גרימת Myointimal היפרפלזיה נגד טרשת עורקים בעכברים: מבוא של שני מודלים חוקיים

Summary

וידאו זה מראה שני מודלים של פיתוח פלאק בעורקי intimal עכבריים ומדגיש את ההבדלים בהיפרפלזיה myointimal וטרשת עורקת.

Abstract

במודלים של מכרסמים מעבדה שונים vivo לאינדוקציה של היצרות של עורק הוקמו כדי לחקות מחלות הכוללות היווצרות הפלאק בעורקים והיצרות, כפי שנצפה לדוגמא במחלת לב איסכמית. שני דגמים מאוד לשחזור עכבר - שניהם וכתוצאה מכך היצרות של עורק אבל בכל בסיס מסלול של פיתוח שונה - הם הציגו כאן. המודלים מייצגים את שתי סיבות השכיחות ביותר של היצרות של עורק; כלומר מודל אחד עכבר עבור כל היפרפלזיה myointimal, טרשת עורקים מוצגים. כדי לגרום להיפרפלזיה myointimal, פגיעת קטטר בלון של אב העורקים בבטן מבוצעת. להתפתחות של רובד טרשתי, ApoE - משמש מודל העכבר בשילוב עם דיאטת שומן מערבית - /. אפשרויות מותאמות מודל אחרים למדידה וההערכה של התוצאות בשם ותיארו בכתב היד הזה. ההקדמה והשוואה בין שני מודלים אלה מספק informatיון למדענים לבחור את מודל היצרות של עורק המתאים בהתאם לשאלה המדעית שאלה.

Introduction

במדינות מתועשות מחלת לב איסכמית נשארה גורם מוביל לתמותת ^1. הגורמים להיצרות של עורקים הכליליים הם מגוונים וכוללים היפרפלזיה myointimal כמו גם טרשת עורקים, עם revascularization נותר אסטרטגית הטיפול הנפוצה ביותר ^2. מודלים מחקר שלהבחין בין המסלולים מכניסטית של היפרפלזיה intimal וטרשת עורקת באופן ברור הם חיוניים כדי לחקור את pathobiological ותהליכי pathophysiological בפיתוח פלאק בעורקים. בסרטון הזה שני דגמי עכבר שונים המשמשים ללימודים או ההתפתחות של היפרפלזיה myointimal או טרשת עורקים הם הציגו.

היפרפלזיה Myointimal הוא הניח ליצירת באמצעות פרדיגמה "תגובה לפציעה" שתוארה במקור לטרשת עורקת ^3. ההפרעה מכאנית של שכבת האנדותל מובילה לשיפוץ אינטנסיבי משופר על ידי אפקטים אוטוקריני. ישנם כמה diמודלים של בעלי החיים fferent הנפוצים ללמוד היפרפלזיה myointimal. חלק מהקבוצות משתמשות בהתקני מתכת באב העורקים העולה של חולדות ^4. מודל denudation אב העורקים בוצע עם צנתר בלון הוא גם בשימוש נפוץ בחולדות מעבדה ^5,6. מודל היפרפלזיה intimal שבוצע בעכברי מעבדה ⁷ מיישם קשירה של עורק הצוואר וגורם לנגעי myointimal ^8. במעבדה שלנו, מודל denudation אב העורקים בבטן - כדי ללמוד את ההתפתחות של היפרפלזיה myointimal - כמו גם דגם restenosis סטנט האנושי ⁹ משמשים בדרך כלל. וידאו זה מדגיש כי בחירת מודל החיה הניסיונית הנכון היא קריטית עבור מחקרים מכניסטית או pathophysiologic של היצרות העורק.

מודלים היפרפלזיה Myointimal יש להבחין בין מודלים טרשת עורקים. באפשרות השנייה, (ApoE - / -) E-חסר אפוליפופרוטאין עכברים בשילוב עם תזונה מערבית משמשים בדרך כלל כדי לגרום atherosclנגעים ארוטיים ^10,11,12,13. דוגמאות לאינדוקציה של שני סוגים אלה של מחלה בעכברי myointimal מוצגות כאן, יחד עם אפשרויות מותאמות מודל שונים לנתח היצרות כלי ^14.

Protocol

כל העבודה של בעלי החיים צריכה להתבצע על פי הנחיות טיפול בבעלי החיים רלוונטיות. לקבל את אישור מוסדי לעבודה של בעלי חיים לפני פרוטוקול התחלה.

1. Myointimal היפרפלזיה דגם ()

עבור דגם היפרפלזיה intimal, לרכוש C57BL/6J (מספר מניות 000,664, C57BL/6J) עכברים בגיל 8 שבועות במשקל של כ 25 גרם. עכברי בית לניסויים האלה בתנאים קונבנציונליים; להאכיל את האוכל בעכבר סטנדרטי עכברים ולספק כרצונך מים.

1. הכנת עכבר: להכניס את העכבר למצב הרדמה עם isoflurane (2%), תוך ניצול תא אינדוקציה.
   1. להסיר את השיער בבטן באמצעות גוזם שיער, להניח את העכבר על גבה ולכסות את האף והפה שלה עם facemask כדי להבטיח את ההרדמה.
   2. עם Provo-יוד, לחטא את אזור הבטן באופן אוניברסלי, ואחריו 80% אתנול, בשני מחזורים.
   3. מבטיח היעדרשל רפלקסים על ידי צובט את הגפיים האחורי כדי לפקח על העומק מספק של הרדמה.
   4. הפרד את העור ושרירים לאורך alba Linea בשני שלבים כדי לחשוף את איברי הבטן.
   5. הנח את המעיים בכפפה מלוחה לחות. עטוף את הכפפה סביב המעיים כדי לשמור אותם לחים.
   6. בקשב רב לסלק את רקמת שומן ציפוי מקצועית אב העורקים בבטן. לחשוף את אב העורקים infrarenal עד להסתעפות שלה, נזהר שלא לפגוע בכל כלי שיט של הסניף.
   7. ראשית, מקום מהדק microsurgical על הפרוקסימלי, אב העורקים infrarenal לסגור את זרימת הדם. עכשיו, להחיל מהדק דיסטלי שני ליד הסתעפות של אב העורקים.
   8. כאשר זרימת הדם נקטעה, לעשות חתך קטן לתוך אב העורקים קרובים למהדק הפרוקסימלי.
   9. הכנס את הצנתר שקצהו הבלון, אשר כבר לחות עם מי מלח 0.9%, ולהתקדם לעבר המהדק הדיסטלי של אב העורקים.
   10. לפציעה אנדותל, לחשוף את אב העורקים באמצעות ניפוח balloon מושך בזהירות ובאיטיות את הקטטר לכיוון של המהדק הפרוקסימלי.
   11. חזור על תרגיל denudation פעמיים.
   12. הסר את הקטטר ולסגור את חתך אב העורקים באמצעות 10-0 תפרי ריצה prolene.
   13. פותח בזהירות את מהדק דיסטלי. במקרה של דימום באתר aortotomy, סגור את המהדק שוב, לאתר את הדימום ולמקם את התפרים קטע נוספים, במידת צורך.
   14. אם ניתן להבחין אין דימום, פתח לאט את המהדק הפרוקסימלי.
   15. דופק של אב העורקים צריך להיות גלוי distally מהחתך. כעת ניתן לארגן בחזרה את המעיים באתרם.
   16. יש לשטוף את חלל בטן ניצול תמיסת מלח סטרילית מחוממת מראש.
   17. סגור את דופן הבטן מתחילה עם שכבת השרירים באמצעות תפרי 6-0 ריצה prolene.
   18. הבא להתאים את העור מתחת לשימוש ב5-0 תפרי ריצה prolene ביצוע.
   19. במהלך הזמן את העכבר הוא עדיין מורדם, להחיל 4-5 מ"ג / קילוגרם Carprofen באמצעות inje תת עוריתction.
   20. הוספת Metamizol למי השתייה (50 Metamizol מ"ג ל100 מיליליטר) לשליטה בכאב ולהמשיך לפוסט 3 ימי ניתוח. לפקח על בעלי חיים בכל התאוששות.
       הערה: תקופת התצפית עבור דגם זה היא 28 ימים.

2. טרשת עורקים דגם (B)

למודל טרשת עורקים, לרכוש אפוליפופרוטאין E-לקויה (ApoE - / -) עכברים (מספר מניות 002,052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J) בגיל 4 שבועות, ולאחר מכן האכיל ל4-6 חודשים. עכברי בית לניסויים האלה בתנאים קונבנציונליים; להאכיל את עכברי התזונה עתירה שומנים מערביות עם הגעה (הרלן מעבדות TD.88137) ולספק כרצונך מים למשך תקופה של 4 עד 6 חודשים.

1. הכנת עכבר:
   1. להאכיל את ApoE - / - עכברים עם תזונה מערבית מתחילים ב 4 שבועות של גיל. מניפולציה תזונתית צריכה להתחיל ישירות בעת הגעה.
   2. לשמור על דיאטה מערבית לאורך תקופת הניסוי.

3. ניתוח

1. מודל היפרפלזיה Myointimal ()
   האזור של עניין במודל זה הוא "אזור הנגע". אפשרויות לניתוח כוללות מחיקת luminal, יחס I / M (יחס אינטימה / מדיה), עובי myointima מקסימאלי, אזור myointimal, מכתים Trichrome לסיסטיק, וצביעת H & E לתאים חד גרעיניים (כפי שמודגם באיורים 1A-1C). על פי השאלה המדעית ניתן ליישם stainings רב אחר כמו אדום Picrosirius לקולגן, אימונוהיסטוכימיה, ושיטות confocal.
2. מודל טרשת עורקים (ב ')
   האזורים של עניין במודל זה הם שסתום אב העורקים, קשת אב העורקים, כמו גם את אב העורקים היורדים. אפשרויות לניתוח: מכתים סודן אדום לשומנים וTrichrome הכתמה של שסתום אב העורקים, קשת אב העורקים ואב העורקים יורדים (כפי שמודגם באיור 1D).
   מודל זה גם תשואות מגוון רחב של אפשרויות צביעה אחרות כמולמשל שמן האדום O לשומנים ניטראליים, אדום Picrosirius, אימונוהיסטוכימיה, ושיטות confocal.
   1. צביעה אדומה סודן: בצע הצביעה האדומה סודאן על רקמת אב העורקים טריים שנקטפו.
      1. הסר את 6 שעות הדיאטה לפני הקציר.
      2. להציג את העכבר למצב הרדמה עם isoflurane (2%), תוך ניצול תא אינדוקציה. מבטיח היעדר רפלקסים על ידי צובט את הגפיים האחורי כדי לפקח על העומק מספק של הרדמה.
      3. פתח את החזה; לנתק את השיא של הלב וינקב דרך החדר השמאלי, ראשון עם מי מלח (3 מיליליטר), ואחריו PFA 4% (3 מיליליטר) דרך שורש אב העורקים לתקן את אב העורקים.
      4. לשחרר את אב העורקים מהשורש ועד להסתעפות שלה. נסה להסיר את רקמת שומן ככל האפשר.
      5. חותכים את הלב ואת שורש אב העורקים, ולאחסן אותם בPFA 4% להיסטולוגיה.
      6. להיסטולוגיה שורש אב העורקים יש לזהירות יוצב בבלוק פרפין בתנוחה זקופה כדי לאפשר החיתוך של AORשקופיות מניבת שורש טיק המציגות את כל 3 עלונים מסתמית.
      7. לחתוך קצה אחד של עץ אב העורקים ולתקן אותה על שכבת סיליקון עם סיכות בסדר. לפתוח את אב העורקים אורכים ולתקן את הרקמות של אב העורקים.
      8. יש לשטוף את הרקמה עם 50% אתנול. לטבול את הרקמה עם פתרון מכתים סודן III עבור -15 דקות.
      9. יש לשטוף בעדינות עם 50% אתנול להסיר את סודאן III העודף. (הערה: 50% אתנול עשוי לשטוף את הצבע משם.) לשטוף עם DH ₂ O, ולצלם לניתוח נוסף.

תוצאות

איור 1 מציג אפשרויות ניתוח שונות ומצב מחלה הנגרם לשני הדגמים. עבור דגם היפרפלזיה intimal, הניתוח של חתכי נציג בTrichrome מכתים מוצג. מחתכים אלה, תוצאות כמו יחסיי / מ ', עובי שלט מרבי, עובי intimal מרבי בלומן, מחיקת luminal באחוזים, כמו גם שטח שלט ניתן למדוד ומחושבות.

Discussion

למרות ששני המחלות גורמות לסימפטומים דומים אצל המטופל, את מנגנוני התפתחות פלאק ולכן הגישות הטיפוליות הם שונים מאוד ^2. בצורות שונות של היצרות העורק הממצאים הקליניים בחולים, כמו גם את מסגרת הזמן של התפתחות רובד תלויה במנגנון הבסיסי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Catalog number	Comments
Thyoglycollate Broth 3%	Fluka	70157	powder
PFA 4%	Electron Microscopy Sciences	#157135S	20%
Sudan III staining solution	Sigma Aldrich	S4131	powder
mouse C57BL/6J	Jackson Laboratories	Stock # 0006664
mouse ApoE-/-	Jackson Laboratories	Stock #002052
Western Diet	Harlan Laboratories	TD.88137
hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	Abbott		Isoflurane
microsurgical clamp	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - 4mm
clamp applicator	Fine Science Tools	18056-14
catheter
10-0 prolene suture	Ethicon	788G
6-0 prolene suture	Ethicon	8709H
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer		Carprofen
Metacam 1.5mg/ml	Boehringer Ingelheim		Metamizol