JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Abstract

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.  Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

Introduction

تطبيق التيار الكهربائي إلى خلية يسبب تشكيل المسام على غشاء الخلية، من خلال عملية تسمى Electroporation لل. مسام تسمح بمرور مجموعة متنوعة من الجزيئات nonpermeant من خلال الغشاء. يمكن التحكم في المجال الكهربائي على وجه التحديد، بحيث المسام شكلت صغيرة جدا وreclose بسرعة، مع الحد الأدنى من اضطراب في الفيزيولوجيا الخلوية. ومن المثير للاهتمام، الخلايا الملتصقة يمكن زراعتها على شريحة زجاجية مغطاة موصل وشفافة أكسيد الإنديوم والقصدير (ايتو) وelectroporated في الموقع، وهذا هو على السطح حيث تنمو، دون أن يتم فصل electroporated في تعليق. خلايا يمكن أن تنمو بشكل جيد جدا على هذا السطح، وبما أنها تابعة والموسعة، الملاحظة المجهرية مفصلة ممكن. باستخدام هذه التقنية، جزيئات صغيرة nonpermeant يمكن إدخال الفور وبشكل أساسي إلى 100٪ من الخلايا، مما يجعل هذه التقنية مناسبة خاصة بالنسبة للدراسات حول تفعيل شركاتonents من مسار التالية التحفيز يجند لمستقبلات (مراجعة في 1).

وقد استخدم Electroporation للفي الغالب لإدخال الحمض النووي (وتسمى أيضا electrotransfection). ومع ذلك، يمكن Electroporation للفي الموقع أن تكون ذات قيمة لإدخال مجموعة كبيرة ومتنوعة من الجزيئات، مثل الببتيدات 2-4، أليغنوكليوتيد]، مثل العقاقير RNA، المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي [أليغنوكليوتيد شرك لمنع عامل النسخ ملزمة، أو سيرنا 3،5، 6، 7-10 النيوكليوتيدات المشعة، والبروتينات 11 12 أو الموالية للمخدرات 13. بعد Electroporation لل، والخلايا هي lysed يمكن للالتحليلات الكيميائية الحيوية أو ثابتة وملطخة الأجسام المضادة.

طلاء ايتو موصل رقيقة جدا، 800-1،000Å، بحيث لا تشعر بالانزعاج نمو الخلايا بواسطة الفرق في ارتفاع السطوح اثنين، كما تنمو الخلايا عبر حافة طلاء موصل. وهذا يوفر ميزة أنه غير electrop-خلايا orated يمكن زراعتها جنبا إلى جنب مع تلك electroporated، لتكون بمثابة الضوابط. يمكن استخدام نفس النهج لفحص موصلي الفجوة والاتصال بين الخلايا (GJIC)، كما هو موضح في الفيديو.

