל, פליטת P ו-S מהאם הם מנורמלים לממוצע של P ופליטת rhodamine S. עיין בסעיפי ניתוח תמונה ודיון לקבלת פרטים נוספים.
5. עכשיו תמשיך להכתמת תאי chromaffin שור עם עשיתי. יש לשטוף את התקשורת והתרבות מהמנה המכילה תאי chromaffin ולהחליף עם 2 מיליליטר של הבסיס-PSS. הוסף 10 μl של 10 מ"מ עשה (בדילול מלא באתנול)ישירות לצלחת המכילה את התאים. בעדינות להתסיס מנה ל2-10 שניות ולהסיר את הפתרון + PSS עשה.
6. שטוף את הצלחת 3-4x עם basal-PSS כדי להסיר כל שיורי עשו. התאים עכשיו הם מוכתמים ומוכנים לשימוש.
7. הוסף טיפה של שמן טבילה לאובייקטיבי. מניחים צלחת המכילה תאי chromaffin עשה צבעוניים על גבי המטרה.
8. צופה בצלחת או דרך אובייקטיבי או על המצלמה, למצוא תא אשר transfected עם החלבון של עניין ומוכתם עם עשיתי. תא מוכתם היטב מציג פליטת P שבהירות מדגישה את הקצוות של התא; פליטת S צריכה להיות בערך אחידה על פני טביעת התא (כלומר באזור של התא, כי הוא דבק בזכוכית וצלם בTIRF).
9. מקם את מחט זלוף המקומית, כך שזה בערך 100 מיקרומטר הרחק מהתא.
10. להתמקד בקרום התא ולהפעיל את חומרת פוקוס אוטומטי מייד לפני רכישת גירוי תא / תמונה.
11. בגין רכישת תמונה. תנקב תאים ל10 שניות עם פתרון בסיסי ולאחר מכן ל60 שניות עם 56 פתרון mM KCl depolarizing. לרכוש תמונות תוך shuttering במהירות בין 561 p-Pol ננומטר, ננומטר 561 s-pol (כדי לעקוב אחר שינויים בP ופליטת S של עשה) ועירור 488 ננומטר (לתמונת הבדיקה שלפוחית ​​transfected). דוגמאות לתמונות שנרכשו במהלך ניסויים מוצגות באיור 2 ואיור 3.

4. ניתוח תמונה

חישובים לעיבוד תמונה ניתן לבצע עם ImageJ, אבל תסריטי ניצול בשפת תכנות גמיש כגון IDL או Matlab יכולים להגדיל את התפוקה באופן משמעותי ניתוח על ידי אוטומציה של המשימות. שני סוגים של תמונות חייבים להיות מחושבים כדי להשיג מידע טופולוגי מתמונות פליטת גלם -. P / S ו-P +2 S P / S מדווח על עיוותים קרום מקומיות תוך P +2 סכום S מדווח על צבע קרום הכולל באזור נתוןשל השדה.

1. את כל התמונות צריכים להיות מופחת רקע. בחר את ההחזר על ההשקעה מחוץ לתא, למדוד את עוצמת פיקסל הממוצעת בהחזר על ההשקעה, ולאחר מכן את הפחתת הערך שמכל הפיקסלים בערימת התמונה.
2. כדי לחשב P / S, יש לחלק כל מסגרת "P" פליטה על ידי המסגרת שלאחר מכן "S" הפליטה (פיקסל לפיקסל). P / S משתנה עם העוצמות היחסית של p-ו-S-Pol העירורים, הטיות ב מערכת אופטית, ושולי הפרעה. כדי להפחית את תופעות הללו, לנרמל את יחסי P / S ממתקבלים מפליטה עשתה ליחס שהתקבל בתמיסה המכילה 10 rhodamine מ"מ ^18.
3. Exocytosis של DCVs הפרט בא לידי ביטוי משינוי פתאומי בעוצמה של חלבון שלפוחית ​​ניאון, כגון Synaptotagmin-1 pHluorin (איור 2). להבחין בשינויים ב+2 S P / S ו-P על ידי ממוצעים של פיקסלים בהחזר על השקעת רדיוס 240 ננומטר מרוכז על עליות מקומיות בP / Sיחס באתרים של exocytosis. כאשר היתוך מתרחש ללא עלייה ניכרה בP / S, את ההחזר על ההשקעה היא מרוכז על האזור של DCV פיוזינג.
4. ניתן לבצע סימולציות מחשב כדי לפרש P / S ו-P +2 שינויי עוצמת קרום S במונחים של גיאומטריה פשוטה של נקבובית היתוך מתרחב. לפרטים של הסימולציות, אנא ראה Anantharam et al. ¹⁸

תוצאות

שיטות הדמיה קונבנציונליות TIRFM ומקוטבות מיושמות על אותו שולחן האוויר. התצורה של האלמנטים אופטיים היא דומה, עם ההבדל העיקרי שאור העירור מקוטב (איור 1 א). אור מקוטב מעדיף מרגש fluorophores עם הדיפולים קליטה בכיוון הקיטוב. כך, pTIRFM להיות יעיל במעקב אחר שינויי טופולוגי קרום, הבדיקה המשמשת חייבת intercalate בקרום עם נטייה קבועה. צבעי carbocyanine הניאון (DiI, עשו) intercalate לbilayers שומנים באופנה עם אוריינטציה הדיפולים מעבר במטוס הקרום (איור 1). תאורה מקוטבת P (איור 1 ג) של קרומים עשו כותרת באופן סלקטיבי מרגשת fluorophores coverslip-אלכסוני (באדום באיורים 1B ו 1D).

תיוג קרום שופע של תאי chromaffin מושגת לאחר abדגירה Rief עם עשיתי. איור 2 א מראה דוגמא של קרום תא, שהוא מוכתם כן. תא בריא, חסיד יפגין הבדלים ברורים בפליטות P ו-S. תמונת פליטת P תערוכות גבול תא בהיר ביחס לשאר תא. תמונת פליטת S תערוכות הקרינה אחידה פחות או יותר על פני טביעת התא. +2 תמונות S P פיקסל לפיקסל מחושב / S ו-P רגישות לעקמומיות הממברנה וריכוז צבע, בהתאמה. תא chromaffin הראה גם כבר transfected עם Synaptotagmin-1 pHluorin (Syt-1) לתווית שלפוחיות הפרשה (איור 2).

תא chromaffin מגורה עם 56 מ"מ KCl לdepolarize קרום התא ולגרום exocytosis. מספר מקומות Syt-1 pHluorin מאור ניאון פתאום יתברר כפתיל DCVs (איור 2, פנל מימין). קופסא לבנה מצוירת מסביב אירוע היתוך אחד (איור 2, פנל מימין). i אירוע היתוך זהs ניתח ב2C דמויות ו2D. איור 2C מראה שינויי מסגרת לפי המסגרת בSyt-1-pHluorin, P / S, ו-P +2 עוצמות תמונת S. עוצמת הקרינה של Syt-1 מפחיתה במהירות כמו החלבון מתמוסס ממקום ההיתוך (איור 2 ד). כניסת המייצגים מורכבת קרום שלפוחית ​​/ פלזמה התמזגו פוחתת בקצב איטי יחסית (הערה גרפים באיור 2 ד). האיור (2E איור) מתאר פרשנות אחת של מדידות אלה.

העיוותים הקרום המהירה ומקומיות שמוצגים באיור 2 הן תוצאה של Ca ^{2 +} זרם עורר גירוי. זו מוצגת באיור 3 א. תא chromaffin הוא transfected עם Ca ^{2 +} המחוון הגנטי GCaMP5G ^21,22 ומגורה עם 56 מ"מ KCl. שלילת קוטביות קרום גורמת לעלייה משמעותית בקרינת GCaMP5G ( ng> איורים 3 א ו 3 ב) מסמן עלייה בsubplasmalemmal ^{2 +} רמות Ca. אזור פיקסל 30 x 20 של התא נבחר ושינויי מסגרת לפי המסגרת בGCaMP5G, P / S, ו-P +2 עוצמות פיקסל S מופיעים בתמונות (איור 3 ב) וגרפים (איור 3 ג). זמן "0" מציין את המסגרת לפני שינוי P / S הוא ברור (כלומר המסגרת לפני exocytosis). ראשי החץ הלבנים מעידים על כך שעיוות הקרום (העלייה בP / S) מלווה בירידה ב+2 פליטת S P. חלבון GCaMP5G cytosolic נשלל מהאזור על ידי DCV התמזגו. הערה גם הירידה הפתאומית בעצמת GCaMP5G בזמן 0 באיור 3 ג, פנל שמאלי. עליית תוחלת חיים ארוכת בP / S והירידה בS +2 P מציעים נקבובית היתוך שמרחיב לאט (איור 3D).

/ Files/ftp_upload/51334/51334fig1.jpg "/>
איור 1. איורים לטכניקת pTIRFM. א) סכמטית לשילוב קונבנציונלי עם TIRF הדמיה מבוסס קיטוב מוצגת. צלחת רבע גל (QW) ממוקמת מול לייזר ספיר 561 ננומטר לקטב את קרן הלייזר באליפסות. קוביית קיטוב (PC1) משמשת להפרדה בין קיטובים למרכיבים אנכיים ליניארי (v) ואופקי (ח). הרכיבים האנכיים ואופקיים הפכו את p-Pol והקורות עירור s-pol, בהתאמה, על פני השטח TIR. נתיבי p-Pol ו-S-Pol מנופצים באופן עצמאי (S1 ו S2). הם recombined עם מראות וקובייה שנייה קיטוב (PC2.) הם מצטרפים לקרן 488 ננומטר (גם מוגף באופן עצמאי, S3) באמצעות אלמנט היגוי קרן בהיקף של מראה וnonpolarizing מראה dichroic (DC). עדשות (L) משמשות כדי להרחיב ולמקד את האלומות. קורות 488 ננומטר ו561 ננומטר בשילובם הובילו ליציאת תאורת צד של המיקרוסקופ באמצעות Galvanoמראות מטר (GM). הם מתמקדים למטוס בחזרה המוקד (BFP) של המטרה. תיוג פוטונים הנפלטים מfluorophores נלכדים במצלמת EMCCD מחוברת למחשב. ב ') עשה מבוצע על ידי דוגרים בקצרה תאים עם הצבע ושטיפה שוב ושוב כדי להסיר את העודפים. עשיתי intercalates בקרום עם רגעי דיפול מעבר שלה פחות או יותר במישור הממברנה. C) אירוע האור המקוטב במישור של שכיחות (p-POL) יוצר שדה חלוף שהוא בעיקר מקוטב רגיל לממשק, כפי שמוצג. D) תאורה של קרום עשה שכותרתו עם אור מקוטב p סלקטיבי תלהיב אלה fluorophores כי הם coverglass-אלכסוני (באדום). אם זה היה שדה חלוף מקוטב של, אלה fluorophores שמקביל לcoverglass יהיה נרגש במקום (שחור).

