على الطريقة مناعي لتوصيف خلايا المريء باريت

Summary

هناك حاجة ملحوظة لتحسين المعلومات عن السائقين الجزيئية من المريء باريت. تلوين مناعي هو تقنية مفيدة لفهم آثار إشارة الخلية على مورفولوجيا الخلايا. نقدم بروتوكول بسيطة وفعالة لاستخدام مناعي تلطيخ لتقييم العلاجية في خلايا المريء باريت.

Abstract

غدية المريء (EAC) لديه معدل البقاء على قيد الحياة عموما أقل من 17٪ وارتفع معدل الإصابة EAC بشكل كبير خلال العقدين الماضيين. واحد من عوامل الخطر الرئيسية للEAC هو المريء باريت (BE)، وهو تغيير حؤولي من المريء الحرشفية العادي ردا على حرقة مزمنة. على الرغم من اتصال راسخة بين EAC وأن تكون والاستجواب من الأحداث الجزيئية، وخاصة مسارات الإشارات التي تنطوي على تغير تطور هو EAC، ولا يزال الغموض يكتنف. الكثير من هذا يعود لعدم وجود مناسبة في نماذج المختبر متاح لدراسة هذه الأمراض. في الآونة الأخيرة، أصبحت خطوط BE خلية خلد المتاحة تجاريا يسمح لفي المختبر دراسات BE. هنا، نقدم طريقة لتلوين مناعي من خطوط الخلايا خلد BE، مما يسمح في توصيف المختبر من إشارات الخلية والهيكل بعد التعرض للمركبات العلاجية. وتطبيق هذه التقنيات هيلع تطوير التبصر في الآليات التي تشارك في BE لEAC التقدم وتوفير السبل المحتملة للعلاج والوقاية من EAC.

Introduction

المريء باريت (BE) هو تغيير حؤولي في ظهارة الحرشفية العادي من المريء ونتيجة التعرض المزمن لمحتويات المعدة الناتجة عن مرض الجزر المعدي المريئي (GERD) ^1. BE ويعتقد أن تكون آلية وقائية في التصدي لارتجاع المريء، ولكن وجود BE يضفي على زيادة خطر غدية المريء (EAC)، وهو المرض الذي يحمل الفقراء بشكل كبير البقاء على قيد الحياة ^1. وتشير التقديرات الحالية إلى أن ما يصل إلى 5.6٪ من سكان أمريكا قد تكون، ولكن كما هو في كثير من الأحيان أعراض BE، ويعتقد أن غالبية BE لا تزال غير مشخصة ^2. كما شهدت معدلات وقوع كل من ارتجاع المريء وEAC استمرار النمو ^3، فقد أصبح من المهم لفهم الآليات الجزيئية المشاركة في تطور BE لEAC، وخصوصا هذه المعلومات يمكن أن يوفر النهج العلاجية من أجل منع تطور BE لEAC.

وقد أسفرت نتائج الدراسات> المريض الموجهة في النموذج الحالي من BE-EAC المرضية ^1. الالتهابات المزمنة، والإصابات، والأضرار السمية الناتجة عن التعرض لفترات طويلة لمحتويات المعدة ممارسة ضغوط انتقائية على BE الآفة تعزيز تطور الأورام لمجموعة شرق افريقيا. وقد تم تحديد عدد من التعديلات الوراثية خلال BE لتطور EAC. ومع ذلك، على الرغم من هذا هناك نقص واضح في الفهم عن التغييرات الدقيقة في إشارة الخلية والآثار اللاحقة على بنية الخلية ووظيفتها.

خلدت في خطوط الخلايا في المختبر هي أدوات مفيدة لدراسة آثار إشارة الخلية، ولا سيما في التحقيق في الآثار المترتبة على المركبات العلاجية المستهدفة. توافر التجارية مؤخرا مخلد BE خطوط الخلايا يسمح لمثل هذه الدراسات. على الرغم من أن فحوصات عالية الإنتاجية، مثل فحوصات الجدوى المستعملة على نطاق واسع، ويمكن أن تكون ذات قيمة في تقييم آثار العلاجات المستهدفة على تكاثر الخلايا وسوrvival ^4-6، وهذه المقايسات ليست مفيدة لاستجواب آثار إشارة الخلية على مورفولوجيا الخلايا. تلطيخ مناعي (IF) هو تقنية مفيدة للتحقيق في آثار العلاجات المستهدفة على الخصائص المورفولوجية، والنمو، والبقاء على قيد الحياة من الخلايا والبروتينات التي ينطوي عليها. مختبرنا تكيفت هذه الطرق نحو خطوط BE خلية خلد، وذلك باستخدام IF لتقييم آثار المخدرات المتوفرة سريريا على خطوط الخلايا BE أملا في ترسيم ممكن علاج chemopreventative والعلامات البيولوجية لعلاج المخدرات ^7. وبالمثل، وتطبيق هذه التقنيات في مجموعة شرق افريقيا، وتكون خطوط الخلايا خلد المريء وقد حددت نتائج حاسمة بشأن BE لEAC تطور ^8-10. نجد IF تحليل الخلايا BE تعامل مع العلاجات المستهدفة لها قيمة، مما يسمح لتوصيف التغيرات في بنية الخلية والترجمة البروتين. هنا، نقدم طرقنا لIF من الخلايا BE مخلد إلى جharacterize العلاج من تعاطي المخدرات.

Protocol

1. صيانة الخط الخليوي

1. BE الإنسان خلد خلل التنسج عالية الجودة (CP-B، CP-C، CP-D) وحؤولي (CP-A) من قبل خطوط الخلايا ترنسفكأيشن مستقرة من تيلوميراز الإنسان الناسخ (TERT) بروتين ¹¹ عكس.
2. الحفاظ BE خطوط الخلايا القرنية في وسائل الإعلام تستكمل مع استخراج الغدة النخامية البقري (BPE)، عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي)، و 5٪ مصل بقري جنيني (FBS)، والأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، البنسلين الستربتوميسين، النيوميسين (PSN)، ومعيار شروط زراعة الأنسجة (37 درجة مئوية، 5٪ CO _2، 98٪ الرطوبة).

2. BE الخليوي تصفيح

1. إعداد 12 جيدا لوحة / coverslips. وضع 18 ملم coverslips في كوب طبق بتري والأوتوكلاف. نقل تعقيمها 18 coverslips الزجاج ملم إلى 12 طبق جيدا زراعة الأنسجة باستخدام ماصة زجاجية معقمة تعلق على أنبوب فراغ. غسل ساترة مع برنامج تلفزيوني العقيمة وسائل الإعلام.
2. يعرض للتريبسين عد الخلايا وBE خلد. عد الخلايا باليودنانوغرام عداد الخلايا الآلي أو عدادة الكريات. تمييع الخلايا في وسائل الإعلام والثقافة إلى تركيز 20،000-40،000 خلية / مل.
3. وضع 1 مل من الخلايا في كل بئر يحتوي على ساترة لعدد خلايا مجموعه 20،000-40،000 خلايا / جيد.
4. استخدام غيض ماصة معقمة لدفع بلطف ساترة إلى قاع البئر لضمان أن الخلايا نعلق على ساترة.

3. معالجة المخدرات من خلايا BE

1. تمييع المخدرات مختارة في الحارة (37 درجة مئوية) وسائل الإعلام إلى التركيز المطلوب وتخلط جيدا بواسطة قلب الأنبوب بشكل متكرر أو باستخدام خلاط دوامة. تركيزات المخدرات تحدد تجريبيا. بدء العلاج 24 ساعة بعد البذر الأولي للخلايا BE للسماح للخلايا المرفقات إلى ساترة
2. للمقارنة والسيطرة، وعلاج ساترة إضافية للخلايا يكون مع السيارة 0.1٪ (ثنائي ميثيل سلفوكسيد [دمس]] أو وكيل تستخدم لذوبان مركب) المخفف في وسائل الإعلام والثقافة. لوحة التسمية مع قلم المختبر لتحديد المخدرات وهاءhicle تعامل العينات. وضع الخلايا في خلية ثقافة حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO _2، 98٪ الرطوبة واحتضان للحصول على نقاط الوقت المطلوب.

4. مناعي تلطيخ

1. تثبيت
   1. بعد فترة حضانة المطلوب من العلاج من تعاطي المخدرات، ونضح وسائل الإعلام وغسل coverslips بسرعة مع الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS) في درجة حرارة الغرفة (RT، 25 ° C).
   2. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 4٪ PFA [4٪ PFA / PBS] إلى كل بئر واحتضان على RT لمدة 30 دقيقة.
   3. نضح PFA 4٪ / برنامج تلفزيوني وغسل coverslips 3X، 5 دقائق مع كل برنامج تلفزيوني في RT. متجر coverslips لمدة أسبوع واحد في PBS/0.1٪ PFA في 4 درجات مئوية اذا شئت.
2. Permeabilization / الحظر
   Permeabilize الخلايا PFA الثابتة للسماح للالضد للوصول إلى أهداف داخل الخلايا. لخارج الخلية ظهرت البروتينات، تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة دون SAPONIN تضاف إلى الحل BSA 1X PBS/0.5٪.
   1. خفض الخلفية التي يحتضنها مع 50 ملي NH ₄ الكلورين المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني RT لمدة 5 دقائق.
   2. احتضان BE الخلايا لمدة 30 دقيقة في 100-300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ و 0.5٪ سابونين ألبومين المصل البقري (BSA). تمييع سابونين من المخزون فلتر تعقيم 10٪، أعدت في المياه وتخزينها في 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: هذا يمنع غير محددة ملزمة الأجسام المضادة للبروتينات الخلوية من خلال منع coverslips يرجع ذلك إلى إضافة 0.5٪ BSA. بدلا من ذلك، بديلا BSA مع مصل الماعز المخفف إلى 5٪ للمساعدة في خفض ملزم غير محدد من الأجسام المضادة.
3. إعداد غرفة الإنسان
   1. إعداد طبق الأحيائي مربع بحلول طبقات الجزء السفلي من الغرفة مع مناشف ورقية مبللة ووضع طبقة من parafilm على القمة.
   2. نقل بلطف لل coverslips، والخلايا التي تواجه التصاعدي، على Parafilm باستخدام ملقط وإبرة الحقنة.
   3. بمناسبة Parafilm بالقلم المختبر لتحديد coverslips.
4. الأجسام المضادة الأولية الحضانة
   1. تمييع الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني تحتوي على كل BSA 0.5٪ و 0.1٪ سابونين.
   2. وصمة عار بلطف من عرقلة الحل باستخدام الأنسجة المختبرات وإضافة 100 ميكرولتر من الحل الأجسام المضادة الأولية. احتضان الأجسام المضادة الأولية على خلايا BE بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
5. الأجسام المضادة الثانوية الحضانة
   1. تغسل الشرائح 3x أخرى مع PBS/0.5٪ BSA/0.1٪ سابونين لمدة 5 دقائق كل في RT.
   2. تمييع الضد الثانوية مترافق مع علامة فلوري في PBS/0.5٪ BSA/0.1٪ سابونين أن الأجسام المضادة الثانوية يعترف الأنواع التي تم رفع الأجسام المضادة الأولية.
   3. إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخفف إلى كل ساترة. احتضان الضد الثانوية لمدة 2 ساعة على RT.
6. الغسيل وتركيب Coverslips
   1. غسل coverslips 3X، 5 دقائق في كل من PBS/0.5٪ BSA/0.1٪ سابونين. إزالة غسل العازلة وإضافة 100-300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني للل coverslips.
      ملاحظة: للحصول على ضعف المضادةتلطيخ الجسم، كرر الخطوات من 4،4-4،5 مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية إضافية المطلوب وفقا للمعلومات الواردة في المناقشة.
   2. باستخدام ملقط، ترفع بلطف صعودا ساترة وصمة عار قبالة PBS باستخدام الأنسجة المختبر أو منشفة ورقية.
   3. إضافة 15 ميكرولتر من وسائل الاعلام مكافحة تتلاشى تصاعد مناسبة تحتوي على 4 '،6-diamidino-2-phenylindole (دابي) إلى ساترة وعكس ساترة، وخلايا أسفل، على شريحة المجهر والزجاج.
   4. وضع الشرائح في مجلد واحتضان الشريحة بعيدا عن الضوء المباشر بين عشية وضحاها في RT للسماح للتعيين من الصعب مكافحة تتلاشى المتوسطة لعلاج، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. مرة واحدة وقد وضعت وسيلة مكافحة تتلاشى، والشرائح يمكن تخزينها إما في 4 درجة مئوية أو -20 درجة مئوية حتى التصور المجهرية.

5. التصور المجهري Coverslips

الخلايا الملون يمكن تصويرها إما عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر أو IF microscop تستقيم قادرةه. على الرغم من أن الفحص المجهري متحد البؤر توفر صورا عالية الدقة في أعماق منفصلة، ​​وهي مجهرية تستقيم قادر على انتاج الصور مفيدة بشكل أسرع. للإيجاز، طريقة التصوير الملون BE الخلايا باستخدام المجهر القياسية يرد. بشكل عام، لصورة فلوريسئين ثيوسيانات (FITC) أو fluorophores مماثلة (أي بروتين الفلورية الخضراء)، تكساس الأحمر ودابي، يتطلب المجهر مع مرشحات قادرة على تمييز هذه fluorophores. تحقق المجهر قبل البدء بروتوكول لتحديد fluorophores متوافق.

1. التصوير على IF مجهر قياسي
   1. إزالة تخزين الشرائح / coverslips من -20 درجة مئوية أو 4 درجات مئوية، والسماح لهم لتسخين إلى درجة حرارة الغرفة. الطاقة على المجهر ومصباح قوس الزئبق.
   2. وضع شريحة المجهر مع ساترة تواجه نحو الهدف على المسرح المجهر. لاستخدام هدفا الغمر النفط، إضافة قطرة من زيت الغمر على ساترة.
   3. حدد مرشح دابي وفتح مصراع.
   4. التركيز على الهدف في حين يبحث من خلال العدسات حتى تظهر الصورة. لأن جميع الخلايا وصمة عار مع دابي، ينبغي أن يكون نواة يمكن ملاحظتها بسهولة.
   5. جمع الصور باستخدام برامج معالجة الصور منها.

النتائج

ويتضح مثال للنتائج التي تم الحصول عليها من تطبيق الإجراءات الموضحة في أرقام 1A-D. وعولج Coverslips مع CP-D وCP-C BE الخلايا لمدة 24 ساعة مع 1 ميكرومتر من SRC المانع الأسرة، SKI-606، أو مركبة (DMSO) والملون باستخدام الإجراءات المذكورة أعلاه لالملتصقة مفرق وإشارات Wnt البروتين، β -ca...

Discussion

وقد أوجزنا طريقة لتطبيق IF الخلايا BE نحو توضيح الآثار الفسيولوجية للالعلاجات المستهدفة على هذه الخلايا. في حين وصفناها استخدام هذه الإجراءات نحو الخلايا BE، وجدنا أن هذه الأساليب تنطبق أيضا على مجموعة متنوعة من أنواع مختلفة من الخلايا ^13،17،18. علاوة على ذلك، يمكن ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CP-A (Metaplastic Cell Line)	ATCC	CRL-4027
CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line)	ATCC	CRL-4028
CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line)	ATCC	CRL-4029
CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line)	ATCC	CRL-4030
Keratinocyte-SFM (1x), Liquid	Life Technologies	17005-042
0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red	Life Technologies	25200056
Fetal Bovine Serum, Qualified, HI	Life Technologies	10438026
PSN antibiotic mixture	Life Technologies	15640
PBS - Phosphate-Buffered Saline	Life Technologies	10010049
Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P36931
Circular Glass Coverslip 18 mm	Fisher Scientific	15-183-86
β-catenin Primary Antibody (Rabbit)	Cell Signaling	9562S
Alexa Fluor 488 (Goat Anti-Rabbit)	Life Technologies	A11008
10 cm TC treated PS dish, sterile	USA Scientific	CC7682-3394
12-well TC treated PS plate, sterile	USA Scientific	5666-5180
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Bovine Serum Albumin - Fraction V	Sigma-Aldrich	85040C
SKI-606 (Bosutinib)	Selleck Chemicals	S1014
Square Bioassay Dish	Thermo Scientific	240835
Parafilm	VWR	82024-546
Disposable Pasteur Pipettes, Flint Glass	VWR	14672-380
Nexcelom Mini Cell Counter	Nexcelom
Cellometer Counting Chambers	Nexcelom	CHT4-SD100-014
Zeiss Apotome microscope	Zeiss