تقاطعات الفجوة هي القنوات التي تربط الداخلية من الخلايا المجاورة 14. الفجوة موصلي والاتصال بين الخلايا تلعب دورا هاما في تشكيل الورم والانبثاث، في حين أن الجينات المسرطنة مثل SRC قمع GJIC 15،16. لدراسة GJIC صبغة الفلورسنت مثل لوسيفر الأصفر (LY) غالبا ما أدخلت الخلايا المستزرعة من خلال حقن مكروي أو كشط التحميل 17 و لوحظ انتشار الصبغة في الخلايا المجاورة مجهريا تحت إضاءة مضان. لكن هذه التقنيات دائما يسبب تلف الخلايا. وصفنا الآن تقنية حيث تزرع الخلايا على شريحة زجاجية التي وهي مغلفة جزئيا مع ايتو 18. تم تطبيق نبضة كهربائية في وجود LY (أو الأصباغ الأخرى) كاليفورنياباستخدام انتشارها في الخلايا المتزايد من جانب موصل من الشريحة، في حين صبغ الهجرة إلى الخلايا المجاورة، غير electroporated، وقد لوحظ من خلال المجهر مضان الإضاءة. لتجنب الخلايا الحساسة المزعجة التي قد تميل إلى فصل من أحادي الطبقة، جمعية صمم التي لا تتطلب إلكترود لتوضع على رأس من الخلايا لتطبيق الحالي 19 الكهربائي. يقدم هذا النهج القدرة ل quantitate GJIC في عدد كبير من الخلايا، ودون أي اضطراب يمكن كشفها لالأيض الخلوي، كما يدل على ذلك عدم وجود تأثير على طول المرحلة G1 التالية التحفيز المصل 12، وزيادة في مستويات منظمات المزارعين البروتين protooncogene (Raptis، غير منشورة) أو اثنين تحركات المرتبطة بالإجهاد الخلوي، خنزير P38 أو JNK / SAPK كيناز 1. هذا النهج جعل من الممكن فحص الارتباط بين مستويات الجين الورمي التعبير والتحول وGJIC 18، فضلا عن تأثير SRC وSTAT3 على GJIC في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما فيها الخلايا المستزرعة حديثا من عينات ورم الرئة 20-23. بالإضافة إلى ذلك، Electroporation للالموقعي مع الإعداد الذي وصفه تفتقر إلى القطب العلوي واستخدمت بنجاح لمظاهرة من إغلاق الفجوة تقاطع على التمايز adipocytic، على الرغم من التعلق الخلوي إلى الركيزة يتم تخفيض في تلك المرحلة في 19،24.

Protocol

1. طلاء الخلايا في Electroporation للغرف

  1. في غطاء الصفحي التدفق، يعرض للتريبسين الخلايا باستخدام تقنية معقمة كالمعتاد.
    ملاحظة: من المهم جدا للقضاء بواسطة الطرد المركزي كل آثار التربسين، لأنها قد تعيق انتشار الخلايا على الزجاج، وبالتالي تشكيل الملتصقة وتقاطعات الفجوة.
  2. ماصة 1 مل من تعليق خلية في غرف Electroporation للالمعقمة المتوفرة مع electroporator في الموقع (الشكل 1)، ومكان في 37 درجة مئوية، CO 2 الحاضنة.
    يمكن تحسين التصاق الخلية بواسطة طلاء على فبرونيكتين، والكولاجين، بولي يسين أو الخلية والأنسجة لاصقة (انظر الجدول المواد): ملاحظة.
  3. عندما شكلت خلايا طبقة متموجة انهم مستعدون للفحص GJIC.

2. Electroporation للإجراء

ويمكن إجراء فحص لElectroporation للGJIC خارج غطاء الصفحي التدفق،نظرا لأنه يستغرق سوى بضع دقائق. إذا كانت هناك حاجة مرات حضانة أطول لإجراء تجربة معينة، ومن ثم يمكن إجراء تماما في غطاء تدفق الصفحي. في جميع الحالات، يجب على الدوائر التي تزرع فيها الخلايا تكون عقيمة.

  1. إعداد 5 ملغ / مل حل لوسيفر الأصفر: يذاب 10 ملغ LY مسحوق (المتوفرة مع electroporator) في 2 مل خالية من الكالسيوم متوسطة النمو. للتجارب التي تتطلب مرات حضانة أطول، فلتر تعقيم الحل وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  2. نضح المتوسطة النمو وغسل الخلايا مع خالية من الكالسيوم المتوسطة، والحرص على عدم خدش أحادي الطبقة أو تجف الخلايا. إذا تجفف الخلايا التي عادة ما يكون نوى أكثر قتامة والتقاط LY دون Electroporation لل. وأثر هو أكثر وضوحا في منتصف الشريحة التي تتعرض أكثر إلى مسودات الهواء (الشكل 4F).
  3. مع pipettor إيبندورف، ماصة محلول الصبغة إلى الخلايا (400 ميكرولتر للغرفة بأكملها)، على حافة الغرفة، بeing الحرص على عدم لمس طبقة الخلايا.
  4. وضع غرفة في حامل المرفق مع electroporator وتطبيق نبض لقوة المناسبة (انظر مناقشة).
  5. نضح بعناية بعض من الحل LY. ويمكن إعادة استخدامها مرة ثانية للتجارب أقل أهمية.
  6. إضافة خالية من الكالسيوم DMEM تحتوي على 10٪ مصل dialysed.
  7. احتضان الخلايا لمدة 3-5 دقيقة في الحاضنة للسماح بنقل الصبغة من خلال تقاطعات الفجوة.
    ملاحظة: إدراج مصل dialysed في هذه المرحلة تساعد إغلاق المسام.
  8. غسل الصبغة الفردية مع خالية من الكالسيوم DMEM للمراقبة الخلية الحية. بدلا من ذلك، وخلايا يمكن أن تكون ثابتة في هذه المرحلة، من خلال إضافة 4٪ فورمالدهايد إلى البئر، ثم تغسل مع PBS (الفوسفات مخزنة المالحة). في جميع الحالات يجب غسل إزالة كافة الخلفية.
    ملاحظة: في التجارب الأولية لتحديد الظروف المثلى، إذا كان الجهد منخفض جدا، فمن الممكن للسماح للخلايا التعافي في incubatoص لبضع دقائق وelectroporate نفس الشريحة للمرة الثانية، لتوفير في تكلفة الشرائح.

3. فحص مجهرية

  1. مراقبة الخلايا تحت إضاءة مضان، باستخدام مجهر مقلوب مجهزة المرشح المناسب للصبغة المستخدمة. لوسيفر الأصفر، الإثارة هو 423nm، 555nm الانبعاثات، فلتر WBV لمجهر نيكون IX70.
  2. القضاء على الآثار الغضروف المفصلي عن طريق وضع غطاء زجاجي الانزلاق على رأس البلاستيك جيدا، بعد ملئه إلى الأعلى مع السائل، لدراسة مورفولوجيا الخلايا تحت النقيض من المرحلة. لأفضل الصور، وكذلك يمكن فصل من الشريحة، وساترة وضعت على الإطار. لخلايا ثابتة، وكذلك يمكن ملء مع الجلسرين للمراقبة مجهرية، في حين أن الخلايا الحية يجب أن تكون مليئة النمو المتوسطة.
    ملاحظة: الغسل والتصوير أسهل إذا تم إصلاح الخلايا مع الفورمالديهايد بعد نقل الصبغة (الخطوة 2.7 أعلاه). إذا كانت الخلايا لار الثابتة، ويتم القضاء على مضان من الخلايا داخل ما يقرب من 60 دقيقة وهذا يتوقف على نوع من الخلايا، والجهد وكمية LY أدخلت بينما في الخلايا الثابتة يتم الاحتفاظ مضان لعدة ساعات. ومع ذلك، يتلاشى مضان أو تبدد بعد O / N الحضانة، حتى في الخلايا الثابتة. لهذا السبب، يجب أن تؤخذ الصور قريبا بعد Electroporation لل(الشكل 2).

4. الكميات من الاتصالات بين الخلايا

  1. تصوير الخلايا مع الهدف 20X تحت مضان والنقيض من المرحلة (الشكل 3).
  2. تحديد ووضع علامة مع نجم الخلايا electroporated على الحدود مع المنطقة غير electroporated (الشكل 2، السهم، Electroporation للحافة).
  3. تحديد ووضع علامة مع نقطة خلايا الاستشعاع على الجانب غير electroporated، حيث قامت بتحويل الصبغة من خلال تقاطعات الفجوة (أرقام 3A و 3B).
  4. تقسيم العدد الكلي للالاستشعاع الخلايا على منطقة غير electroporated من قبل عدد من خلايا electroporated على طول حافة (أرقام 3A و 3B).
    ملاحظة: يتم احتساب نقل من 200 على الأقل خلايا electroporated الحدود متجاورة لكل تجربة. عدد حصل هو القيمة GJIC.

النتائج

ويبين الشكل 2 كبد الفئران خلايا الظهارية T51B 22، electroporated مع LY وتصويرها تحت مضان (لوحة A و B)، أو على النقيض من المرحلة (C) الإضاءة، وبعد التثبيت والغسيل. في لوحة A، يتم وضع علامة على حافة منطقة الجزاء electroporated باللون الأحمر. التدرج من مضان على يمين الخط الأحمر ?...

Discussion

الخطوات الحاسمة في البروتوكول

المواد Electroporated
نقاء المواد التي سيتم electroporated مهم جدا. إذا كانت الخلايا مسطحة جدا، ثم تركيزات أعلى من تتبع صبغة يجب استخدام (تصل إلى 20 ملغ / مل لLY) وفي مثل هذه الحالات، والنقاء هو أكثر أهمية...

Disclosures

The corresponding author is the inventor in a patent held by Queen’s University, which has been licensed to Cell Projects Inc. The company or the University had no influence upon the contents of the paper.

Acknowledgements

We thank Lowell Cochran for expert videography assistance. The financial assistance of the Canadian Institutes of Health Research (CIHR), the Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), the Canadian Breast Cancer Research Alliance, the Ontario Centers of Excellence, the Breast Cancer Action Kingston and the Clare Nelson bequest fund through grants to LR is gratefully acknowledged. SG was the recipient of an NSERC studentship. MG was supported by a postdoctoral fellowship from the US Army Breast Cancer Program, the Ministry of Research and Innovation of the Province of Ontario and the Advisory Research Committee of Queen’s University.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMCellgro http://www.cellgro.com/50-013-PB
DMEM without CalciumHyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)SH30319-01
Donor Calf Serum PAA: http://www.paa.com/Cat.# B15-008
Fetal Bovine SerumPAA: http://www.paa.com/Cat.# A15-751
Electroporation apparatusCell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ACE-100
ChambersCell Projects Ltd UKACE-04-CC4-wells
ChambersCell Projects Ltd UKACE-08-CC8-wells
Lucifer YellowCell Projects Ltd UKACE-25-LYHigh purity
CelTakBD Biosciences354240Cell and tissue adhesive
FibronectinSigma AldrichF1141
CollagenBD Biosciences354236
Poly-LysineSigma AldrichP8920

References

  1. Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. Electroporation protocols. , 167-183 (2008).
  2. Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking. Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).
  3. Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway. Nature. 391, 285-288 (1998).
  4. Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth. Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).
  5. Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M. Ets up-regulates met transcription. Oncogene. 13, 1911-1917 (1996).
  6. Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. Transfection techniques affecting Stat3 activity levels. Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).
  7. Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1. Science. 278 (5335), 124-128 (1997).
  8. Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP. DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).
  9. Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells. DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).
  10. Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins. Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).
  11. Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis. J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).
  12. Raptis, L., Firth, K. L. Electroporation of adherent cells in situ. DNA Cell Biol. 9, 615-621 (1990).
  13. Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy. Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).
  14. Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H. Gap junctions. Compr Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  15. Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors. Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).
  16. Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
  17. Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).
  18. Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide. DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).
  19. Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes. Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).
  20. Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells. Lab Invest. 78, 639-640 (1998).
  21. Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. Gap junctional communication in lung carcinoma cells. Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).
  22. Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts. DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).
  23. Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells. BMC Cancer. 12, 605 (2012).
  24. Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes. DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).
  25. Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities. Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).
  26. Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
  27. Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).
  28. Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide. J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).
  29. Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide. Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).
  30. Meda, P. Assaying the molecular permeability of connexin channels. Methods Mol Biol. 154, 201-224 (2001).
  31. Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).
  32. Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts. Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).
  33. Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells. Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).
  34. Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
  35. Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen. Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

92 Electroporation STAT3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved