O método de imunofluorescência para Caracterização de Células Esôfago de Barrett

Resumo

Há uma necessidade visível de uma melhor informação sobre os condutores moleculares de Esôfago de Barrett. Coloração de imunofluorescência é uma técnica útil para entender os efeitos da sinalização celular na morfologia celular. Nós apresentamos um protocolo simples e eficaz para o uso de coloração de imunofluorescência para avaliar tratamento terapêutico em células esôfago de Barrett.

Resumo

Adenocarcinoma de esôfago (EAC) tem uma taxa de sobrevida global de menos de 17% ea incidência de EAC aumentou dramaticamente ao longo das últimas duas décadas. Um dos principais fatores de risco de EAC é o esôfago de Barrett (BE), uma mudança metaplásico do esôfago escamoso normal em resposta a azia crônica. Apesar da ligação bem estabelecida entre EAC e BE, o interrogatório dos eventos moleculares, particularmente vias de sinalização alterados envolvendo progressão da SER para EAC, são mal compreendidos. Grande parte isto é devido à falta de modelos in vitro adequados disponíveis para estudar estas doenças. Recentemente, as linhas de células imortalizadas BE tornaram-se disponíveis comercialmente permitindo estudos in vitro de BE. Aqui, apresentamos um método para coloração de imunofluorescência de linhas de células imortalizadas BE, permitindo caracterização in vitro de sinalização e estrutura da célula após a exposição a compostos terapêuticos. Aplicação destas técnicas irá help desenvolver insights sobre os mecanismos envolvidos na BE à progressão EAC e fornecer potenciais caminhos para o tratamento e prevenção da EAC.

Introdução

Esôfago de Barrett (EB) é uma mudança metaplásico no epitélio escamoso normal do esôfago e uma consequência da exposição crônica ao conteúdo gástricas resultantes da doença do refluxo gastroesofágico (DRGE) ^1. BE é pensado para ser um mecanismo de proteção em resposta a RGE, no entanto, a presença de BE confere um risco aumentado de adenocarcinoma esofágico (EAC), uma doença que acarreta uma sobrevivência significativamente pobre ^1. As estimativas atuais sugerem que até 5,6% da população americana tem BE, porém, como BE é muitas vezes assintomática, pensa-se que a maioria das BE permanece sem diagnóstico ^2. Como as taxas de incidência de ambos DRGE e EAC têm visto um crescimento contínuo ^3, tornou-se importante para compreender os mecanismos moleculares envolvidos na progressão do BE para EAC, particularmente porque essas informações poderiam fornecer abordagens terapêuticas no sentido de prevenir a progressão da BE à EAC.

Paciente dirigidos resultaram no paradigma atual de BE-EAC patogênese ^1. A inflamação crônica, lesões e danos genotóxicos resultantes da exposição prolongada ao conteúdo gástrico exercer pressão seletiva sobre a lesão estar promovendo a progressão neoplásica a EAC. Uma série de alterações genéticas foram identificadas durante a BE à progressão EAC. No entanto, apesar disso, há uma clara falta de entendimento sobre as mudanças exatas na sinalização celular e os efeitos subsequentes sobre a estrutura e função celular.

Imortalizado em linhas celulares in vitro são ferramentas úteis para o estudo dos efeitos de sinalização de células, particularmente em investigar os efeitos dos compostos terapêuticos alvo. A recente disponibilidade comercial de ser linhas de células imortalizadas permite tais estudos. Embora os ensaios de alto rendimento, como os ensaios de viabilidade amplamente utilizada, pode ser valioso para avaliar os efeitos das terapias-alvo sobre a proliferação celular e survival ^4-6, estes ensaios não são úteis para interrogar os efeitos de sinalização de células sobre a morfologia celular. Coloração de imunofluorescência (IF) é uma técnica útil para investigar os efeitos de terapias específicas sobre as características morfológicas, de crescimento e sobrevivência das células e as proteínas que estão envolvidas. Nosso laboratório adaptou esses métodos para linhas de células imortalizadas BE, usando IF para avaliar os efeitos de uma droga clinicamente disponíveis mediante linhas de células BE na esperança de delinear um possível tratamento quimiopreventivo e biomarcador para tratamento de drogas ^7. Da mesma forma, a aplicação destas técnicas na EAC, BE e linhas de células do esôfago imortalizados delineou conclusões críticas sobre BE à progressão EAC ^8-10. Encontramos se a análise de células ser tratados com terapias direcionadas tem valor, permitindo a caracterização de mudanças na estrutura celular e localização de proteínas. Aqui, apresentamos os nossos métodos para IF de ser células imortalizadas para characterize tratamento medicamentoso.

Protocolo

1. Linha celular Manutenção

1. Humana imortalizada BE displásicas de alto grau (CP-B, CP-C, CP-D) e metaplásico (CP-A) de linhas celulares por transfecção estável da telomerase humana transcriptase (TERT) de proteína ¹¹ reversa.
2. Manter BE linhas de células de queratinócitos em meio suplementado com extracto de pituitária de bovino (BPE), factor de crescimento epidérmico (EGF), 5% de soro fetal bovino (FBS), aminoácidos não essenciais (NEAA), penicilina-estreptomicina-neomicina (PSN), e padrão condições de cultura de tecidos (37 ° C, 5% de CO _2, 98% de humidade).

2. BE celular chapeamento

1. Preparação de 12 poços de placas / lamelas. Coloque 18 milímetros lamínulas em uma placa de Petri e autoclave de vidro. Transferência autoclavada 18 milímetros lamelas de vidro em um prato de 12 poços de cultura de tecido utilizando uma pipeta de vidro estéril ligada a um tubo de vácuo. Lave as lamelas com PBS estéril e mídia.
2. Trypsinize e contagem de células ser imortalizado. Contar células using contador de células automatizado ou um hemocitômetro. Diluir as células em meio de cultura a uma concentração de 20.000-40.000 células / ml.
3. Colocar 1 ml de células em cada cavidade contendo uma lamela para uma contagem de células totais de 20.000-40.000 células / poço.
4. Utilizar uma ponta de pipeta estéril de empurrar suavemente a lamela para o fundo do poço, para assegurar que as células fixar a lamela.

3. Tratamento de Drogas de Células BE

1. Diluir fármaco seleccionado em meio morno (37 ° C) até à concentração desejada e misturar bem, invertendo o tubo várias vezes ou usando um misturador de vórtice. As concentrações de medicamento determinado empiricamente. Comece o tratamento 24 horas após a semeadura inicial das células ser o de permitir que as células de fixação para a lamela
2. Para efeito de comparação e controle, o tratamento de uma lamela adicional de células BE com 0,1% de veículo (dimetilsulfóxido [DMSO] ou agente usado para solubilizar composto) diluído em meios de cultura. Placa de etiqueta com uma caneta de laboratório para identificar a droga e veculo amostras tratadas. Colocar as células em uma incubadora de cultura de células definido como 37 ° C, 5% de CO _2, 98% de humidade e incubar durante pontos de tempo desejados.

4. Immunofluorescent Coloração

1. Fixação
   1. Seguindo o tempo de incubação desejado do tratamento com droga, os meios de aspiração e lava-se rapidamente as lamelas com tampão fosfato salino 1x (PBS) à temperatura ambiente (TA, 25 ° C).
   2. Aspirar o PBS e adicionar 1 mL de PBS contendo 4% de PFA [4% PFA / PBS] a cada poço e incube à temperatura ambiente durante 30 min.
   3. Aspirar a 4% PFA / PBS e lavar o lamelas 3x, 5 min cada com PBS à temperatura ambiente. Armazene lamelas para uma semana em PBS/0.1% PFA a 4 ° C, se desejar.
2. Permeabilização / Bloqueio
   Permeabilizar células PFA fixas para permitir que o anticorpo para aceder aos alvos intracelulares. Para extracelular surgiu proteínas, executar todos os passos subsequentes sem saponina adicionado à solução de BSA 1x PBS/0.5%.
   1. Reduzir o fundo por incubação com 50 mM de NH ₄ Cl diluído em PBS durante 10 min à temperatura ambiente e lava-se com PBS, uma vez RT durante 5 min.
   2. Incubar ser células durante 30 minutos em 100-300 ul de PBS contendo 0,1% de saponina e 0,5% de albumina de soro bovino (BSA). Dilui-se a partir de 10% de saponina estoque, esterilizada por filtração, preparada em água e armazenado a 4 ° C.
   Nota: Isto impede a ligação não específica de anticorpos contra proteínas celulares, bloqueando lamelas, devido à adição de 0,5% de BSA. Alternativamente, substituem BSA com soro de cabra diluído a 5% para ajudar a reduzir a ligação não específica de anticorpos.
3. Preparação de secção Humano
   1. Prepare um prato quadrado bioensaio por camadas na parte inferior da câmara com papel-toalha molhada e coloque uma camada de Parafilm no topo.
   2. Gentilmente transferir as lamelas, células voltadas para cima, para o Parafilm usando uma pinça e uma agulha de seringa.
   3. Marque o Parafilm com uma caneta de laboratório para identificar lamelas.
4. Primário Incubação de anticorpos
   1. Dilui-se o anticorpo primário em PBS contendo BSA a 0,5% tanto e 0,1% de saponina.
   2. Seque levemente para fora da solução de bloqueio utilizando um tecido de laboratório e adicionar 100 ul de solução de anticorpo primário. Incubar o anticorpo primário às células BE durante a noite a 4 ° C.
5. A incubação do anticorpo secundário
   1. Lavar as lâminas 3x com PBS/0.5% BSA/0.1% de saponina por 5 min cada em temperatura ambiente.
   2. Dilui-se o anticorpo secundário conjugado com um marcador fluorescente em PBS/0.5% BSA/0.1% de saponina que o anticorpo secundário reconhece as espécies em que o anticorpo primário foi levantadas.
   3. Adicionar 100 ul de anticorpo diluído em cada lamela. Incubar o anticorpo secundário durante 2 horas à temperatura ambiente.
6. Lavagem e montagem de Lamelas
   1. Lave as lamelas de 3x, 5 min cada em PBS/0.5% BSA/0.1% de saponina. Remover o tampão de lavagem e adicionar 100-300 ul de PBS para as lamelas.
      NOTA: Para a dupla anticoloração do corpo, repita os passos de 4,4-4,5 com o anticorpo primário e secundário adicional desejado de acordo com informações descritas na discussão.
   2. Utilizando uma pinça, retire cuidadosamente a lamela e secar fora da PBS usando um tecido de laboratório ou toalha de papel.
   3. Adicionar 15 mL de um meio de montagem anti-fade apropriado contendo 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para a lamela e inverter a lamela, células para baixo, sobre uma lâmina de vidro.
   4. Colocar as lâminas em uma pasta de slides e incubar longe da luz direta durante a noite à temperatura ambiente para permitir que o meio anti-fade definir difícil de curar, de acordo com as instruções do fabricante. Uma vez que o meio anti-desbotamento definiu, as lâminas podem ser armazenadas a 4 ° C ou -20 ° C até a visualização microscópica.

5. Visualização microscópica de Lamelas

Células coradas podem ser visualizados através de qualquer microscopia confocal ou um IF microscop vertical capaze. Apesar de microscopia confocal fornece imagens de alta resolução em profundidades discretas, uma microscópica vertical é capaz de produzir imagens úteis mais rápido. Para resumir, um método de imagem manchado BE células usando microscopia padrão é apresentado. Em geral, a imagem de isotiocianato de fluoresceína (ITCF) ou fluoróforos semelhantes (isto é, proteína fluorescente verde), Texas Red e DAPI, requer um microscópio com filtros capazes de discriminar estes fluoróforos. Confira o microscópio antes de iniciar o protocolo para determinar fluoróforos compatíveis.

1. Imagem em um IF Microscópio Padrão
   1. Retirar armazenados slides / lamelas de -20 ° C ou 4 ° C e permitem-lhes a aquecer até à temperatura ambiente. Ligue microscópio e lâmpada de arco de mercúrio.
   2. Coloque lâmina de microscópio com lamela voltada para objetivo para o palco microscópio. Para o uso de um objetivo de imersão em óleo, adicione uma gota de óleo de imersão sobre lamela.
   3. Selecione o filtro DAPI e abrir o obturador.
   4. Concentre-se o objetivo ao olhar pelas oculares até que a imagem apareça. Uma vez que todas as células que coram com DAPI, os núcleos devem ser facilmente observável.
   5. Coletar imagens usando o respectivo software de processamento de imagem.

Resultados

Um exemplo dos resultados obtidos com a aplicação dos procedimentos descritos está ilustrada nas Figuras 1A-D. Lamelas com PC-D e FP-C BE células foram tratadas durante 24 horas com 1 uM do inibidor de Src família, SKI-606, ou veículo (DMSO) e coradas utilizando os procedimentos descritos acima para o Adherens junção de sinalização Wnt e proteína, β -catenina. Visualização de β-catenina foi conseguida por marcação com uma IgG anti-coelho acoplado a um fluoróforo verde, enquanto que a r...

Discussão

Temos delineado um método para aplicação de IF de células ser no sentido de elucidar os efeitos fisiológicos de terapias específicas sobre estas células. Embora se tenha descrito o uso desses procedimentos contra células BE, verificou-se que estes métodos também são aplicáveis ​​a uma variedade de diferentes tipos de células ^13,17,18. Além disso, esses procedimentos podem ser modificados de várias formas para optimizar a coloração para alvos específicos.

Nós...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CP-A (Metaplastic Cell Line)	ATCC	CRL-4027
CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line)	ATCC	CRL-4028
CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line)	ATCC	CRL-4029
CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line)	ATCC	CRL-4030
Keratinocyte-SFM (1x), Liquid	Life Technologies	17005-042
0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red	Life Technologies	25200056
Fetal Bovine Serum, Qualified, HI	Life Technologies	10438026
PSN antibiotic mixture	Life Technologies	15640
PBS - Phosphate-Buffered Saline	Life Technologies	10010049
Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P36931
Circular Glass Coverslip 18 mm	Fisher Scientific	15-183-86
β-catenin Primary Antibody (Rabbit)	Cell Signaling	9562S
Alexa Fluor 488 (Goat Anti-Rabbit)	Life Technologies	A11008
10 cm TC treated PS dish, sterile	USA Scientific	CC7682-3394
12-well TC treated PS plate, sterile	USA Scientific	5666-5180
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Bovine Serum Albumin - Fraction V	Sigma-Aldrich	85040C
SKI-606 (Bosutinib)	Selleck Chemicals	S1014
Square Bioassay Dish	Thermo Scientific	240835
Parafilm	VWR	82024-546
Disposable Pasteur Pipettes, Flint Glass	VWR	14672-380
Nexcelom Mini Cell Counter	Nexcelom
Cellometer Counting Chambers	Nexcelom	CHT4-SD100-014
Zeiss Apotome microscope	Zeiss