Склонение Myointimal гиперплазия против атеросклероза у мышей: Введение двух допустимых моделей

Резюме

Это видео показывает две модели развития бляшек интимы в мышиных артерий и подчеркивает различия в myointimal гиперплазии и атеросклероза.

Аннотация

Различные IN VIVO модели лабораторных грызунов для индукции стеноза артерии были созданы, чтобы имитировать заболеваний, которые включают артериальную образование бляшек и стеноза, как это наблюдается, например при ишемической болезни сердца. Два очень воспроизводимые модели мыши - как в результате чего стеноза артерии, но каждый, лежащие в основе другой путь развития - вводятся здесь. Модели представляют собой две наиболее распространенные причины стеноза артерии; а именно одна модель мыши для каждого myointimal гиперплазии и атеросклероз показаны. Чтобы вызвать гиперплазию myointimal, баллонный катетер травма брюшной аорты выполняется. Для развития атеросклеротической бляшки, ApoE - / - модель мыши в сочетании с западной жирной диете используется. Различные варианты модели приспособлены для измерения и оценки результатов названы и описаны в этой рукописи. Введение и сравнение этих двух моделей обеспечивает информаион ученым выбрать подходящий артерии стеноз модель в соответствии с научной вопрос, заданный.

Введение

В промышленно развитых странах ишемическая болезнь сердца остается основной причиной смертности ^1. Причины стеноза коронарных артерий, весьма разнообразны и включают в себя myointimal гиперплазии, а также атеросклероза, с реваскуляризации оставшегося наиболее распространенные стратегии лечения ^2. Исследовательских моделей, которые четко отличают между механистической путей гиперплазии интимы и атеросклероз имеют важное значение для расследования патобиологические и патофизиологические процессы в развитии артериальной бляшки. В этом видео две различные модели мыши используются для изучения либо развитие myointimal гиперплазии или атеросклероза вводятся.

Myointimal гиперплазия постулируется, чтобы сформировать с помощью "ответ-на-травмы" парадигмы первоначально описанной для атеросклероза ^3. Механическое разрушение эндотелиальный слой приводит к интенсивному ремоделирования усиливается паракринных эффектов. Есть несколько диразличны х животных моделях обычно используется для изучения myointimal гиперплазии. Некоторые группы используют металлические устройства в восходящей аорты крыс ^4. Аорты оголение модель выполнена с баллонного катетера также широко используется в лабораторных крыс ^5,6. Гиперплазия интимы модель выполняется в лабораторных мышей ⁷ реализует лигирование сонной артерии и вызывает myointimal поражений ^8. В нашей лаборатории, брюшной аорты модель оголение - изучить развитие myointimal гиперплазии, - а также модель гуманизированный рестеноза стента ⁹ обычно используются. Это видео подчеркивается, что выбор надлежащего экспериментальную животную модель имеет решающее значение для механистической или патофизиологических исследований стеноза артерии.

Myointimal модели гиперплазия следует отличать от моделей атеросклероза. Что касается последнего, аполипопротеина Е-дефицитных (ApoE - / -) мышей в сочетании с западной диеты, как правило, используется, чтобы вызвать atherosclэротические поражения ^10,11,12,13. Примеры индукции оба из этих типов myointimal заболевания у мышей показано здесь, вместе с различных модельных адаптированных вариантов для анализа сосудов стеноз ^14.

протокол

Все животные работа должна проводиться в соответствии с соответствующими руководящими принципами по уходу за животными. Получить институциональной разрешение на животных работе до протоколу начало.

1. Myointimal гиперплазия Модель (А)

Для гиперплазии модели интимы, приобрести C57Bl/6J (инвентарный номер 000664, C57BL/6J) мышей в возрасте 8 недель с массой тела около 25 г. Мышей Дом на этих экспериментов в обычных условиях; кормить мышей стандартное чау-чау мыши и предоставить воду по желанию.

1. Подготовка Мышь: Представьте мышь, чтобы анестезирующего государства изофлураном (2%) с использованием индукции камеру.
   1. Снимите брюшной волосы с помощью волос триммер, лежал мышь на спину и покрыть его нос и рот маски для лица для обеспечения анестезии.
   2. С Прово-йод, дезинфекции области живота универсально, а затем 80%-ного этанола, в двух циклах.
   3. Убедите отсутствиерефлексов, зажимая задней конечности следить за достаточной глубины анестезии.
   4. Отделите кожу и мышцы вдоль белой линии в два этапа по разоблачению органы брюшной полости.
   5. Положите кишечник в солевом увлажненной перчатки. Оберните перчатку вокруг кишечника, чтобы держать их влажными.
   6. Внимательно убрать жировую ткань листового материала брюшной аорты. Expose инфраренальной аорты вплоть до ее бифуркации, стараясь не травмировать любом отделении суда.
   7. Во-первых, разместить микрохирургической зажим на проксимальных, инфраренальной аорты закрыть кровоток. Теперь, нанесите второй дистальный зажим рядом с бифуркации аорты.
   8. Когда кровоток прерывается, сделать небольшой разрез в аорту, близкой к проксимального зажима.
   9. Вставьте воздушный шар наконечником катетера, который был увлажненной 0,9% солевой раствор, и продвигать по направлению к дистальному зажима аорты.
   10. Для повреждение эндотелия, оголять аорту, раздувая Ballooн осторожно и медленно вытягивать катетер в направлении проксимального зажима.
   11. Повторите денудации маневр дважды.
   12. Снимите катетер и закрыть аорты разрез с помощью 10-0 PROLENE эксплуатационные швов.
   13. Осторожно открывают дистальный зажим. В случае кровотечение в aortotomy сайта, закройте зажим снова обнаружить кровотечение и разместить дополнительные прерванные швы, по мере необходимости.
   14. Если нет кровотечения не наблюдается, медленно откройте ближний зажим.
   15. Аортальный импульс должен быть виден в дистальном направлении от разреза. Теперь кишечник могут быть организованы назад на месте.
   16. Промойте брюшной полости с использованием подогретого стерильного физиологического раствора.
   17. Закройте брюшная стенка начиная с мышечного слоя с использованием 6-0 проленовой эксплуатационные швов.
   18. Следующая адаптировать кожу под использование 5-0 PROLENE выполнения текущих швов.
   19. Во время мышь все еще под наркозом, применять 4-5 мг / кг Carprofen через подкожной Injeводств.
   20. Добавить метамизол к питьевой воде (50 мг метамизол на 100 мл) для контроля боли и продолжают в течение 3 дней после операции. Монитор животное в течение восстановления.
       Примечание: Период наблюдения для этой модели составляет 28 дней.

2. Атеросклероз модели (B)

Для модели атеросклероза, приобрести недостатком алипопротеина (ApoE - / -) мышей (инвентарный номер 002052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J) в возрасте 4 недель, а затем подается в течение 4-6 месяцев. Мышей Дом на этих экспериментов в обычных условиях; кормить мышам высокую липидный западную диету по прибытии (Харлан лаборатории TD.88137) и обеспечить воду без ограничений в течение от 4 до 6 месяцев.

1. Подготовка Мышь:
   1. Поток ApoE - / - мыши с западной диеты, начиная с 4-недельного возраста. Диетические манипуляции следует начинать непосредственно по прибытии.
   2. Поддерживать западную диету в течение продолжительности эксперимента.

3. Анализ

1. Myointimal модель гиперплазия (А)
   Область интереса к этой модели является "поражение площадь". Варианты анализа включают в себя просвета облитерации, отношение I / M (отношение интима / медиа), максимальная толщина myointima, myointimal область, Trichrome окрашивание фиброза и H & E окрашивание на мононуклеарных клеток (как показано на фиг.1А-1С). Согласно научным вопросом многие другие окрашивания как Picrosirius красный для коллагена, иммуногистохимии и конфокальной методов могут быть применены.
2. Атеросклероз модель (B)
   Области интереса к этой модели аортальный клапан, дуги аорты, а также нисходящей аорты. Опции для анализа: Судан красный окрашивания для липидов и трехцветный окрашивания аортального клапана, дуги аорты и нисходящей аорты (как показано на рисунке 1D).
   Эта модель также дает множество других вариантов окрашивания, какнапример нефтяной Red О нейтральных липидов, Picrosirius красный, иммуногистохимии и конфокальной методов.
   1. Красный окрашивание Судан: Выполните красную окраску Судан на свеже собранного аорты ткани.
      1. Снимите диеты 6h до сбора урожая.
      2. Представьте мышь, чтобы анестезирующего государства изофлураном (2%) с использованием индукции камеру. Убедите отсутствие рефлексов, зажимая задней конечности следить за достаточной глубины анестезии.
      3. Откройте сундук; отрезать верхушки сердца и заливать через левый желудочек, сначала насыщенным раствором соли (3 мл), а затем 4% PFA (3 мл) через корня аорты, чтобы зафиксировать аорты.
      4. Освободите аорту от корня к ее бифуркации. Попробуйте удалить жировой ткани как можно больше.
      5. Отрежьте сердце и корня аорты, и хранить их в 4% PFA для гистологии.
      6. Для гистологии корень аорты должен тщательно быть помещены в парафиновый блок в вертикальном положении, чтобы позволить вырубку ЗОтик корень генерирующие слайды, которые отображают все 3 клапанных листовки.
      7. Отрежьте один конец аорты дерева и исправить ее на силиконового слоя с мелкими контактов. Откройте аорты в продольном направлении и зафиксировать аорты ткани.
      8. Промыть ткань с 50%-ным этанолом. Погрузите ткань с Судан III красящим раствором в течение примерно 15 мин.
      9. Промойте слегка с 50% этанола, чтобы удалить избыток Судан III. (Примечание: 50% этанола может вымыть краску прочь.) Промыть дН ₂ O, и сделать фотографии для дальнейшего анализа.

Результаты

На рисунке 1 показаны различные варианты анализа и индуцированное болезненное состояние для обеих моделей. Для модели гиперплазии интимы, анализ представительств сечений в трихромом окрашивания показана. Из этих сечений, результаты, как в / м нормативов, максимальной толщино?...

Обсуждение

Хотя оба заболевания приводят к похожими симптомами у пациента, основные механизмы развития бляшек и, следовательно, подходы к лечению очень разные ^2. В различных формах стеноза артерии клинические результаты у больных, а также временные рамки развития бляшки зависит от базового...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Catalog number	Comments
Thyoglycollate Broth 3%	Fluka	70157	powder
PFA 4%	Electron Microscopy Sciences	#157135S	20%
Sudan III staining solution	Sigma Aldrich	S4131	powder
mouse C57BL/6J	Jackson Laboratories	Stock # 0006664
mouse ApoE-/-	Jackson Laboratories	Stock #002052
Western Diet	Harlan Laboratories	TD.88137
hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	Abbott		Isoflurane
microsurgical clamp	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - 4mm
clamp applicator	Fine Science Tools	18056-14
catheter
10-0 prolene suture	Ethicon	788G
6-0 prolene suture	Ethicon	8709H
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer		Carprofen
Metacam 1.5mg/ml	Boehringer Ingelheim		Metamizol