איור 2. טרונג> עיוותים קרום תא ניטור עם pTIRFM. א) תמונות פליטת הגלם P ו-S יחד עם מחושב P / S ו-P +2 תמונות פליטת S מוצגות. סרגל קנה מידה, 3.2 מיקרומטר. ב ') תא chromaffin להביע Syt-1 pHluorin הוא depolarized עם KCl. מספר המקומות במאור ניאון (פנל מימין) מצביע על השילוב של DCVs הבודד. סרגל קנה מידה, 3.2 מיקרומטר. C) תמונות מסגרת לפי מסגרת של pHluorin DCV Syt-1 פיוזינג. פעמים (מעל תמונות) הן בשניות. זמן 0 מציין מסגרת לפני ההיתוך של DCV. +2 תמונות פליטת S P מקבילים / S ו-P מוצגות גם. . סרגל קנה מידה הוא 1 מיקרומטר D) גרפים עבור תמונות בקו ג המנוקד הוא בזמן - 0. מסגרת ההיתוך ה) פרשנות אפשרית אחת התוצאות ב-C ו-D מוצגת. ריק "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. עיוותים הן תוצאה של Ca ^{2 +} זרם עורר גירוי. א) תא chromaffin transfected עם GCaMP5G הוא depolarized 56 מ"מ KCl. גידול וכתוצאה מקרינת GCaMP5G מסמן עלייה בsubplasmalemmal Ca ^{2 +} רמות. ב ') תמונות מסגרת לפי מסגרת של 30 x 20 אזור פיקסל של תא בא טיימס מעל תמונות הן בשניות. ראשי חץ לבנים מצביעים על אזור של גידול P / S ו-P +2 ירידת S. חלבון Cytosolic GCaMP5G לא נכלל באזור על ידי DCV פיוזינג. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר. C) גרפים לתמונות שמוצגים בB. ד) פרשנות אפשרית אחת התוצאות בB ו-C מוצגת.3highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מצלמה iXon3 EMMCD	אנדור	897
IX81 הפוך מיקרוסקופ	אולימפוס		Filtercube עצרת צד רכוב
לייזר 43 הסדרה Ar-Ion	CVI אופטיקה לייזר Griot המיל	543-AP-A01	מתכונן ל488 ננומטר
ספיר 561 LP דיודת ליזר	קוהירנט		561 ננומטר
מערכת סריקת מירור galvo	Thorlabs	GVS102
מערכת זלוף VC ערוץ 3 הפוקוס	ALA מכשירים מדעיים	ALA VC3X4PP
QMM קוורץ MicroManifold	ALA מכשירים מדעיים	ALA QMM-4
וסת לחץ 10 psi	ALA מכשירים מדעיים	ALA PR10
מניפולטור	Burleigh	TS 5000-150
פלייט הרובע-Wave רכוב Achromatic	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680 ננומטר המקטב beamsplitter קובייה	Thorlabs	PBS201
גלגל צפיפות שש תחנה ניטרלי	Thorlabs	FW1AND
SmartShutter צעד מנוע מונע	מכשירי סאטר	IQ25-1219
סינון HQ412lp Dichroic	Chroma	NC255583	מצטרף 488 ננומטר ו561 קורות ננומטר
מצופה Plano-קעור עדשה	אדמונד אופטיקה	100mm PCV VIS 0	סוטה 488 קרן ננומטר
מצופה Plano-קעור עדשה	אדמונד אופטיקה	250mm PCV VIS 0	סוטה 561 קרן ננומטר
מצופים Plano-קמורות עדשות	אדמונד אופטיקה	PCX 125mm VIS 0	מתמקד הן הקורות
מצופים Plano-קמורות עדשות	אדמונד אופטיקה	50mm PCX VIS 0	ביצרו לסנן הרכבה קובייה
z488/561rpc Dichroic	Chroma	z488/561rpc	dichroic Filtercube
סינון z488/561_TIRF פליטה	Chroma	z488/561m_TIRF	פליטת Filtercube
מטרת UIS2 60x	אולימפוס	UPLSAPO 60XO	NA 1.37
מערכת Transfection ניאון	Invitrogen	MPK 5000
MetaMorph תוכנת הדמיה	התקנים מולקולריים
DiI ממברנה דיי	Invitrogen	V-22,885	למטרות כיוונון
TH Liberase	רוש	5401135001
TL Liberse	רוש	5401020001
אני DNAse סוג IV משור	סיגמא	D5025
Hemocytometer	דיג	0267110
עשיתי ממברנה דיי	Invitrogen	D-7757
Rhodamine	Invitrogen	R634
0.22 מיקרומטר יחידת מסנן ממברנה מזרק	Millipore	SLGS033SS
Fluoresbrite האדום מיקרוסכמות צבעוני	Polysciences	19507	0.5 מיקרומטר
שמן טבילה	סיגמא	56822
LabVIEW	מכשירים לאומיים		פקדי galvo מראות
ספינר צפחת	בלו	1965-00,250

טבלת 1. ציוד pTIRF מיקרוסקופית.

תוכן	Prep-PSS	Basal-PSS	Stim-PSS
NaCl	145 מ"מ	145 מ"מ	95 מ"מ
KCl	5.6 מ"מ	5.6 מ"מ	56 מ"מ
MgCl 2	-	0.5 מ"מ	0.5 מ"מ
CaCl 2	-	2.2 מ"מ	5 מ"מ
HEPES	15 מ"מ	15 מ"מ	15 מ"מ
pH	7.4	7.4	7.4
גלוקוז	2.8 מ"מ	5.6 מ"מ	5.6 מ"מ
העט סטרפטוקוקוס	1x	-	-

טבלה 2. זלוף ופתרונות הכנת תא chromaffin.

תוכן	Electroporating מדיה	ציפוי מדיה רגילה	2x אנטיביוטי מדיה
1x DMEM/F-12	1 מיליליטר / צלחת	2 מיליליטר / צלחת	1 מיליליטר / צלחת
FBS	10%	10%	10%
ציטוזין Arabinofuranoside (CAF)	-	μl 1 / מיליליטר מ10 מלאי מ"מ	-
פניצילין	-	100 יחידות / מיליליטר	200 יחידות / מיליליטר
סטרפטומיצין	-	100 מיקרוגרם / מיליליטר	200 מיקרוגרם / מיליליטר
Gentamycin	-	25 מיקרוגרם / מיליליטר	50 מיקרוגרם / מיליליטר

לוח 3. מדיה נייד chromaffin.

תוכן	TH-PSS	TL-PSS
Liberase TH	2 מיליליטר	-
Liberase TL	-	0.85 מיליליטר
Prep-PSS	98.0 מיליליטר	84.0 מיליליטר
DNase	8.75 מ"ג	7.4 מ"ג

לוח 4. פתרונות TH-PSS וTL-PSS.

Discussion

TIRFM מבוסס קיטוב מזהה שינויים מהירים, submicroscopic בטופולוגיה הממברנה. יישום הטכניקה הוא פשוט יחסית, במיוחד אם אופטיקה TIRF כבר נמצא במקום. כל מה שצריך הוא צלחת רבע גל, שתי קוביות קיטוב, ותריסים על מנת להפריד בין נתיבי p-Pol ותאורת s-Pol. המיקום המדויק של רכיבים אלה על השולחן בדרך כלל מוכתב על ידי מקום פנוי.

על מנת לקבל מידע טופולוגי קרום, הבדיקה הניאון משמשת צריכה intercalate עם נטייה קבועה או ידועה. הטכניקה, כפי שתוארה במאמר זה, מניחה את השימוש של צבעי carbocyanine אבל צבעים אחרים, כגון FM1-43 ^14, עשויים לשמש גם. ההליך מכתים הקרום עצמו הוא פשוט. תאים בתרבית רק דורשים חשיפה קצרה מאוד (פחות מ -10 שניות) לכמות קטנה של DiI / עשתה כדי לקבל תיוג צוהל של הממברנה. הוספת עודפי צבע מובילה לaggreg פיזור אוראטס על הזכוכית שמפחיתה את איכות תמונה. תאים דוגרים מעל עם צבע מוביל לצבוע את ההפנמה שבה יש השפעות מזיקות על איכות תמונה ואולי כדאיות תא. אם תא מוכתם היטב, יהיה הבחנה ברורה בתמונות פליטת P ו-S. כפי שניתן לראות באיור 2 א, פליטת P תהיה בבהירות להדגיש אזורים של הקרום שהם אלכסוניים coverslip (כלומר הקצוות של טביעת רגל התא) ואילו עוצמת פליטת S תהיה בערך אחידה על פני טביעת התא. אם הבחנה ברורה בין P ו-S אינה נראית לעין, אז זה אפשרי כי התא הוא דבק בצורה גרועה למצע או קרום התא הוא לא בריא, והתא אינו משמש לניסויים.

המחקרים הקודמים שלנו מתארים pTIRFM מנוצלים DiI כמו חללית קרום הניאון. כאן, אנו מנצלים עשינו כי הוא מתאים לניסויי הדמיה כפול צבע שמעסיקים GFP / pHluorin כfluorophore האחר. אנו לרגש wi עשהה לייזר 561 ננומטר ולא לייזר 640 ננומטר (שהוא קרוב יותר לשיא העירור שלה), כי מלביני fluorophore במהירות רבה יותר ב640 ננומטר. למרות שליזר ננומטר 561 הוא על הזנב של עשה ספקטרום העירור פורסם של, קרינה הנפלטת ביעילות. יתרון נוסף של לייזר ננומטר 561 הוא שזה מרגש את שניהם DiI ועשה מה שמאפשר לנו להשתמש באותה התקנת קיטוב עבור שני הבדיקות. שים לב שהנטייה של fluorophore בקרום תשפיע על הפרשנות של טופולוגיה הממברנה. לדוגמא, אם fluorophore היה בכיוון עם הדיפולים המעבר שלה בניצב למישור הקרום (ולא מקביל, או כמעט במקביל, כפי שקורה עם DiI או לא), ואז אזורי קרום nonplanar יהיו בקלות רבה יותר מודגש על ידי S ולא פליטת P.

יש לנו גם תיארו טכניקות לבידוד וelectroporation של תאי chromaffin יותרת הכליה שור. תא chromaffin השור הוא ים מצויןמודל ecretory. יש לו את היתרונות של להיות קל לשמור בתרבות, מגיבה למגוון רחב של secretogogues, ובעל שלפוחית ​​הפרשה גדולה שהם דמיינו בקלות עם מיקרוסקופ אור הקונבנציונלית. כדי לבטא חלבוני ניאון, תאי electroporated בהשעיה לפני ציפוי במנות תרבות שטופלה קולגן. מניסיוננו, יעילות ביטוי הוא הרבה יותר גבוה מאשר עם electroporation עם או Ca ^{2 +-phosphate} או חומרים כימיים Lipofectamine. החסרון של electroporation הוא שזה דורש יותר תאים (כפי שרבים לא שרד את התהליך) וחומרים כימיים מסחריים יקרים. מסיבות שאינן ברורים לנו, לא כל קרום משלב עשה. בנוסף, רק חלק קטן של התאים בצלחת הם transfected. מציאת תאים שהם transfected והם מוכתמים גם עם לא יכולים להיות זמן רב ולכן אופטימיזציה של תנאים להכתמה וelectroporation הוא גם שווה את המאמץ.

לסיכום, זהסעיף המלחמה מתארת ​​כיצד pTIRFM מיושם כדי לפקח על העיוותים קרום המהירה ומקומיות המתרחשות במהלך שילוב של שלפוחית ​​ליבה צפופה בתאי chromaffin שור. אמנם רק אחד יישום נדון, הטכניקה היא אידיאלית עבור חקר תהליכים ביולוגיים אחרים הכרוכות בשינויים בצורת קרום, כולל אנדוציטוזה, cytokinesis, ותנועתיות תא.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
iXon3 EMMCD Camera	Andor	897
IX81 Inverted Microscope	Olympus		Side-mounted Filtercube Assembly
43 Series Ar-Ion Laser	CVI Milles Griot Laser Optics	543-AP-A01	Tunable to 488nm
Sapphire 561 LP Diode Laser	Coherent		561nm
Scanning Galvo Mirror System	Thorlabs	GVS102
VC3 Channel Focal Perfusion System	ALA Scientific Instruments	ALA VC3X4PP
QMM Quartz MicroManifold	ALA Scientific Instruments	ALA QMM-4
10 PSI Pressure Regulator	ALA Scientific Instruments	ALA PR10
Manipulator	Burleigh	TS 5000-150
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube	Thorlabs	PBS201
Six Station Neutral Density Wheel	Thorlabs	FW1AND
Stepper-motor Driven SmartShutter	Sutter Instruments	IQ25-1219
HQ412lp Dichroic Filter	Chroma	NC255583	Joins 488nm and 561nm beams
Coated Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 100mm VIS 0	Diverges 488nm beam
Coated Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 250mm VIS 0	Diverges 561nm beam
Coated Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 125mm VIS 0	Focuses both beams
Coated Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 50mm VIS 0	Cemented to filter cube assembly
z488/561rpc Dichroic	Chroma	z488/561rpc	Filtercube dichroic
z488/561_TIRF Emission Filter	Chroma	z488/561m_TIRF	Filtercube emission
UIS2 60x Objective	Olympus	UPLSAPO 60XO	NA 1.37
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK 5000
MetaMorph Imaging Software	Molecular Devices
DiI Membrane Dye	Invitrogen	V-22885	For Alignment Purposes
TH Liberase	Roche	5401135001
TL Liberse	Roche	5401020001
DNAse I Type IV from bovine	Sigma	D5025
Hemocytometer	Fisher	0267110
DiD Membrane Dye	Invitrogen	D-7757
Rhodamine	Invitrogen	R634
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit	Millipore	SLGS033SS
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres	Polysciences	19507	0.5 microns
Immersion Oil	Sigma	56822
LabVIEW	National Instruments		Controlls galvo mirrors
Spinner Flask	Bellco	1965-00250