Un test funzionale per Gap giunzionale esame; Elettroporazione di cellule aderenti su indio-Tin Oxide

Riepilogo

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Abstract

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.  Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

Introduzione

L'applicazione di corrente elettrica a una cella provoca la formazione di pori nella membrana cellulare, da un processo chiamato elettroporazione. I pori permettono il passaggio di una varietà di molecole nonpermeant attraverso la membrana. Il campo elettrico può essere controllata con precisione, in modo che i pori formati sono molto piccole e richiudersi rapidamente, con il minimo disturbo per la fisiologia cellulare. È interessante notare, cellule aderenti possono essere coltivate su un vetrino rivestito con ossido di indio-stagno conduttivo e trasparente (ITO) e elettroporate in situ, che si trova sulla superficie dove crescono, senza essere distaccato per essere elettroporate in sospensione. Le cellule possono crescere molto bene su questa superficie, e come sono collegati ed estese, osservazione microscopica dettagliata è possibile. Usando questa tecnica, piccole molecole nonpermeant possono essere introdotti istantaneamente e in sostanza il 100% delle cellule, che rende questa tecnica particolarmente adatto per studi sull'attivazione di components di un percorso seguito stimolazione ligando di un recettore (recensito in ^1).

L'elettroporazione è stata utilizzata principalmente per l'introduzione di DNA (chiamato anche electrotransfection). Tuttavia, elettroporazione in situ può essere utile per l'introduzione di una grande varietà di molecole, come peptidi ^2-4, oligonucleotidi antisenso, come RNA, oligonucleotidi a doppio filamento di DNA esca per inibire fattore di trascrizione vincolante, o siRNA ^{3,5, 6, 7-10} nucleotidi radioattivi, proteine ^{​​11 12} o pro-farmaci ^13. A seguito di elettroporazione, le cellule possono essere lisate per analisi biochimiche o fissate e colorate con anticorpi.

Il rivestimento conduttivo ITO è molto sottile, 800-1,000Å, in modo che la crescita cellulare non è disturbato dalla differenza di altezza delle due superfici, come le cellule crescono lungo il bordo del rivestimento conduttivo. Questo offre il vantaggio che non electropciente cellule possono essere coltivate fianco a fianco con quelli elettroporate, per servire come controlli. Lo stesso approccio può essere utilizzato per l'esame di spazi di giunzione, la comunicazione intercellulare (GJIC), come descritto nel video.

Giunzioni sono canali che collegano gli interni di celle adiacenti ^14. Gap giunzionale, comunicazione intercellulare svolge un ruolo importante nella formazione del tumore e metastasi, mentre oncogeni quali Src sopprimono GJIC ^15,16. Per esaminare GJIC un colorante fluorescente, come Lucifero giallo (LY) è spesso introdotto in cellule in coltura tramite microiniezione o raschiare carico ¹⁷ e la diffusione del colorante nelle cellule vicine all 'osservazione microscopica sotto illuminazione a fluorescenza. Queste tecniche però invariabilmente causano danni alle cellule. Descriviamo ora una tecnica in cui le cellule sono coltivate su un vetrino che è parzialmente ricoperto di ITO ^18. Un impulso elettrico è stato applicato in presenza di LY (o altri coloranti) cautilizzando la sua penetrazione nelle cellule in crescita da parte conduttiva della diapositiva, mentre la migrazione colorante per le adiacenti, cellule non elettroporate è stata osservata al microscopio con illuminazione a fluorescenza. Per evitare di cellule sensibili inquietanti che possono tendere a staccarsi dalla monostrato, un'assemblea è stato progettato che non richiedono un elettrodo per essere posizionato sulla parte superiore delle cellule di applicare la corrente elettrica ^19. Questo approccio offre la possibilità di quantificare GJIC in un gran numero di cellule, senza alcun disturbo rilevabile al metabolismo cellulare, come indicato dall'assenza di un effetto sulla durata della fase G1 seguente siero stimolazione ^12, aumento dei livelli di FOS protooncogene proteine ​​(Raptis, inedito) o due chinasi associate a stress cellulare, il ^maiale p38 o JNK / SAPK chinasi ^1. Questo approccio ha reso possibile l'esame del legame tra i livelli di espressione dell'oncogene, trasformazione e GJIC ^18, nonché l'effetto di Src e Stat3 su GJIC in una varietà di tipi cellulari, comprese le cellule in coltura fresco da campioni di tumore del polmone ^20-23. Inoltre, in elettroporazione situ con la configurazione descritta, che manca di un elettrodo superiore è stato impiegato con successo per la manifestazione di chiusura del gap junction sulla differenziazione adipocytic, anche se l'attaccamento cellulare al substrato è ridotto in quella fase ^19,24.

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Protocollo

1 placcatura le cellule del elettroporazione Chambers

1. In una cappa a flusso laminare, trypsinize le celle utilizzando una tecnica sterile, come al solito.
   NOTA: E 'molto importante eliminare mediante centrifugazione tutte le tracce di tripsina, perché possono ostacolare la diffusione delle cellule sul vetro, quindi la formazione di adherens e giunzioni.
2. Pipettare 1 ml di sospensione cellulare nelle camere di elettroporazione sterili forniti con il elettroporatore in situ (Figura 1), e posto a 37 ^{° C,} CO ₂ incubatore.
   NOTA: l'adesione delle cellule può essere migliorata placcatura su fibronectina, collagene, poli-lisina o di cellule e tessuti adesivo (vedi Materiali Tabella).
3. Quando le cellule hanno formato uno strato confluente sono pronti per l'esame GJIC.

2 elettroporazione Procedura

Elettroporazione per l'esame GJIC può essere condotta al di fuori di una cappa a flusso laminare,dal momento che richiede solo pochi minuti. Se sono necessari tempi di incubazione più lunghi per un esperimento specifico, allora può essere condotta interamente in una cappa a flusso laminare. In tutti i casi, le sezioni dove si coltivano le cellule devono essere sterili.

1. Preparare una / ml soluzione gialla Lucifero 5 mg: sciogliere 10 mg di polvere LY (fornito con il elettroporatore) in 2 ml di terreno di coltura privo di calcio. Per esperimenti che richiedono tempi di incubazione più lunghi, filtro-sterilizzare la soluzione e conservare a 4 ^{° C.}
2. Aspirare il terreno di crescita e lavare le cellule con terreno privo di calcio, facendo attenzione a non graffiare il monostrato o asciugare le cellule. Se le cellule sono asciugati solito hanno nuclei più scuri e raccogliere LY, senza elettroporazione. L'effetto è più pronunciato nel mezzo della slitta che è più esposto a correnti d'aria (Figura 4F).
3. Con una pipetta Eppendorf, pipetta la soluzione colorante per le cellule (400 microlitri per tutta la camera), sul bordo della camera, being attenzione a non toccare lo strato di cellule.
4. Posizionare la camera nel supporto fornito con il elettroporatore e applicare un impulso della forza appropriata (vedi discussione).
5. Aspirare accuratamente alcuni della soluzione LY. Può essere riutilizzato una seconda volta per esperimenti meno importanti.
6. Aggiungi DMEM privo di calcio contenente siero dializzato del 10%.
7. Incubare le cellule per 3-5 minuti in incubatrice per consentire il trasferimento colorante attraverso giunzioni gap.
   NOTA: L'inclusione di siero dializzato, a questo punto aiuta chiusura dei pori.
8. Lavare il colorante costituite in società con DMEM senza calcio per l'osservazione di cellule vive. In alternativa, le cellule possono essere fissate in questa fase, attraverso l'aggiunta di 4% di formaldeide al pozzo, poi lavate con PBS (soluzione salina tamponata con fosfato). In tutti i casi il lavaggio deve rimuovere tutta sfondo.
   NOTA: In esperimenti preliminari per determinare le condizioni ottimali, se la tensione è troppo bassa, allora è possibile lasciare che le cellule recuperare nel incubator per alcuni minuti e l'elettroporazione stesso vetrino una seconda volta, per risparmiare nel costo di diapositive.

3 Esame microscopico

1. Osservare le cellule sotto illuminazione a fluorescenza, utilizzando un microscopio invertito equipaggiato con il filtro appropriato per il colorante utilizzato. Per Lucifero giallo, eccitazione è 423nm, 555nm emissione, filtro WBV per un microscopio Nikon IX70.
2. Eliminare effetti menisco mettendo un vetro di copertura antiscivolo sulla parte superiore della plastica e, dopo il riempimento al top con il liquido, per esaminare la morfologia delle cellule in contrasto di fase. Per le foto migliori, il pozzo può essere staccato dalla diapositiva, e il coprioggetto posto sul telaio. Per cellule fissate, il pozzo può essere riempito con glicerolo per l'osservazione microscopica, mentre per le cellule vive deve essere riempito con terreno di crescita.
   Attenzione: Il lavaggio e la fotografia è più facile se le cellule vengono fissate con formaldeide a seguito del trasferimento del colorante (precedente punto 2.7). Se le cellule sonot fissato, la fluorescenza viene eliminata dalle cellule entro circa 60 minuti a seconda del tipo di cellula, la tensione e la quantità di LY introdotto mentre nelle cellule fissate fluorescenza viene mantenuta per diverse ore. Tuttavia, fluorescenza svanisce o si dissolve dopo O / N incubazione, anche in cellule fissate. Per questo motivo, illustrazioni, devono essere prese subito dopo l'elettroporazione (Figura 2).

4. quantificazione di comunicazione intercellulare

1. Fotografa le cellule con un obiettivo 20x in fluorescenza e contrasto di fase (Figura 3).
2. Identificare e contrassegnare con una stella le cellule elettroporate al confine con la zona non elettroporate (figura 2, freccia, bordo elettroporazione).
3. Identificare e segnare con un punto le cellule fluorescenti sul lato non-elettroporate, in cui il colorante è trasferito attraverso giunzioni gap (Figure 3A e 3B).
4. Dividere il numero totale dicellule fluorescenti sulla zona non elettroporate per il numero di cellule elettroporate lungo il bordo (Figure 3A e 3B).
   NOTA: Il trasferimento di almeno 200 cellule elettroporate di frontiera contigue viene calcolato per ogni esperimento. Il numero ottenuto è il valore GJIC.

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Risultati

La figura 2 mostra fegato di ratto cellule epiteliali T51B ^22, elettroporate con LY e fotografati sotto fluorescenza (pannello A e B), o contrasto di fase (C) illuminazione, seguito fissaggio e lavaggio. Nel pannello A, il bordo dell'area elettroporate è indicato in rosso. Il gradiente di fluorescenza a destra della linea rossa indica il trasferimento attraverso giunzioni gap. Nella Figura 3A e 3B, viene mostrata la quantificazione di comunicazione gap g...

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Discussione

Passaggi critici nel protocollo

Materiale elettroporate
La purezza del materiale da elettroporate è molto importante. Se le cellule sono molto piatto, devono essere utilizzate concentrazioni più elevate di poi il colorante inseguimento (fino a 20 mg / ml per LY) e in tali casi, la purezza è ancora più importante che nelle cellule con una forma più sferica ^1. Oltre LY una grande varietà di altri coloranti o molecole nonpermeant sono stati impiegati, come...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Cellgro http://www.cellgro.com/	50-013-PB
DMEM without Calcium	Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)	SH30319-01
Donor Calf Serum	PAA: http://www.paa.com/	Cat.# B15-008
Fetal Bovine Serum	PAA: http://www.paa.com/	Cat.# A15-751
Electroporation apparatus	Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/	ACE-100
Chambers	Cell Projects Ltd UK	ACE-04-CC	4-wells
Chambers	Cell Projects Ltd UK	ACE-08-CC	8-wells
Lucifer Yellow	Cell Projects Ltd UK	ACE-25-LY	High purity
CelTak	BD Biosciences	354240	Cell and tissue adhesive
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
Collagen	BD Biosciences	354236
Poly-Lysine	Sigma Aldrich	P8920