Um ensaio funcional para juncional Exame; Eletroporação de aderentes em células no Índio-Tin Oxide

Resumo

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Resumo

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.  Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

Introdução

A aplicação de corrente eléctrica para uma célula provoca a formação de poros na membrana da célula, por um processo denominado electroporação. Os poros permitem a passagem de uma variedade de moléculas nonpermeant através da membrana. O campo eléctrico pode ser controlada com precisão, de modo a que os poros que se formam são muito pequenas e religar-se rapidamente, com uma perturbação mínima para a fisiologia celular. Interessantemente, as células aderentes podem ser cultivadas numa lâmina de vidro revestido com óxido de índio-estanho condutora e transparente (ITO) e electroporado in situ, isto é sobre a superfície de onde elas crescem, sem ser retirado para ser electroporada em suspensão. As células podem crescer muito bem nesta superfície, e como eles estão ligados e ampliado, a observação microscópica detalhada é possível. Utilizando esta técnica, as pequenas moléculas nonpermeant pode ser introduzido imediatamente e essencialmente em 100% das células, o que faz com que esta técnica especialmente adequado para estudos sobre a activação do components de um caminho a seguir a estimulação do ligando de um receptor (revisto em ^1).

A electroporação foi usado principalmente para a introdução de ADN (também chamada electrotransfection). No entanto, a electroporação in situ pode ser valiosa para a introdução de uma grande variedade de moléculas, tais como péptidos ^2-4, oligonucleótidos, tais como ARN anti-sentido, oligonucleótidos de cadeia dupla de DNA de engodo para inibir a ligação do factor de transcrição, ou siRNA ^{3,5, 6,} nucleotídeos radioativos ^7-10, proteínas ^{11 12} ou pró-drogas ^13. Após a electroporação, as células podem ser lisadas para análise bioquímica ou fixadas e coradas com anticorpos.

O revestimento condutor de ITO é muito fina, 800-1,000Å, de modo que o crescimento celular não é perturbado pela diferença em altura das duas superfícies, como as células crescem em toda a borda do revestimento condutor. Isto oferece a vantagem de que não electropAs células podem ser cultivadas orated lado a lado com os electroporadas, para servir como controlos. A mesma abordagem pode ser usada para o exame de junções de hiato, a comunicação intercelular (CIJH), como descrito no vídeo.

Junções comunicantes são canais que ligam o interior das células adjacentes ^14. Das junções de hiato, a comunicação intercelular desempenha um papel importante na formação de tumores e metástases, enquanto que os oncogenes tais como Src suprimir CIJH ^15,16. Para examinar a CIJH um corante fluorescente, tal como amarelo Lucifer (LY) é muitas vezes introduzido em células cultivadas através de microinjecção ou raspar-carregamento ¹⁷ e a difusão do corante para as células vizinhas é observada microscopicamente sob luz de fluorescência. Estas técnicas contudo invariavelmente causar dano celular. Descreve-se agora uma técnica em que as células são cultivadas sobre uma lâmina de vidro, que é parcialmente revestida com ITO ^18. Um impulso eléctrico foi aplicada na presença de LY (ou outros corantes) cautilizando a sua penetração nas células que crescem na parte condutora da lâmina, enquanto que a migração do corante para as células adjacentes, não electroporadas foi observada microscopicamente através de iluminação de fluorescência. Para evitar as células sensíveis perturbadores que possam tender a separar da monocamada, foi concebido um conjunto que não requerem um eléctrodo a ser colocado no topo das células para aplicar a corrente eléctrica ^19. Esta abordagem oferece a possibilidade de quantificar a CIJH em ​​um grande número de células, sem qualquer perturbação detectável para o metabolismo celular, como indicado pela ausência de um efeito sobre a duração da fase G1 seguindo estimulação sérica ^12, em aumentar os níveis de fos proteína proto-oncogene (Raptis, não publicado) ou duas quinases associadas ao estresse celular, o ^porco p38 ou JNK / SAPK quinase ^1. Esta abordagem possibilitou a análise da relação entre os níveis de oncogene expressão, transformação e GJIC ^18, bem como o efeito da Src e Stat3 sobre CIJH em ​​uma variedade de tipos de células, incluindo as células cultivadas de fresco a partir de espécimes de tumor de pulmão ^{de 20-23.} Além disso, em electroporação in situ com a configuração descrita, a qual não tem um eléctrodo de topo tem sido empregue com sucesso para a demonstração de fecho das junções de hiato na diferenciação dos adipócitos, embora a adesão celular ao substrato é reduzido, nessa fase, ^19,24.

Protocolo

1. plaqueamento das células do Eletroporação Chambers

1. Numa capela de fluxo laminar, as células trypsinize usando uma técnica estéril, como de costume.
   NOTA: É muito importante para eliminar por centrifugação todos os vestígios de tripsina, porque eles podem prejudicar propagação das células no vidro, daí a formação de adherens e junções comunicantes.
2. Pipetar 1 mL da suspensão de células nas câmaras de electroporação estéril fornecido com o electroporador em situ (Figura 1), e em lugar de um de 37 ^o C, incubadora de CO _2.
   NOTA: A adesão celular pode ser melhorada através de plaqueamento em fibronectina, colagénio, poli-lisina ou de células e tecido adesivo (ver Tabela Materiais).
3. Quando as células formaram uma camada confluente eles estão prontos para análise CIJH.

2. Eletroporação Procedimento

Eletroporação para exame GJIC pode ser realizada fora de uma capela de fluxo laminar,uma vez que leva apenas alguns minutos. Se forem necessários tempos de incubação mais longos para uma experiência específica, em seguida, pode ser realizado inteiramente num exaustor de fluxo laminar. Em todos os casos, as câmaras onde são cultivadas as células têm de ser estéreis.

1. Prepara-se uma / ml solução amarelo Lucifer 5 mg: Dissolver 10 mg de pó de LY (fornecida com o electroporador) em 2 ml de meio de crescimento isento de cálcio. Para os experimentos que requerem tempos de incubação mais longos, filtro de esterilizar a solução e armazenar a ⁴ ° C.
2. Aspirar o meio de crescimento e lavar as células com meio livre de cálcio, tendo o cuidado para não arranhar a monocamada ou secar as células. Se as células são secas têm geralmente núcleos mais escuras e pegar LY sem electroporação. O efeito é mais pronunciado no meio do slide que está mais exposto a correntes de ar (Figura 4F).
3. Com uma pipeta de Eppendorf, pipetar a solução corante para as células (400 ul para o conjunto da câmara), na extremidade da câmara, being cuidado para não tocar a camada de células.
4. Coloque a câmara no suporte fornecido com o electroporador e aplicar um impulso de força adequada (ver discussão).
5. Aspirar cuidadosamente um pouco da solução LY. Ele pode ser reutilizada uma segunda vez para experiências menos importantes.
6. Adicionar DMEM livre de cálcio com 10% de soro dialisado.
7. Incubar as células durante 3-5 minutos na incubadora para permitir a transferência de corante através de junções de hiato.
   NOTA: A inclusão de soro dialisado, neste ponto ajuda encerramento dos poros.
8. Lavar o corante não incorporado com DMEM isento de cálcio para a observação de células vivas. Alternativamente, as células podem ser fixadas nesta fase, por meio da adição de 4% de formaldeído para o bem, em seguida, lavadas com PBS (solução salina tamponada com fosfato). Em todos os casos, a lavagem deve remover todo o fundo.
   NOTA: Em experimentos preliminares para determinar as condições ideais, se a tensão é muito baixa, então é possível para permitir que as células se recuperar no incubator durante alguns minutos e electroporate mesma lâmina uma segunda vez, para economizar no custo de lâminas.

3. exame microscópico

1. Observar as células sob iluminação de fluorescência, utilizando um microscópio invertido equipado com o filtro apropriado para o corante a ser utilizado. Para Lúcifer amarelo, excitação é 423nm, emissão de 555nm, filtro VCI para um microscópio Nikon IX70.
2. Eliminar efeitos de menisco, colocando uma lamela de vidro na parte superior do poço de plástico, depois do enchimento ele para o topo com o líquido, para examinar a morfologia das células sob contraste de fase. Para melhores imagens, o poço pode ser isolada a partir da lâmina, e a lamela colocada sobre a moldura. Para as células fixas, o poço pode ser preenchido com glicerol para observação microscópica, enquanto para as células vivas, deve ser preenchido com o meio de crescimento.
   NOTA: Lavagem e fotografando é mais fácil se as células são fixadas com formaldeído após a transferência do corante (passo 2.7 acima). Se as células não sãot fixo, a fluorescência é eliminada das células dentro de aproximadamente 60 min, dependendo do tipo de célula, da tensão e da quantidade de LY introduzido enquanto em células fixas fluorescência é mantida durante várias horas. No entanto, a fluorescência ou dissipa após se desvanece O / N a incubação, até mesmo em células fixadas. Por esta razão, deve ser feita fotografias logo após a electroporação (Figura 2).

4. quantificação de comunicação intercelular

1. Fotografar as células com uma objectiva de 20x sob contraste de fase e fluorescência (Figura 3).
2. Identificar e marcar com uma estrela as células eletroporados na fronteira com a área não-electroporados (Figura 2, seta, borda eletroporação).
3. Identificar e marcar com um ponto de células fluorescentes no lado não-electroporado, em que o corante foi transferida através de junções de hiato (Figuras 3A e 3B).
4. Dividir o número total decélulas fluorescentes na área de não-electroporado pelo número de células electroporadas ao longo da borda (Figuras 3A e 3B).
   NOTA: A transferência de, pelo menos, 200 células de fronteira electroporadas contíguos é calculado para cada experiência. O valor obtido é o valor CIJH.

Resultados

A Figura 2 mostra as células epiteliais de fígado de rato ²² T51B, electroporadas com LY e fotografadas sob fluorescência (painel A e B) ou de contraste de fase (C), na sequência de fixação de iluminação e de lavar roupa. No painel A, a borda da área de electroporação é marcado a vermelho. O gradiente de fluorescência para a direita da linha vermelha indica a transferência através de junções de hiato. Na Figura 3A e 3B, a quantificação da c...

Discussão

As etapas críticas no protocolo

Material de electroporados
A pureza do material a ser electroporada é muito importante. Se as células são muito plana, então as concentrações mais elevadas do corante de rastreio devem ser usados ​​(até 20 mg / ml para LY) e em tais casos, a pureza é mais importante do que em células com uma forma mais esférica ^1. Além LY uma grande variedade de outros corantes ou moléculas nonpermeant têm sido empregues, tais...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Cellgro http://www.cellgro.com/	50-013-PB
DMEM without Calcium	Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)	SH30319-01
Donor Calf Serum	PAA: http://www.paa.com/	Cat.# B15-008
Fetal Bovine Serum	PAA: http://www.paa.com/	Cat.# A15-751
Electroporation apparatus	Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/	ACE-100
Chambers	Cell Projects Ltd UK	ACE-04-CC	4-wells
Chambers	Cell Projects Ltd UK	ACE-08-CC	8-wells
Lucifer Yellow	Cell Projects Ltd UK	ACE-25-LY	High purity
CelTak	BD Biosciences	354240	Cell and tissue adhesive
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
Collagen	BD Biosciences	354236
Poly-Lysine	Sigma Aldrich	P8920