JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Аннотация

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.  Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

Введение

Применение электрического тока в клетку приводит к образованию пор на клеточной мембране, с помощью процесса, называют электропорации. Поры обеспечивают прохождение различных nonpermeant молекул через мембрану. Электрическое поле может управляться точно, так что поры, образованные очень малы и быстро повторного, с минимальным нарушением к клеточной физиологии. Интересно, прилипшие клетки могут быть выращены на предметное стекло, покрытой проводящим и прозрачной оксида индия-олова (ITO) и электропорации на месте, то есть на поверхности, где они растут, не будучи оторванными быть электропорации в суспензии. Клетки могут расти очень хорошо на этой поверхности, и как они связаны и расширен, детальное микроскопическое наблюдение можно. При использовании этого метода, небольшие nonpermeant молекулы могут быть введены мгновенно и в по существу 100% клеток, что делает этот метод особенно подходит для исследований по активации компonents из тропе следующие лиганда стимуляции рецепторов (обзор 1).

Электропорация был использован в основном для введения ДНК (также называется electrotransfection). Тем не менее, электропорацию на месте может быть полезным для введения большого разнообразия молекул, таких как пептиды 2-4, олигонуклеотидов, таких как антисмысловой РНК, двухцепочечных олигонуклеотидов ДНК-ловушек для ингибирования связывания фактора транскрипции, и миРНК 3,5, 6, радиоактивные нуклеотиды 7-10, белки 11 12 или пролекарства 13. После электропорации клетки можно лизировать для биохимических анализов или фиксировали и окрашивали антителами.

Проводящий ITO покрытия является очень тонким, 800-1,000Å, таким образом, что рост клеток не нарушается по разнице в высоте двух поверхностей, как клетки растут по краю проводящего покрытия. Это дает то преимущество, что не-electropораторствовал клетки могут быть выращены бок о бок с электропорации те, в качестве контрольной группы. Тот же самый подход может быть использован для изучения зазора соединительного, межклеточных взаимодействий (GJIC), как описано в видео.

Щелевые контакты каналы, соединяющие интерьеры соседних ячеек 14. Зазор узловой, межклеточной коммуникации играет важную роль в формировании опухоли и метастаз, а онкогены, такие как Src подавить GJIC 15,16. Чтобы исследовать GJIC флуоресцентный краситель, такой как Lucifer желтый (LY) часто вводят в культивируемые клетки с помощью микроинъекции или царапать-нагрузку 17 и диффузии красителя в соседних ячеек под микроскопом наблюдали под флуоресцентным освещением. Эти методы, однако, неизменно вызывают повреждения клеток. Опишем технику, где клетки, выращенные на предметное стекло, которое частично покрытой ITO 18. Электрический импульс был применен в присутствии LY (или других красителей) чаиспользуя ее проникновение в клетки, растущие на проводящей части слайда, в то время как миграция красителя с соседними, не-электропорации клеток под микроскопом наблюдается через флуоресценции освещения. Чтобы не беспокоить чувствительные клетки, которые могут иметь тенденцию отделить от монослоя, сборка была разработана, что не требует электрод должны быть размещены в верхней части клеток для применения электрического тока 19. Этот подход дает возможность количественного GJIC в большом количестве клеток, без обнаруживаемого помех на клеточный метаболизм, как показано отсутствие эффекта от длины фазе G1 следующей сыворотки стимуляции 12, увеличение уровней ФОС протоонкоген белок (Raptis, не опубликовано) или две киназы, связанные с клеточным стрессом, р38 свиней или JNK / SAPK киназы 1. Такой подход сделал возможным изучение связи между уровнем экспрессии онкогенов, преобразования и ГДжИК 18, а также эффект Src и Stat3 на GJIC в различных типах клеток, в том числе клеток, культивированных из свежих опухолей легких образцов 20-23. Кроме того, на месте электропорации на установке, описанной в котором отсутствует верхний электрод успешно применяется для демонстрации закрытия щелевых контактов по adipocytic дифференциации, хотя сотовой крепления к подложке снижается на этом этапе 19,24.

протокол

1 Покрытие ячеек в электропорации палат

  1. В ламинарном потока, Trypsinize клетки с использованием стерильной техники, как обычно.
    Примечание: Очень важно, чтобы устранить путем центрифугирования все следы трипсина, так как они могут помешать распространению клеток на стекле, следовательно, образование слипчивых и щелевых контактов.
  2. Внесите 1 мл клеточной суспензии в стерильных камерах электропорации, поставляемых с на месте электропоратора (рисунок 1), и место в 37 ° С, CO 2 инкубаторе.
    Примечание: адгезию клеток может быть улучшена путем высева на фибронектин, коллаген, поли-лизин или клеточной и тканевой клей (см материалы таблицу).
  3. Когда клетки сформировали сливающийся слой они готовы к GJIC экспертизы.

2 Электропорация Порядок

Электропорация для экспертизы GJIC может проводиться вне ламинарном потока,так как это занимает всего несколько минут. Если более длинные периоды инкубации требуется для конкретного эксперимента, то она может быть проведена полностью в вытяжном шкафу с ламинарным потоком. Во всех случаях, камеры, где выращивают клетки должны быть стерильными.

  1. Подготовьте 5 мг / мл Люцифера желтый раствор: растворить 10 мг LY порошок (поставляется с электропоратора) в 2 мл кальция среде без роста. Для экспериментов, что требует большего времени инкубации, фильтр-стерилизовать решение и хранят при 4 ° С.
  2. Аспирируйте питательную среду и промыть клетки с бескальциевой среды, стараясь не поцарапать монослой или высушить клетки. Если клетки сушат они обычно имеют более темные ядра и забрать LY без электропорации. Эффект более выражен в середине слайда, который подвергается воздействию более потоков воздуха (4F) Рис.
  3. С пипетки Eppendorf, пипетки раствора красителя к клеткам (400 мкл для всей камере), на краю камеры, бEing осторожны, чтобы не коснуться слой клеток.
  4. Поместите камеру в держателе, поставляемой с электропоратора и применить импульс соответствующей величины (см Обсуждение).
  5. Тщательно аспирата некоторые решения LY. Она может быть использована во второй раз менее важных экспериментов.
  6. Добавить бескальциевой DMEM, содержащей 10% диализу сыворотку.
  7. Инкубируйте клетки в течение 3-5 мин в инкубаторе, чтобы обеспечить передачу краску через щелевые контакты.
    Примечание: Включение диализованного сыворотки в этой точке помогает закрытие пор.
  8. Вымойте неинкорпорированную краситель с бескальциевой DMEM для живого наблюдения клеток. С другой стороны, клетки могут быть закреплены на этой стадии, путем добавления 4% формальдегидом в скважине, а затем промывали PBS (фосфатно-солевой буфер). Во всех случаях стиральная должны удалить все фон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В предварительные эксперименты, чтобы определить оптимальные условия, если напряжение слишком низкое, то можно позволить клетки восстановить в incubatoг в течение нескольких минут и электропорации одном слайде во второй раз, чтобы сохранить в стоимость горок.

3 Микроскопическое исследование

  1. Соблюдайте клетки под флуоресцентным освещением, использованием инвертированного микроскопа, оснащенный соответствующим фильтром для красителя используется. Для Люцифера желтого, возбуждение 423nm, 555nm выбросов, WBV фильтр для микроскопом Nikon IX70.
  2. Ликвидировать последствия мениска путем размещения стеклянной крышкой скольжения в верхней части пластика также, после заполнения его к вершине с жидкостью, чтобы изучить клеток морфологию под фазового контраста. Для улучшения изображений, также может быть отделен от ползуна, и покровное размещены на раме. При фиксированных клеток, также могут быть заполнены с глицерином для микроскопического наблюдения, в то время как для живых клеток она должна быть заполнена средой роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стиральная и фотосъемка легче, если клетки фиксировали с формальдегидом после перевода красителя (шаг 2.7 выше). Если клетки нетT фиксировано, флуоресценции выводится из клеток в течение примерно 60 мин в зависимости от типа клеток, напряжения и количества обычно выводят в то время как в основной клеток флуоресценции сохраняется в течение нескольких часов. Однако, флуоресценция исчезает или рассеивается после O / N инкубации, даже в фиксированных клетках. По этой причине, фотографии должны быть приняты вскоре после электропорации (рисунок 2).

