Induisant myointimale hyperplasie Versus athérosclérose chez la souris: An Introduction de deux modèles valides

Résumé

Cette vidéo montre deux modèles de l'intima développement de la plaque dans les artères de souris et met l'accent sur les différences dans l'hyperplasie myo-intimale et l'athérosclérose.

Résumé

Différents modèles in vivo laboratoire de rongeurs pour l'induction de la sténose de l'artère ont été créés pour imiter les maladies qui comprennent la formation de la plaque artérielle et de la sténose, comme on l'observe par exemple dans la cardiopathie ischémique. Deux modèles de souris hautement reproductibles - à la fois entraînant sténose de l'artère sous-jacents, mais chacun un chemin différent de développement - sont introduits ici. Les modèles représentent les deux causes les plus fréquentes de sténose de l'artère; à savoir un modèle de souris pour chaque hyperplasie myointimale et l'athérosclérose sont présentés. Provoquer l'hyperplasie myo-intimale, une lésion par cathéter à ballonnet de l'aorte abdominale est effectuée. Pour le développement de la plaque athéroscléreuse, l'ApoE - / - modèle de souris en combinaison avec un régime alimentaire occidental gras est utilisé. Options de modèle adapté différentes pour la mesure et l'évaluation des résultats sont nommées et décrites dans ce manuscrit. L'introduction et la comparaison de ces deux modèles fournit information pour les scientifiques de choisir le modèle de sténose de l'artère appropriée, conformément à la question scientifique posée.

Introduction

Dans les pays industrialisés cardiopathie ischémique reste une des principales causes de la mortalité ^1. Les causes de sténose de l'artère coronaire sont multiples et comprennent l'hyperplasie myo-intimale ainsi que l'athérosclérose, une revascularisation restant stratégie de traitement la plus courante ^2. Les modèles de recherche qui distinguent clairement les voies mécanistiques de l'hyperplasie intimale et l'athérosclérose sont essentiels pour enquêter sur la pathobiologique et processus physiopathologiques en développement de la plaque artérielle. Dans cette vidéo, deux modèles différents de souris utilisées pour étudier soit le développement de l'hyperplasie myo-intimale ou l'athérosclérose sont introduits.

Hyperplasie myo-intimale est postulé pour former via le paradigme "réponse à des blessures" décrit à l'origine de l'athérosclérose ^3. La rupture mécanique de la couche endothéliale conduit à un remodelage intense renforcée par des effets paracrines. Il existe plusieurs dimodèles animaux fférents couramment utilisées pour étudier l'hyperplasie myo-intimale. Certains groupes utilisent des dispositifs de métaux dans l'aorte ascendante de ⁴ rats. Le modèle de dénudation aortique réalisée avec un cathéter à ballonnet est également communément utilisé dans des rats de laboratoire ^5,6. Le modèle de l'hyperplasie intimale réalisée chez des souris de laboratoire ⁷ met en oeuvre la ligature de l'artère carotide et induit des lésions myo-intimales ^8. Dans notre laboratoire, le modèle de la dénudation de l'aorte abdominale - pour étudier le développement de l'hyperplasie myo-intimale - ainsi que d'un modèle humanisé stent resténose ⁹ sont couramment utilisés. Cette vidéo souligne que le choix du modèle animal expérimental adéquat est essentiel pour des études mécanistiques ou physiopathologiques de la sténose artérielle.

Modèles hyperplasie myo-intimale doivent être distinguées des modèles d'athérosclérose. Pour ces derniers, l'apolipoprotéine E-deficient (ApoE - / -) chez la souris en combinaison avec un régime alimentaire occidental sont couramment utilisés pour induire atheroscllésions érotiques ^10,11,12,13. Des exemples pour l'induction de ces deux types de la maladie chez les souris myointimal sont présentés ici, avec différentes options de modèle adapté pour analyser vaisseau sténose ^14.

Protocole

Tous les travaux des animaux doit être effectué selon les directives de protection des animaux concernés. Obtenir l'approbation institutionnelle pour le travail des animaux avant protocole de début.

1. Myointimale hyperplasie modèle (A)

Pour le modèle de l'hyperplasie intimale, acheter C57BL/6J (Stock nombre 000664, C57BL/6J) souris à l'âge de 8 semaines pesant environ 25 g. Souris Maison à ces expériences dans des conditions classiques; nourrir les souris bouffe de souris standard et de fournir l'eau ad libitum.

1. Préparation de la souris: Présentez la souris à un état ​​d'anesthésie avec de l'isoflurane (2%) en utilisant une chambre d'induction.
   1. Enlever les poils abdominale en utilisant une tondeuse à cheveux, poser la souris sur le dos et couvrir le nez et la bouche avec le masque facial pour assurer l'anesthésie.
   2. Avec Provo-iode, désinfecter la zone abdominale universellement, suivie par 80% d'éthanol, en deux cycles.
   3. Assurer l'absencedes réflexes de pincement de la patte arrière pour surveiller la profondeur suffisante de l'anesthésie.
   4. Séparer la peau et les muscles le long de la ligne blanche en deux étapes pour exposer les organes abdominaux.
   5. Disposez les intestins dans un gant de solution saline hydratée. Enroulez le gant autour des intestins pour les garder humides.
   6. Attention déblayer le tissu adipeux bâches l'aorte abdominale. Exposer la aorte jusqu'à sa bifurcation, en prenant soin de ne pas blesser des navires de la branche.
   7. Tout d'abord, placer une pince de microchirurgie sur la proximale, aorte pour arrêter le flux de sang. Maintenant, appliquer une deuxième pince distale à côté de la bifurcation aortique.
   8. Lorsque le flux de sang est interrompu, une petite incision dans l'aorte à proximité de la pince proximale.
   9. Insérer le cathéter à ballonnet, qui a été hydratée avec une solution saline à 0,9%, et de faire avancer la pince en direction distale de l'aorte.
   10. Pour lésion endothéliale, dénuder l'aorte en gonflant le balloon prudemment et lentement en tirant le cathéter dans la direction proximale de la pince.
   11. Répéter deux fois la manœuvre de la dénudation.
   12. Retirer le cathéter et fermer l'incision aortique par 10-0 prolène sutures de fonctionnement.
   13. Ouvrez avec précaution la pince distale. En cas de saignement au site de aortotomie, fermer la pince à nouveau, localiser le saignement et placer des points interrompus supplémentaires, si nécessaire.
   14. Si aucun saignement peut être observé, ouvrir lentement la pince proximale.
   15. Une impulsion aortique doit être visible de manière distale à partir de l'incision. Maintenant, les intestins peuvent être organisées retour in situ.
   16. Rincer la cavité abdominale en utilisant une solution saline stérile préchauffée.
   17. Fermer la paroi abdominale en commençant par la couche de muscles en utilisant 6-0 sutures prolène de fonctionnement.
   18. Adapter ensuite la peau sous l'utilisation de 5-0 prolène effectuer des sutures de fonctionnement.
   19. Pendant le temps de la souris est toujours anesthésié, appliquer 4-5 mg / kg Carprofen via un Inje sous-cutanéection.
   20. Ajouter Metamizol à l'eau potable (50 mg par 100 ml Metamizol) pour le contrôle de la douleur et continuer pendant 3 jours après la chirurgie. Surveillance des animaux tout au long de la récupération.
       Note: La période d'observation pour ce modèle est de 28 jours.

2. L'athérosclérose modèle (B)

Pour le modèle de l'athérosclérose, l'achat d'apolipoprotéine E déficient (ApoE - / -) chez la souris (Stock nombre 002052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J) à l'âge de 4 semaines, puis nourris pendant 4-6 mois. Souris Maison à ces expériences dans des conditions classiques; nourrir des souris haut régime occidental lipides à l'arrivée (Harlan Laboratories TD.88137) et fournir de l'eau ad libitum pour une durée de 4 à 6 mois.

1. Préparation de la souris:
   1. Nourrir la ApoE - / - souris avec un régime alimentaire occidental à partir de 4 semaines d'âge. Modification du régime alimentaire devrait commencer directement à l'arrivée.
   2. Maintenir une alimentation occidentale tout au long de la durée de l'expérience.

3. Analyse

1. Modèle de l'hyperplasie myo-intimale (A)
   La région d'intérêt de ce modèle est la "zone de lésion". Options pour analyse comprennent oblitération luminale, rapport I / M (rapport intima / média), épaisseur maximale de myointima, zone myointimale, coloration au trichrome de la fibrose, et coloration H & E pour les cellules mononucléaires (comme illustré dans les figures 1A-1C). Selon la question scientifique comme de nombreux autres colorations rouge de picrosirius collagène, l'immunohistochimie, et des procédés peuvent être appliqués à foyer commun.
2. modèle de l'athérosclérose (B)
   Les régions d'intérêt dans ce modèle sont la valve aortique, l'arc aortique ainsi que l'aorte descendante. Options pour analyse: Soudan coloration rouge pour les lipides et coloration au trichrome de la valve aortique, l'arc aortique et de l'aorte descendante (comme illustré à la figure 1D).
   Ce modèle donne également une variété d'autres options de coloration commepar exemple Oil Red O pour les lipides neutres, picrosirius rouge, immunohistochimie, et les méthodes confocale.
   1. Soudan coloration rouge: Effectuer la coloration rouge Soudan, le tissu aortique fraîchement récoltées.
      1. Retirez le 6h de régime avant la récolte.
      2. Introduire la souris à un état d'anesthésie avec de l'isoflurane (2%) en utilisant une chambre d'induction. Assurer l'absence de réflexes en pinçant la patte arrière pour surveiller la profondeur suffisante de l'anesthésie.
      3. Ouvrez le coffre; couper l'apex du cœur et perfuser le ventricule gauche par l'intermédiaire, d'abord avec une solution saline (3 ml), suivie de 4% de PFA (3 ml) à travers la racine de l'aorte à fixer l'aorte.
      4. Libérez l'aorte de la racine à la bifurcation. Essayez d'enlever les tissus gras autant que possible.
      5. Coupez le coeur et la racine de l'aorte, et les stocker dans 4% PFA pour l'histologie.
      6. Pour l'histologie de la racine de l'aorte doit être soigneusement placé dans le bloc de paraffine dans une position verticale pour permettre à la pointe de l'aortic diapositives génératrices de racine qui affichent tous les trois dépliants valvulaires.
      7. Couper une extrémité de l'arbre de l'aorte et le fixer sur la couche de silicone avec des épingles fines. Ouvrez l'aorte longitudinalement et fixer le tissu aortique.
      8. Rincer le tissu avec 50% d'éthanol. Immerger le tissu avec une solution de coloration au Soudan III pendant environ 15 min.
      9. Rincez légèrement avec 50% d'éthanol pour éliminer l'excès Soudan III. (Remarque: 50% d'éthanol peut laver le colorant loin.) Rincer avec dH ₂ O, et prendre des photos pour une analyse ultérieure.

Résultats

La figure 1 montre les différentes options d'analyse et l'état de la maladie induite pour les deux modèles. Pour le modèle de l'hyperplasie intimale, l'analyse des sections représentatives de coloration au trichrome est affiché. A partir de ces sections transversales, de tels résultats ratios E / S, l'épaisseur maximale de la plaque, l'épaisseur maximale de l'intima dans le lumen, l'oblitération luminale en pour cent, ainsi que la zone de la plaque peuvent être...

Discussion

Bien que ces deux maladies entraînent des symptômes similaires chez le patient, les mécanismes sous-jacents de développement de la plaque et par conséquent, les approches de traitement sont très différents ^2. Dans différentes formes de sténose artérielle les résultats cliniques des patients ainsi que la période de développement de la plaque dépendent du mécanisme sous-jacent.

Selon les résultats cliniques chez le patient, différentes méthodes d'analyse de l&#...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thyoglycollate Broth 3%	Fluka	70157	powder
PFA 4%	Electron Microscopy Sciences	#157135S	20%
Sudan III staining solution	Sigma Aldrich	S4131	powder
mouse C57BL/6J	Jackson Laboratories	Stock # 0006664
mouse ApoE -/-	Jackson Laboratories	Stock #002052
Western Diet	Harlan Laboratories	TD.88137
hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	Abbott		Isoflurane
microsurgical clamp	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator	Fine Science Tools	18056-14
catheter
10-0 prolene suture	Ethicon	788G
6-0 prolene suture	Ethicon	8709H
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer		Carprofen
Metacam 1.5 mg/ml	Boehringer Ingelheim		Metamizol