حمل عضلية للبطانة الشريانية الحميد مقابل تصلب الشرايين في فئران: مقدمة من اثنين من نماذج صالحة

Mandy Stubbendorff; Xiaoqin Hua; Tobias Deuse; Ziad Ali; Hermann Reichenspurner; Lars Maegdefessel; Robert C. Robbins; Sonja Schrepfer

doi:10.3791/51459

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

هذا الفيديو يبين لنا نموذجين للتنمية وحة باطنة في الشرايين الفئران وتشدد على الاختلافات في تضخم عضلية للبطانة الشريانية وتصلب الشرايين.

Abstract

وقد وضعت مختلف في الجسم الحي نماذج القوارض المخبرية لتحريض تضيق الشريان لتقليد الأمراض التي تشمل تشكيل لوحة الشرايين وتضيق، كما لوحظ على سبيل المثال في مرض القلب الإقفاري. وقدم هنا - نموذجين الماوس تكرار للغاية - على حد سواء مما أدى إلى تضيق الشريان ولكن كل الكامنة طريقا مختلفة من التنمية. تمثل نماذج اثنين من الأسباب الأكثر شيوعا لتضيق الشريان؛ وهي ترد نموذج الفأر واحدة لكل تضخم عضلية للبطانة الشريانية، وتصلب الشرايين. للحث على تضخم عضلية للبطانة الشريانية، يتم إجراء القسطرة بالون إصابة في الشريان الأورطي البطني. لتطوير وحة تصلب الشرايين، وAPOE - يستخدم نموذج الفأر في تركيبة مع اتباع نظام غذائي الدهنية الغربية - /. تتم تسمية خيارات تكييفها نموذجا مختلفا لقياس وتقييم نتائج وصفها في هذه المخطوطة. إدخال ومقارنة هذين النموذجين يوفر المعلومات حول عمليةايون للعلماء لاختيار النموذج تضيق الشريان المناسبة وفقا لطلب مسألة علمية.

Introduction

في الدول الصناعية لا يزال مرض القلب الإقفاري السبب الرئيسي للوفيات ^1. أسباب تضيق الشريان التاجي هي متعددة وتشمل تضخم عضلية للبطانة الشريانية وكذلك تصلب الشرايين، مع عودة التوعي استراتيجية العلاج الأكثر شيوعا ² المتبقية. نماذج الأبحاث التي تميز بوضوح بين مسارات الميكانيكية للتضخم وتصلب الشرايين باطنة ضرورية للتحقيق في pathobiological والعمليات الفيزيولوجية المرضية في التنمية البلاك الشرياني. في هذا الفيديو يتم عرض نموذجين الماوس المختلفة المستخدمة لدراسة إما تطوير تضخم عضلية للبطانة الشريانية أو تصلب الشرايين.

وافترض تضخم عضلية للبطانة الشريانية عن طريق لتشكيل نموذج "استجابة إلى إصابة" وصفت في الأصل لتصلب الشرايين ^3. تعطيل الميكانيكية للطبقة البطانية يؤدي إلى إعادة مكثفة تتعزز الآثار نظير الصماوي. هناك عدة ديالنماذج الحيوانية fferent تستخدم عادة لدراسة تضخم عضلية للبطانة الشريانية. بعض الجماعات استخدام أجهزة معدنية في الشريان الأبهر الصاعد من الفئران ^4. كما يتم استخدام نموذج تعرية الأبهر يؤديها مع القسطرة بالون عادة في الفئران المختبرية ^5،6. نموذج تضخم باطنة أجريت في الفئران المعملية ⁷ ينفذ ربط الشريان السباتي ويدفع الآفات عضلية للبطانة الشريانية ^8. في مختبرنا، والبطن نموذج تعرية الأبهر - لدراسة تطوير تضخم عضلية للبطانة الشريانية - فضلا عن نموذج إنساني الدعامات عودة التضيق ⁹ يشيع استخدامها. ويؤكد هذا الفيديو أن اختيار نموذج حيواني التجريبية المناسبة أمر بالغ الأهمية للدراسات الآلية الفسيولوجية المرضية أو تضيق الشرايين من.