4 Количественное определение межклеточной коммуникации

  1. Сфотографировать клетки с 20-кратным цели под флуоресценции и фазового контраста (рисунок 3).
  2. Определите и отметьте со звездой электропорации клетки на границе с не-электропорации области (рис 2, стрелки, электропорации край).
  3. Определите и отметьте с точки флуоресцирующих клеток на не-электропорации стороны, где краситель передал через щелевые контакты (3А и 3В).
  4. Разделить общее количествофлуоресцирующих клеток на не-электропорации области по количеству электропорации клеток по краю (3А и 3В).
    Примечание: Передача по меньшей мере, 200 смежных электропорации клеток пограничных рассчитывается для каждого эксперимента. Полученное число является значением GJIC.

Результаты

На рисунке 2 показан печени крыс эпителиальных T51B клетки 22, электропорации с LY и сфотографированных под флуоресценции (панели А и Б), или фазоконтрастной (C) освещение, следующие фиксации и промывки. В панели А, край электропорации области отмечены красным цветом. Градиент ...

Обсуждение

Критические шаги в протоколе

Электропорации материал
Чистота материала, подлежащего электропорации является очень важным. Если клетки очень плоским, то более высокие концентрации красителя для отслеживания должны быть использованы (до 20 мг / мл в течение ю?...

Раскрытие информации

The corresponding author is the inventor in a patent held by Queen’s University, which has been licensed to Cell Projects Inc. The company or the University had no influence upon the contents of the paper.

Благодарности

We thank Lowell Cochran for expert videography assistance. The financial assistance of the Canadian Institutes of Health Research (CIHR), the Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), the Canadian Breast Cancer Research Alliance, the Ontario Centers of Excellence, the Breast Cancer Action Kingston and the Clare Nelson bequest fund through grants to LR is gratefully acknowledged. SG was the recipient of an NSERC studentship. MG was supported by a postdoctoral fellowship from the US Army Breast Cancer Program, the Ministry of Research and Innovation of the Province of Ontario and the Advisory Research Committee of Queen’s University.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMCellgro http://www.cellgro.com/50-013-PB
DMEM without CalciumHyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)SH30319-01
Donor Calf Serum PAA: http://www.paa.com/Cat.# B15-008
Fetal Bovine SerumPAA: http://www.paa.com/Cat.# A15-751
Electroporation apparatusCell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ACE-100
ChambersCell Projects Ltd UKACE-04-CC4-wells
ChambersCell Projects Ltd UKACE-08-CC8-wells
Lucifer YellowCell Projects Ltd UKACE-25-LYHigh purity
CelTakBD Biosciences354240Cell and tissue adhesive
FibronectinSigma AldrichF1141
CollagenBD Biosciences354236
Poly-LysineSigma AldrichP8920

Ссылки

  1. Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. Electroporation protocols. , 167-183 (2008).
  2. Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking. Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).
  3. Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway. Nature. 391, 285-288 (1998).
  4. Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth. Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).
  5. Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M. Ets up-regulates met transcription. Oncogene. 13, 1911-1917 (1996).
  6. Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. Transfection techniques affecting Stat3 activity levels. Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).
  7. Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1. Science. 278 (5335), 124-128 (1997).
  8. Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP. DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).
  9. Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells. DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).
  10. Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins. Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).
  11. Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis. J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).
  12. Raptis, L., Firth, K. L. Electroporation of adherent cells in situ. DNA Cell Biol. 9, 615-621 (1990).
  13. Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy. Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).
  14. Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H. Gap junctions. Compr Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  15. Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors. Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).
  16. Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
  17. Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).
  18. Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide. DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).
  19. Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes. Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).
  20. Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells. Lab Invest. 78, 639-640 (1998).
  21. Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. Gap junctional communication in lung carcinoma cells. Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).
  22. Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts. DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).
  23. Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells. BMC Cancer. 12, 605 (2012).
  24. Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes. DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).
  25. Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities. Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).
  26. Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
  27. Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).
  28. Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide. J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).
  29. Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide. Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).
  30. Meda, P. Assaying the molecular permeability of connexin channels. Methods Mol Biol. 154, 201-224 (2001).
  31. Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).
  32. Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts. Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).
  33. Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells. Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).
  34. Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
  35. Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen. Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

92Stat3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены