Induktion Myointimale Hyperplasie Versus Atherosklerose in Mäuse: Eine Einführung von zwei gültigen Modelle

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt zwei Modelle der Intima Plaqueentwicklung in murinen Arterien und betont die Unterschiede in myointimale Hyperplasie und Atherosklerose.

Zusammenfassung

Verschiedene in vivo-Labor-Nagetiermodellen für die Induktion der Stenose festgelegt worden, um Krankheiten, die arterielle Plaque-Bildung und Stenose umfassen, wie z. B. bei ischämischen Herzkrankheiten beobachtet imitieren. Zwei hoch reproduzierbare Mausmodelle - sowohl was Stenose, aber jeder einen anderen Weg der Entwicklung zu Grunde liegenden - hier werden eingeführt. Die Modelle stellen die beiden häufigsten Ursachen der Stenose; nämlich ein Maus-Modell für jeden myointimale Hyperplasie und Atherosklerose gezeigt. Um myointimale Hyperplasie wird ein Ballonkatheterverletzung der abdominalen Aorta. Für die Entwicklung von atherosklerotischen Plaques, die ApoE - / - Maus-Modell wird in Kombination mit westlichen fettreiche Ernährung verwendet werden. Verschiedene Modelloptionen angepasst für die Messung und Auswertung der Ergebnisse benannt und in diesem Manuskript beschrieben. Die Einführung und Vergleich dieser beiden Modelle bietet InformatIonen für Wissenschaftler, um die entsprechende Stenose Modell in Übereinstimmung mit der wissenschaftlichen Frage gestellt zu wählen.

Einleitung

In den Industrieländern bleibt die ischämische Herzkrankheit eine der Hauptursachen der Sterblichkeit ^ein. Die Ursachen für Koronarstenosen sind vielfältig und umfassen myointimale Hyperplasie sowie Arteriosklerose, mit Rest die häufigste Behandlungsstrategie ² Revaskularisation. Forschungsmodelle, die klar zwischen den Reaktionswege der Intimahyperplasie und Atherosklerose sind unerlässlich, um die pathobiologischen und pathophysiologische Prozesse im arteriellen Plaqueentwicklung zu untersuchen. In diesem Video zwei verschiedene Mausmodelle verwendet werden, um entweder die Entwicklung von myointimale Hyperplasie oder Atherosklerose studieren werden eingeführt.

Myointimale Hyperplasie wird postuliert, dass über die "response-to-injury" Paradigma ursprünglich für Atherosklerose ³ beschrieben zu bilden. Die mechanische Störung der endothelialen Schicht führt zu einem intensiven Umbau durch parakrine Effekte verbessert. Es gibt mehrere different Tiermodellen häufig verwendet, um myointimale Hyperplasie zu studieren. Einige Gruppen verwenden Metall Geräte in der aufsteigenden Aorta von Ratten ^4. Die Aorten Denudation Modell mit einem Ballonkatheter durchgeführt wird häufig auch in Laborratten ^5,6 verwendet. Die Intimahyperplasie Modell in Labormäusen durchgeführt, ⁷ implementiert Ligation der A. carotis und induziert myointimale Läsionen ^8. In unserem Labor, die Bauch-Aorten-Entblößung Modell - sowie einen humanisierten Stent-Restenose-Modell ⁹ werden häufig verwendet, - die Entwicklung von myointimale Hyperplasie zu studieren. Dieses Video wird betont, dass die Wahl der richtigen experimentellen Tiermodell ist entscheidend für die mechanistische oder pathophysiologische Studien der arteriellen Stenose.

Myointimale Hyperplasie Modelle müssen von Atherosklerose-Modellen unterscheiden. Für letztere Apolipoprotein E-defizienten (ApoE - / -)-Mäuse sind in Kombination mit westlichen Ernährung häufig verwendet, um atheroscl induzierenErotik Läsionen ^10,11,12,13. Beispiele für die Induktion von beiden dieser Arten von myointimale Krankheit in Mäusen werden hier gezeigt zusammen mit verschiedenen Modelloptionen angepasst, um Gefäßverengung ¹⁴ zu analysieren.

Protokoll

Alle Tier Arbeiten sollten nach den einschlägigen Tierpflege-Richtlinien durchgeführt werden. Erhalten institutionelle Zulassung für Tier Arbeit vor Beginn Protokoll.

1. Myointimale Hyperplasie Modell (A)

Für die Intimahyperplasie Modell kaufen C57BL/6J (Artikelnummer 000664, C57BL/6J)-Mäuse im Alter von 8 Wochen mit einem Gewicht von ca. 25 g. Hausmäuse für diese Versuche unter herkömmlichen Bedingungen; Mäuse füttern Standardmäusefutter und Wasser ad libitum zur Verfügung stellen.

1. Maus Zubereitung: Führen Sie die Maus, um ein Narkosezustand mit Isofluran (2%) unter Verwendung eines Induktionskammer.
   1. Entfernen Sie die Bauch Haare mit einem Haarschneider, legen Sie die Maus auf den Rücken und decken ihre Nase und Mund mit der Gesichtsmaske, um die Narkose zu gewährleisten.
   2. Mit Provo-Jod, desinfizieren Sie die Bauch-Bereich allgemein, gefolgt von 80% Ethanol, in zwei Zyklen.
   3. Sichern Sie die Abwesenheitvon Reflexen durch Kneifen der Hintergliedmaße, die ausreichende Narkosetiefe zu überwachen.
   4. Trennen Sie die Haut und Muskeln entlang der Linea alba in zwei Schritten auf die Bauchorgane aus.
   5. Legen Sie den Darm in einer Kochsalzlösung befeuchtet Handschuh. Wickeln Sie den Handschuh um den Darm, um sie feucht zu halten.
   6. Aufmerksam wegzuräumen das Ausrollen des Bauchaorta Fettgewebe. Expose der infrarenalen Aorta bis auf die Bifurkation, kümmert sich nicht um alle Zweiggefäße verletzen.
   7. Zuerst ein mikro Klemme an der proximalen, infrarenalen Aorta zum Herunterfahren des Blutflusses. Nun tragen Sie eine zweite distale Klemm neben der Bifurkation.
   8. Wenn der Blutstrom unterbrochen wird, einen kleinen Einschnitt in der Aorta in der Nähe des proximalen Klemme.
   9. Legen Sie die Ballonkatheters, der mit 0,9% Salzlösung befeuchtet wurde, und vorab in Richtung des distalen Klemme der Aorta.
   10. Für endotheliale Verletzung, entblößen die Aorta durch Aufblasen des balloon vorsichtig und langsam Ziehen des Katheters in Richtung des proximalen Klemme.
   11. Wiederholen Sie zweimal die Entblößung Manöver.
   12. Entfernen Sie den Katheter und schließen Sie die Aorten-Schnitt mit 10-0 Prolene laufenden Nähten.
   13. Öffnen Sie vorsichtig das distale Klemme. Im Falle von Blutungen an der Aortotomie Website, schließen Sie die Klemme wieder, suchen die Blutung und setzen zusätzliche unterbrochen Stiche, wie nötig.
   14. Wenn keine Blutungen beobachtet werden kann, öffnen Sie langsam das proximale Klemme.
   15. Eine Aortapuls sollte distal von dem Einschnitt sichtbar. Jetzt kann der Darm wieder in situ angeordnet werden.
   16. Spülen Sie die Bauchhöhle Verwendung vorgewärmten sterilen Kochsalzlösung.
   17. Schließen Sie die Bauchdecke beginnend mit der Muskelschicht mit 6-0 Prolene laufenden Nähten.
   18. Weiter die Haut anpassen unter der Verwendung von 5-0 Prolene Durchführung laufenden Nähten.
   19. Während der Zeit, die Maus ist immer noch betäubt, gelten 4-5 mg / kg Carprofen über eine subkutane injektion.
   20. In Metamizol dem Trinkwasser (50 mg Metamizol pro 100 ml) zur Schmerzkontrolle und fahren für 3 Tage nach der Operation. Überwachung der gesamten Tier Erholung.
       Hinweis: Der Beobachtungszeitraum für dieses Modell beträgt 28 Tage.

2. Atherosklerose-Modell (B)

Für die Atherosklerose-Modell, kaufen Apolipoprotein E-defizienten (ApoE - / -)-Mäusen (Artikelnummer 002052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J) im Alter von 4 Wochen, und dann für 4-6 Monate zugeführt. Hausmäuse für diese Versuche unter herkömmlichen Bedingungen; Mäuse füttern hohen Lipid westlichen Ernährung bei der Ankunft (Harlan Laboratories TD.88137) und bieten Wasser ad libitum für eine Dauer von 4 bis 6 Monaten.

1. Maus Zubereitung:
   1. Führen Sie das ApoE - / - Mäusen, die mit westlichen Ernährung bei Alter von 4 Wochen ab. Diätetische Manipulation sollte direkt nach der Ankunft beginnen.
   2. Pflegen westlichen Ernährung gesamten Dauer des Experiments.

3. Analyse

1. Myointimale Hyperplasie Modell (A)
   Die Region von Interesse in diesem Modell ist der "Läsion Bereich". Optionen für die Analyse sind luminalen Auslöschung, I / M-Verhältnis (Intima / Media-Verhältnis), die maximale Dicke myointima, myointimale Bereich Trichromfärbung für Fibrose und H & E-Färbung für mononuklearen Zellen (wie in den 1A-1C dargestellt). Nach der wissenschaftlichen Fragestellung zahlreiche andere Färbungen wie Picrosirius rot für Kollagen, Immunhistochemie und konfokale Methoden verwendet werden.
2. Atherosklerose-Modell (B)
   Die Bereiche von Interesse in diesem Modell sind die Aortenklappe Aortenbogen und die absteigende Aorta. Optionen für die Analyse: Sudan-Rot-Färbung für Lipide und Trichromfärbung der Aortenklappe, Aortenbogen und absteigender Aorta (wie in 1D dargestellt).
   Dieses Modell liefert auch eine Vielzahl von anderen Optionen, wie Färbungbeispielsweise Oil Red O für neutrale Lipide, Picrosirius rot, Immunhistochemie und konfokale Methoden.
   1. Sudan-Rot-Färbung: Führen Sie die Sudan-Rot-Färbung auf frisch geernteten Aortengewebe.
      1. Entfernen Sie die Diät-6h vor der Ernte.
      2. Führen Sie die Maus, um ein Narkosezustand mit Isofluran (2%) unter Verwendung eines Induktionskammer. Assure das Fehlen von Reflexen durch Kneifen der Hintergliedmaße, die ausreichende Narkosetiefe zu überwachen.
      3. Öffnen Sie die Brust; bricht die Spitze des Herzens und Perfusion über den linken Ventrikel zuerst mit Kochsalzlösung (3 ml), gefolgt von 4% PFA (3 ml) durch die Aortawurzel an der Aorta zu befestigen.
      4. Befreie die Aorta von der Wurzel zu ihrer Bifurkation. Versuchen, Fettgewebe zu entfernen, so viel wie möglich.
      5. Schneiden Sie das Herz und die Aortenwurzel, und speichern sie in 4% PFA für die Histologie.
      6. Für die Histologie ist die Aortenwurzel sorgfältig in dem Paraffinblock in eine aufrechte Position, um die Schneiden der AOR ermöglichen gelegt werdentic Wurzel Erzeugungs Folien, die alle drei Klappenflugblätter anzuzeigen.
      7. Schneiden Sie ein Ende des Aorten-Baum und befestigen es auf der Silikonschicht mit feinen Stiften. Öffnen Sie die Aorta in Längsrichtung und fixieren Sie die Aorten-Gewebe.
      8. Spülen Sie das Gewebe mit 50% Ethanol. Tauchen Sie das Gewebe mit Sudan III-Färbung Lösung für ca. 15 min.
      9. Leicht Spülung mit 50% Ethanol, um die überschüssige Sudan III zu entfernen. (Anmerkung: 50% Ethanol kann der Farbstoff weg zu waschen.) Spülen mit dH ₂ O, und Fotos für die weitere Analyse.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt verschiedene Analysemöglichkeiten und die induzierte Krankheitszustand für beide Modelle. Für die Intima-Hyperplasie Modell wird die Auswertung von repräsentativen Querschnitte in Trichromfärbung gezeigt. Aus diesen Querschnitten, können die Ergebnisse wie I / M-Verhältnisse, die maximale Plaquedicke, maximale Dicke der Intima in das Lumen, luminalen Auslöschung in Prozent, sowie Plaque-Bereich gemessen und berechnet werden.

Um das Ergebnis der Athe...

Diskussion

Obwohl beide Erkrankungen führen zu ähnlichen Symptomen des Patienten, sind die zugrunde liegenden Mechanismen der Plaqueentwicklung und damit die Behandlungsansätze sehr unterschiedlich ^2. In verschiedenen Formen der arteriellen Stenose die klinischen Befunde bei den Patienten als auch der Zeitrahmen von Plaqueentwicklung hängt von der zugrunde liegenden Mechanismus.

Je nach den klinischen Befunden im Patienten müssen verschiedene Methoden der Probenanalyse durchgeführt wer...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Catalog number	Comments
Thyoglycollate Broth 3%	Fluka	70157	powder
PFA 4%	Electron Microscopy Sciences	#157135S	20%
Sudan III staining solution	Sigma Aldrich	S4131	powder
mouse C57BL/6J	Jackson Laboratories	Stock # 0006664
mouse ApoE-/-	Jackson Laboratories	Stock #002052
Western Diet	Harlan Laboratories	TD.88137
hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	Abbott		Isoflurane
microsurgical clamp	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - 4mm
clamp applicator	Fine Science Tools	18056-14
catheter
10-0 prolene suture	Ethicon	788G
6-0 prolene suture	Ethicon	8709H
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer		Carprofen
Metacam 1.5mg/ml	Boehringer Ingelheim		Metamizol