يجب التمييز بين نماذج تضخم عضلية للبطانة الشريانية من النماذج تصلب الشرايين. لهذا الأخير، ئي E-ناقصة (APOE - / -) الفئران بالاشتراك مع النظام الغذائي الغربي عادة ما تستخدم للحث على atherosclالآفات المثيرة ^{10،11،12،13.} وترد أمثلة للتحريض على حد سواء من هذه الأنواع من الأمراض عضلية للبطانة الشريانية في الفئران هنا، جنبا إلى جنب مع خيارات تكييفها نموذج مختلف لتحليل سفينة تضيق ^14.

Protocol

ينبغي تنفيذ جميع أعمال الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوانات ذات الصلة. الحصول على موافقة المؤسسية للعمل الحيوان قبل بداية البروتوكول.

1. عضلية للبطانة الشريانية الحميد نموذج (A)

لنموذج تضخم باطنة، وشراء C57BL/6J (المالية رقم 000664، C57BL/6J) الفئران في سن 8 أسابيع وزنها حوالي 25 غراما. الفئران منزل لهذه التجارب في ظل ظروف التقليدية؛ تغذية الفئران القياسية تشاو الماوس وتوفير المياه الإعلانية libitum.

إعداد الماوس: إدخال الماوس إلى حالة تخدير مع isoflurane و(2٪) باستخدام غرفة الاستقراء.
1. إزالة الشعر باستخدام البطن الانتهازي الشعر، ووضع الماوس على ظهرها وتغطية الأنف والفم مع قناع لضمان التخدير.
2. مع بروفو-اليود، وتطهير منطقة البطن عالميا، تليها 80٪ من الإيثانول، في دورتين.
3. أؤكد غيابمن ردود الفعل من قبل معسر أطرافهم هند لرصد عمق كاف من التخدير.
4. فصل الجلد والعضلات على طول الخط ألبا في خطوتين لفضح أعضاء البطن.
5. وضع الامعاء في المياه المالحة رطب القفازات. التفاف القفازات في جميع أنحاء الأمعاء للحفاظ على رطبة.
6. مسح بانتباه بعيدا عن الأنسجة الدهنية الأغطية الشريان الأورطي البطني. فضح الشريان الأورطي infrarenal وصولا الى التشعب لها، مع الحرص على عدم إصابة أي فرع السفن.
7. أولا، وضع المشبك المجهرية على الداني، الشريان الأورطي infrarenal لاغلاق تدفق الدم. الآن، وتطبيق المشبك القاصي الثاني المقبل إلى التشعب الأبهري.
8. عندما يتوقف تدفق الدم، وجعل شق صغير في الشريان الأورطي بالقرب من المشبك الداني.
9. إدراج القسطرة ذات الرؤوس البالون، والتي تم رطب مع 0.9٪ المالحة، والتقدم نحو المشبك القاصي من الشريان الأورطي.
10. لإصابة البطانية، تعرية الشريان الأورطي عن طريق تضخيم بالوناتن بعناية وببطء سحب القسطرة في اتجاه المشبك الداني.
11. تكرار مناورة تعرية مرتين.
12. إزالة القسطرة وإغلاق شق الأبهر باستخدام خيوط البرولين 10-0 على التوالي.
13. فتح بعناية المشبك البعيدة. في حالة نزيف في موقع بضع الأبهر، أغلق المشبك مرة أخرى، حدد موقع النزيف ووضع غرز توقف إضافية، عند الضرورة.
14. إذا يمكن ملاحظة عدم وجود نزيف، فتح ببطء المشبك الداني.
15. يجب أن يكون نبض الأبهر مرئية بشكل أقصى من شق. الآن الأمعاء يمكن ترتيب مرة أخرى في الموقع.
16. شطف تجويف البطن باستخدام ملحي معقم قبل حرارة.
17. إغلاق جدار البطن بدءا من طبقة العضلات باستخدام خيوط البرولين 6-0 على التوالي.
18. المقبل التكيف الجلد تحت استخدام 5-0 البرولين أداء الغرز التوالي.
19. خلال ذلك الوقت لا يزال تخدير الماوس، وتطبيق 4-5 ملغ / كغ كاربروفين عبر inje تحت الجلدكشن.
20. إضافة Metamizol لمياه الشرب (50 ملجم لكل 100 مل Metamizol) للسيطرة على الألم ويستمر لمدة 3 أيام الجراحة آخر. مراقبة الحيوانات في جميع أنحاء الانتعاش.
  ملاحظة: فترة المراقبة لهذا النموذج هو 28 يوما.

2. تصلب الشرايين نموذج (B)

لنموذج تصلب الشرايين، وشراء ئي (APOE - / -)-E ناقص الفئران (المالية رقم 002052، B6.129P2-Apoetm1Unc / J) في سن من 4 أسابيع، ومن ثم تغذية لمدة 4-6 أشهر. الفئران منزل لهذه التجارب في ظل ظروف التقليدية؛ إطعام الفئران حمية عالية الدهون لدى وصوله الغربية (هارلان معامل TD.88137) وتوفير المياه بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية لمدة 4 إلى 6 أشهر.

إعداد الماوس:
1. تغذية APOE - / - الفئران مع النظام الغذائي الغربي ابتداء من الساعة 4 أسابيع من العمر. وينبغي أن يبدأ التلاعب الغذائية مباشرة فور وصوله.
2. الحفاظ على النظام الغذائي الغربي طوال مدة التجربة.

3. تحليل

نموذج تضخم عضلية للبطانة الشريانية (A)
المنطقة من الاهتمام في هذا النموذج هو "منطقة الآفة". وتشمل الخيارات المتاحة لتحليل طمس اللمعية، نسبة I / M (نسبة البطانية / وسائل الإعلام)، وسمك myointima القصوى، منطقة عضلية للبطانة الشريانية، ثلاثي الألوان تلطيخ للكشف عن التليف، وH & E تلطيخ للخلايا وحيدة النواة (كما هو موضح في أرقام 1A-1C). وفقا لمسألة علمية عديدة stainings أخرى مثل الأحمر للPicrosirius الكولاجين، والمناعية، وطرق متحد البؤر يمكن تطبيقها.
نموذج تصلب الشرايين (B)
في المناطق ذات الاهتمام في هذا النموذج هي صمام الأبهر، قوس الأبهر وكذلك الشريان الأورطي النازل. خيارات للتحليل: السودان تلطيخ حمراء لثلاثي الألوان الدهون وتلطيخ من الصمام الأبهري، قوس الأبهر والشريان الأورطي تنازلي (كما هو موضح في الشكل 1D).
هذا النموذج أيضا ينتج مجموعة متنوعة من الخيارات الأخرى مثل تلطيخعلى سبيل المثال النفط O الأحمر لنسبة الدهون محايدة، Picrosirius الحمراء، المناعية، وطرق متحد البؤر.
1. السودان تلطيخ الأحمر: تنفيذ تلطيخ الأحمر السودان على الأنسجة الأبهر المقطوع حديثا.
  1. إزالة 6H النظام الغذائي قبل الحصاد.
  2. إدخال الماوس إلى حالة تخدير مع isoflurane و(2٪) باستخدام غرفة الاستقراء. أؤكد غياب ردود الفعل من قبل معسر أطرافهم هند لرصد عمق كاف من التخدير.
  3. فتح الصدر؛ قطعت قمة القلب ويروي عبر البطين الأيسر، أولا بمحلول ملحي (3 مل)، تليها PFA 4٪ (3 مل) من خلال جذر الأبهر لإصلاح الشريان الأورطي.
  4. تحرير الشريان الأورطي من الجذر إلى التشعب لها. محاولة إزالة الأنسجة الدهنية قدر المستطاع.
  5. تقطع القلب وجذر الشريان الأبهر، وتخزينها في 4٪ PFA لالأنسجة.
  6. لجذر الأبهر الأنسجة أن توضع بعناية في كتلة البارافين في وضع رأسي للسماح للقطع من منطقة المسؤوليةالتشنج الشرائح توليد الجذرية التي تعرض جميع منشورات صمامي 3.
  7. قطع واحدة من نهاية شجرة الأبهر وإصلاحه على طبقة من السيليكون مع دبابيس يرام. فتح الشريان الأورطي طوليا وإصلاح الأنسجة الأبهر.
  8. شطف الأنسجة مع 50٪ من الإيثانول. تزج الأنسجة مع السودان الثالث حل تلطيخ لمدة 15 دقيقة.
  9. شطف بخفة مع 50٪ من الإيثانول لإزالة الزائدة السودان الثالث. (ملاحظة: 50٪ من الإيثانول قد غسل الصبغة بعيدا.) شطف مع DH ₂ O، والتقاط الصور لمزيد من التحليل.

النتائج

ويبين الشكل 1 خيارات تحليل مختلفة، والدولة التي يسببها مرض لكلا النموذجين. لنموذج باطنة تضخم، يظهر تحليل المقاطع العرضية ممثل في تلطيخ ثلاثي الألوان. من هذه المقاطع العرضية، ونتائج مثل نسب I / M، أقصى سمك لوحة، أقصى سماكة باطنة في التجويف، طمس اللمعية في المئ?...

Discussion

على الرغم من أن كلا المرضين يؤدي إلى أعراض مماثلة في المريض، والآليات الكامنة للتنمية البلاك وبالتالي فإن أساليب علاجية مختلفة جدا ^2. في أشكال مختلفة من تضيق الشرايين تعتمد النتائج السريرية في المرضى، فضلا عن الإطار الزمني لتطوير وحة على الآلية الأساسية.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

المؤلفين أشكر كريستيان Pahrmann للحصول على المساعدة الفنية. تلقى SS بتمويل من جمعية الألمانية للبحوث (DFG) (SCHR992/3-2 وSCHR992/4-2).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thyoglycollate Broth 3%	Fluka	70157	powder
PFA 4%	Electron Microscopy Sciences	#157135S	20%
Sudan III staining solution	Sigma Aldrich	S4131	powder
mouse C57BL/6J	Jackson Laboratories	Stock # 0006664
mouse ApoE -/-	Jackson Laboratories	Stock #002052
Western Diet	Harlan Laboratories	TD.88137
hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	Abbott		Isoflurane
microsurgical clamp	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator	Fine Science Tools	18056-14
catheter
10-0 prolene suture	Ethicon	788G
6-0 prolene suture	Ethicon	8709H
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer		Carprofen
Metacam 1.5 mg/ml	Boehringer Ingelheim		Metamizol

References

Manuel, D. G., Leung, M., Nguyen, K., Tanuseputro, P., Johansen, H. Burden of cardiovascular disease in Canada. Can J Cardiol. 19, 997-1004 (2003).
ER, O. B., Ma, X., Simard, T., Pourdjabbar, A., Hibbert, B. Pathogenesis of neointima formation following vascular injury. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 11, 30-39 (2011).
Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. 362, 801-809 (1993).
Meng, X., Zhang, F., Valji, K., et al. Ultrasound guidance for the creation of a small animal model of aortic injury. J Vasc Interv Radiol. 22, 1193-1197 (2011).
Deuse, T., Koyanagi, T., Erben, R. G., et al. Sustained inhibition of epsilon protein kinase C inhibits vascular restenosis after balloon injury and stenting. Circulation. 122, 170-178 (2010).
Schrepfer, S., Deuse, T., Sultan, K. R., et al. Inhibition of restenosis development after mechanical injury: a new field of application for malononitrilamides. Cardiology. 108, 128-137 (2007).
Tao, M., Mauro, C. R., Yu, P., et al. A simplified murine intimal hyperplasia model founded on a focal carotid stenosis. Am J Pathol. 182, 277-287 (2013).
Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
Hua, X., Deuse, T., Michelakis, E. D., et al. Human internal mammary artery (IMA) transplantation and stenting: a human model to study the development of in-stent restenosis. J Vis Exp. , 3663 (2012).
Daugherty, A., Whitman, S. C. Quantification of atherosclerosis in mice. Methods Mol Biol. , (2003).
Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb. 14, 133-1340 (1994).
Zhang, Y., Li, L., You, J., Cao, J., Fu, X. Effect of 7-difluoromethyl-5, 4'-dimethoxygenistein on aorta atherosclerosis in hyperlipidemia ApoE(-/-) mice induced by a cholesterol-rich diet. Drug Des Devel Ther. 7, 233-242 (2013).
Rudolph, T. K., Rudolph, V., Edreira, M. M., et al. Nitro-fatty acids reduce atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 938-9345 (2010).
Rondelet, B., Kerbaul, F., Motte, S., et al. Bosentan for the prevention of overcirculation-induced experimental pulmonary arterial hypertension. Circulation. 107, 1329-1335 (2003).
Zeibig, S., Li, Z., Wagner, S., et al. Effect of the oxLDL binding protein Fc-CD68 on plaque extension and vulnerability in atherosclerosis. Circ Res. 108, 695-703 (2011).
Painter, T. A. Myointimal hyperplasia: pathogenesis and implications. 2. Animal injury models and mechanical factors. Artificial organs. 15, 103-118 (1991).
Nitschke, Y., Weissen-Plenz, G., Terkeltaub, R., Rutsch, F. Npp1 promotes atherosclerosis in ApoE knockout mice. Journal of cellular and molecular. 15, 2273-2283 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

87 neointima APOE

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: