שיטת Immunofluorescent לאפיון של תאי הוושט של בארט

Summary

יש צורך ניכר למידע משופר על נהגים מולקולריים של ושט בארט. מכתים Immunofluorescent הוא טכניקה שימושית להבנת ההשפעות של תא איתות במורפולוגיה של תאים. אנו מציגים פרוטוקול פשוט, יעיל לשימוש בצביעת immunofluorescent להעריך טיפול רפואי בתאי הוושט של בארט.

Abstract

אדנוקרצינומה של הוושט (EAC) יש שיעור כולל הישרדות של פחות מ 17% ושכיחות של EAC עלתה באופן דרמטי בשני העשורים האחרונים. אחד מגורמי הסיכון העיקריים של EAC הוא שט בארט (BE), שינוי metaplastic של הוושט הקשקש הנורמלי בתגובה לצרבת כרונית. למרות הקשר המבוסס היטב בין EAC ולהיות, חקירה של האירועים המולקולריים, במיוחד מסלולי איתות שינו מעורבים התקדמות של להיות EAC, הם הבינו היטב. חלק גדול מזה נובע חוסר המתאים במודלים חוץ גופית זמינים ללמוד מחלות אלה. לאחרונה, קווי BE תא הונצחו הפכו זמינים באופן מסחרי המאפשרים לבדיקות במבחנה של BE. כאן, אנו מציגים שיטה לצביעת immunofluorescent של קווי BE תא הונצחו, ומאפשרים באפיון מבחנה של תא איתות ומבנה לאחר חשיפה לתרכובות טיפוליות. יישום של טכניקות אלה הלp לפתח תובנה המנגנונים המעורבים בתהיה התקדמות EAC ולספק אפיקי פוטנציאל לטיפול ומניעה של EAC.

Introduction

ושט בארט (BE) הוא שינוי metaplastic באפיתל הנורמלי הקשקש של הוושט ותוצאה של חשיפה כרונית לתוכן הקיבה הנובע ממחלת החזר הוושטי (GERD) ^1. הוא חשב להיות להיות מנגנון הגנה בתגובה לGERD, עם זאת הנוכחות של BE מקנה סיכון מוגבר של אדנוקרצינומה של הוושט (EAC), מחלה אשר נושאת הישרדות נמוכה באופן משמעותי ^1. הערכות הנוכחיות מצביעות על כך שעד 5.6% מכלל האוכלוסייה האמריקנית צריכים להיות, כמו להיות לעתים קרובות תסמינים, הוא חשב, עם זאת, הרוב המכריע של BE נשאר לא מאובחן ^2. כשיעורי ההיארעות של שני GERD וEAC ראו צמיחה נמשכת ^3, זה הפך להיות חשוב כדי להבין את המנגנונים המולקולריים מעורבים בהתקדמות של להיות EAC, במיוחד כאשר מידע זה עלול לספק גישות טיפוליות למניעת התקדמות של להיות EAC.

מחקרים> חולה מופנים הביאו לפרדיגמה הנוכחית של הפתוגנזה BE-EAC ^1. דלקת כרונית, פציעה, ונזק genotoxic כתוצאה מחשיפה ממושכת לתוכן קיבה להפעיל לחץ סלקטיבי על הנגע לקדם התקדמות neoplastic לEAC. מספר השינויים הגנטיים שזוהו במהלך להיות התקדמות EAC. אולם, למרות זאת קיים מחסור מובהק של הבנה לגבי השינויים המדויקים בתא איתות והשפעות שלאחר מכן על מבנה תא ותפקודו.

הונצחו בשורות תאים במבחנה הם כלים שימושיים לחקר ההשפעות של תא איתות, בעיקר בחוקר את ההשפעות של תרכובות טיפוליות ממוקדות. הזמינות המסחרית האחרונה של שורות תאים להיות מונצחות מאפשרת ללימודים כאלה. למרות מבחני תפוקה גבוהה, כגון מבחני כדאיות בשימוש נרחב, יכולים להיות בעל ערך בהערכת ההשפעות של טיפולים ממוקדים על התפשטות תאים וsurvival ^4-6, מבחני אלה אינם שימושיים לחקירת ההשפעות של תא איתות על מורפולוגיה של תאים. מכתים Immunofluorescent (IF) הוא טכניקה שימושית חוקר את ההשפעות של טיפולים ממוקדים על המאפיינים מורפולוגיים, צמיחה וההישרדות של תאים והחלבונים שהם מעורבים. המעבדה שלנו יש להתאים שיטות אלה לכיוון קווי BE תא הנציחו, באמצעות IF כדי להעריך את ההשפעות של תרופה זמינה מבחינה קלינית על שורות תאים להיות בתקוות של התוויית טיפול אפשרי chemopreventative וסמנים ביולוגיים לטיפול תרופתי ^7. כמו כן, יישום של טכניקות אלה בEAC, BE ושורות תאי הוושט הונצחו יש מתווית ממצאים קריטיים לגבי להיות התקדמות EAC ^8-10. אנו מוצאים אם ניתוח של תאים להיות מטופלים עם טיפולים ממוקדים יש ערך, המאפשר אפיון של שינויים במבנה תא ולוקליזציה חלבון. כאן, אנו מציגים את השיטות שלנו כי אם של תאים להיות מונצחים לגharacterize טיפול תרופתי.

Protocol

1. תחזוקת קו סלולרי

1. אדם הנציח BE שומות בדרגה גבוהה (CP-B, CP-C, CP-D) וmetaplastic (CP-) שורות תאים על ידי transfection היציב של טלומראז האנושי להפוך חלבון טרנסקריפטאז (טרט) ^11.
2. לשמור BE שורות תאים בתקשורת keratinocyte בתוספת תמצית שור יותרת המוח (BPE), גורם אפידרמיס צמיחה (EGF), 5% בסרום שור העובר (FBS), חומצות אמינו חיוניות (NEAA), פניצילין, סטרפטומיצין, ניאומיצין (PSN), וסטנדרטי תנאי תרבית רקמה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, לחות 98%).

2. להיות נייד ציפוי

1. הכנת הצלחת / coverslips 12 היטב. הנח 18 coverslips מ"מ לתוך צלחת פטרי זכוכית וחיטוי. העברת autoclaved 18 coverslips זכוכית מ"מ לתוך צלחת תרבית רקמת 12 גם באמצעות פיפטה זכוכית סטרילית מחוברת לצינור ואקום. שטוף את coverslip עם PBS ותקשורת סטרילית.
2. Trypsinize ולספור תאים להיות מונצחים. ספירת תאי USIng דלפק תא אוטומטי או hemocytometer. לדלל תאים בתקשורת והתרבות לריכוז של 20,000-40,000 תאים / מיליליטר.
3. מקום 1 מיליליטר של תאים לתוך כל המכיל coverslip לספירת תאים כולל של 20,000-40,000 תאים / היטב היטב.
4. השתמש בקצה פיפטה סטרילית לדחוף בעדינות את coverslip לתחתית הבאר, כדי להבטיח שתאים לצרף coverslip.

3. הטיפול התרופתי של תאים להיות

1. לדלל תרופה שנבחרה בתקשורת חמה (37 מעלות צלזיוס) לריכוז רצוי ומערבבים היטב על ידי צינור היפוך שוב ושוב או בעזרת מערבל מערבולת. ריכוזי תרופה נקבעו באופן אמפירי. להתחיל טיפול 24 שעות הבאות הזריעה הראשונית של התאים יהיה לאפשר התקשרות תאים לcoverslip
2. לשם השוואה ובקרה, טיפול בcoverslip נוסף של תאים להיות עם רכב 0.1% (sulfoxide דימתיל [DMSO] או סוכן המשמש לsolubilize מתחם) בדילול מלא בתקשורת והתרבות. צלחת תווית עם עט מעבדה לזיהוי סמים וvehicle טופל דגימות. מקום תאים לתרבית תאי חממה מוגדרת 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, לחות 98% ודגירה של נקודות זמן רצויים.

4. Immunofluorescent מכתים

1. קבעון
   1. בעקבות זמן דגירה רצויה של טיפול תרופתי, לשאוב התקשורת לשטוף coverslips במהירות עם פוספט שנאגרו מלוח 1x (PBS) בטמפרטורת חדר (RT, 25 מעלות צלזיוס).
   2. לשאוב PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של PBS המכיל 4% PFA [4% PFA / PBS] היטב כל אחד ולדגור על RT במשך 30 דקות.
   3. לשאוב PFA 4% / PBS ולשטוף 3x coverslips, 5 דקות כל אחד עם PBS ב RT. coverslips חנות במשך שבוע אחד ב% PBS/0.1 PFA על 4 מעלות צלזיוס אם תרצה בכך.
2. Permeabilization / חסימה
   Permeabilize תאי PFA קבוע כדי לאפשר את הנוגדן כדי לגשת למטרות תאיים. לתאי ועלו חלבונים, לבצע את כל השלבים שלאחר מכן ללא saponin מתווסף פתרון BSA% PBS/0.5 1x.
   1. להפחית את הרקע על ידי דוגרים עם 50 Cl NH ₄ מ"מ מדולל PBS 10 דקות ב RT ולשטוף עם RT-PBS פעם אחת במשך 5 דקות.
   2. דגירה תאים להיות עבור 30 דקות ב100-300 μl של PBS המכיל saponin 0.1% ו0.5% אלבומין בסרום שור (BSA). לדלל saponin ממניות 10% פילטר מעוקר, שהוכן במים ומאוחסנים ב 4 ° C.
   הערה: זה מונע ספציפי מחייב של נוגדנים לחלבונים תאיים על ידי חסימת coverslips בשל התוספת של BSA 0.5%. לחלופין, להחליף BSA עם הסרום עז המדולל ל -5% כדי לסייע להפחית ספציפי מחייב של נוגדנים.
3. הכנה של לשכת האנוש
   1. הכן צלחת מבדק כיכר על ידי שכבות התחתונה של החדר עם מגבות נייר רטובות ומניח שכבה של Parafilm על העליונה.
   2. בעדינות להעביר את coverslips, התאים פונים כלפי מעלה, על Parafilm באמצעות מלקחיים ומחט מזרק.
   3. סמן את Parafilm עם עט מעבדה כדי לזהות coverslips.
4. ראשי נוגדן דגירה
   1. לדלל את הנוגדן העיקרי PBS המכיל שני BSA 0.5% וsaponin .0.1%.
   2. בעדינות למחוק את פתרון החסימה באמצעות רקמות במעבדה ומוסיף של פתרון הנוגדן הראשוני 100 μl. דגירה הנוגדן הראשוני בתאי BE לילה בשעה 4 ° C.
5. דגירה נוגדנים משני
   1. שטפו את השקופיות 3x עם% PBS/0.5 saponin% BSA/0.1 במשך 5 דקות כל אחד ב RT.
   2. מדולל משני נוגדנים מצומדות עם תג ניאון ב% PBS/0.5 saponin% BSA/0.1 ששני הנוגדנים מזהה מינים שבו הנוגדן הראשוני הועלה.
   3. הוספה של נוגדן בדילול 100 μl לכל coverslip. דגירה הנוגדנים משני עבור שעה 2 ב RT.
6. כביסה והרכבה של Coverslips
   1. שטוף את coverslips 3x, 5 דקות כל אחד ב% PBS/0.5 saponin% BSA/0.1. הסר את החיץ לשטוף ולהוסיף 100-300 μl של PBS על coverslips.
      הערה: לקבלת אנטי כפוליםצביעת גוף, חזור על שלבים 4.4-4.5 עם הנוגדן ראשוני ומשניים נוסף הרצוי על פי מידע שהותווה בדיון.
   2. בעזרת מלקחיים, בעדינות להרים את coverslip ולמחוק את PBS באמצעות רקמות במעבדה או מגבת נייר.
   3. הוסף 15 μl של תקשורת מתאימה אנטי לדעוך הרכבה המכילה 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לcoverslip ולהפוך את coverslip, תאים למטה, לשקופית מיקרוסקופ זכוכית.
   4. מניחים את השקופיות לתוך תיקיית שקופיות ודגירה הרחק מאור ישיר הלילה ב RT כדי לאפשר את המדיום אנטי לדעוך קשה להגדיר כדי לרפא, על פי הוראות יצרן. ברגע שהמדיום אנטי לדעוך קבע, יכולה להיות מאוחסנות בשקופיות או 4 ° C או -20 ° C עד להדמיה מיקרוסקופית.

5. להדמיה מיקרוסקופית של Coverslips

ניתן הדמיה תאים מוכתמים באמצעות מיקרוסקופ או או confocal אם microscop הזקוף מסוגלדואר. למרות מיקרוסקופיה confocal מספקת תמונות ברזולוציה גבוהה בעומקים בדידים, מיקרוסקופי זקוף הוא מסוגל לייצר תמונות שימושיות יותר מהר. למען קיצור, שיטה של ​​הדמיה מוכתמת להיות תאים באמצעות מיקרוסקופיה סטנדרטית הוא מוצגת. באופן כללי, לisothiocyanate תמונה והעמסת (FITC) או fluorophores הדומה (כלומר חלבון פלואורסצנטי ירוק), טקסס האדומה וDAPI, דורש מיקרוסקופ עם מסננים מסוגלים להפלות fluorophores אלה. בדוק את המיקרוסקופ לפני תחילת פרוטוקול כדי לקבוע fluorophores התואם.

1. הדמיה על תקן אם מיקרוסקופ
   1. הסר שקופיות / coverslips מאוחסן מ-20 מעלות צלזיוס או 4 ° C ולאפשר להם לחמם לטמפרטורת חדר. כוח במיקרוסקופ ומנורת קשת כספית.
   2. הנח שקופיות מיקרוסקופ עם coverslip פונה כלפי אובייקטיבי על הבמה מיקרוסקופ. לשימוש במטרת טבילת שמן, להוסיף טיפה של שמן טבילה על coverslip.
   3. בחר את מסנן DAPI ולפתוח את התריס.
   4. להתמקד במטרה תוך מבט דרך העיני עד שהתמונה מופיעה. מכיוון שכל התאים יהיו כתם עם DAPI, הגרעינים צריכים להיות נצפים בקלות.
   5. לאסוף תמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה בהתאמה.

תוצאות

דוגמא לתוצאות המתקבלות מיישום של הנהלים שתוארו באה לידי ביטוי בדמויות 1A-D. Coverslips עם CP-D ותאי BE CP-C טופלו ל24 שעות עם 1 מיקרומטר של מעכב Src המשפחה, SKI-606, או רכב (DMSO) ומוכתם באמצעות הנהלים מעל לצומת Adherens וWnt איתות חלבון, β -Catenin. ויזואליזציה של β-catenin הושגה על ידי תיוג עם ...

Discussion

יש לנו התוויתי שיטה ליישום של IF של תאים להיות כלפי הבהרת ההשפעות הפיזיולוגיות של טיפולים ממוקדים על תאים אלה. אמנם יש לנו תיארתי את השימוש בנהלים אלה לתאים להיות, שמצאנו כי שיטות אלה תקפים גם למגוון רחב של סוגי תאים שונים ^13,17,18 של. יתר על כן, ניתן לשנות נהלים אלה ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CP-A (Metaplastic Cell Line)	ATCC	CRL-4027
CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line)	ATCC	CRL-4028
CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line)	ATCC	CRL-4029
CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line)	ATCC	CRL-4030
Keratinocyte-SFM (1x), Liquid	Life Technologies	17005-042
0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red	Life Technologies	25200056
Fetal Bovine Serum, Qualified, HI	Life Technologies	10438026
PSN antibiotic mixture	Life Technologies	15640
PBS - Phosphate-Buffered Saline	Life Technologies	10010049
Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P36931
Circular Glass Coverslip 18 mm	Fisher Scientific	15-183-86
β-catenin Primary Antibody (Rabbit)	Cell Signaling	9562S
Alexa Fluor 488 (Goat Anti-Rabbit)	Life Technologies	A11008
10 cm TC treated PS dish, sterile	USA Scientific	CC7682-3394
12-well TC treated PS plate, sterile	USA Scientific	5666-5180
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Bovine Serum Albumin - Fraction V	Sigma-Aldrich	85040C
SKI-606 (Bosutinib)	Selleck Chemicals	S1014
Square Bioassay Dish	Thermo Scientific	240835
Parafilm	VWR	82024-546
Disposable Pasteur Pipettes, Flint Glass	VWR	14672-380
Nexcelom Mini Cell Counter	Nexcelom
Cellometer Counting Chambers	Nexcelom	CHT4-SD100-014
Zeiss Apotome microscope	Zeiss