바렛 식도 세포의 특성에 대한 면역 방법

요약

바렛 식도의 분자 드라이버에 대한 개선 된 정보를 식별 할 필요가있다. 면역 형광 염색은 세포 형태에 세포 신호 전달의 효과를 이해하기위한 유용한 기술이다. 우리는 바렛 식도 세포의 치료 적 처치를 평가하기 위하여 면역 형광 염색법을 사용하기위한 간단한 효과적인 프로토콜을 제시한다.

초록

식도 선암 (EAC)는 전체 생존보다 17 %의 속도와 EAC의 발병률은 지난 20 년 동안 극적으로 증가했다가 있습니다. EAC의 주요 위험 요인 중 하나는 바렛 식도 (BE), 만성 가슴 앓이에 대한 응답으로 정상 편평 식도의 화생이 있으면서 변화입니다. EAC 사이의 잘 설정된 연결에도 불구하고, 분자 이벤트의 진행을 포함 특히 변경된 신호 전달 경로의 심문은 EAC에, 제대로 이해 못할 것이다. 이 중 대부분은 이러한 질병을 연구하는 데 사용할 수 체외 모델에 적합한의 부족 때문이다. 최근 불후의 BE 세포주 BE의 생체 연구를 허용 시판되고있다. 여기서, 우리는 치료 화합물에 노출 된 후 세포 신호 및 구조의 시험 관내 특성화 있도록 BE 불멸화 세포주의 면역 염색을위한 방법을 제시한다. 이러한 기술의 적용은 그러는 것p는 EAC 진행하는에 관련된 메커니즘에 대한 통찰력을 개발하고 치료 및 EAC의 예방을위한 잠재적 인 수단을 제공합니다.

서문

바렛 식도 (BE)은 식도의 편평 상피 세포 및 정상적인 위 식도 역류 질환 (GERD) ^(1)로부터 얻어진 위 내용물에 대한 만성 노출의 결과에 화생이 있으면서 변화이다. BE는 GERD에 대한 응답으로 보호 메커니즘 것으로 생각됩니다, 그러나 BE의 존재는 식도 선암 (EAC), 현저하게 생존율 ^1을 전달하는 질병의 증가 위험을 부여. 현재 견적은 미국 인구의 최대 5.6 %가달라고하는 것이 좋습니다 BE는 종종 무증상으로, 그러나, BE의 ^{대부분이이} 진단되지 않은 남아 있다고 생각합니다. GERD와 EAC 모두의 발생률이 계속 성장 ³ 본 바와 같이,이 정보는 잠재적으로 EAC하는의 진행을 방지하는 방향으로 치료 방법을 제공 할 수있다, 특히로, EAC하는의 진행에 관여하는 분자 메커니즘을 이해하는 것이 중요 해지고있다.

환자 관한 연구는 BE-EAC 병인 ^1의 현재 패러다임에 성공. 만성 염증, 상처, 그리고 위의 내용에 장기간 노출로 인한 유전 독성 피해는 EAC에 종양의 진행을 촉진 BE 병변에 선택적 압력을 발휘. 유전 변경의 숫자는 동안 EAC 진행하는 확인되었습니다. 그러나 이것에도 불구하고 세포 신호의 정확한 변화와 세포의 구조와 기능에 따라 이후의 영향에 대한 이해의 명백한 부족하다.

특히 표적 치료 화합물의 효과를 조사에서, 세포 신호 전달의 효과를 연구하기위한 유용한 도구가 시험 관내 세포 라인에 불멸화. 불후의 BE 세포주의 최근 상용화는 연구 할 수 있습니다. 이러한 널리 사용 생존력 분석 높은 처리량 분석법은 세포 증식 및 스와시 타겟 요법의 효과를 평가하는데 유용 할 수 있지만rvival ^4-6, 이러한 분석은 세포 형태에 따라 세포 신호 전달의 효과를 심문하는 데 유용하지 않습니다. 면역 형광 염색 (IF)는 세포의 형태학, 성장 및 생존 성과 관련된 단백질시 타겟 요법의 효과를 조사하기위한 유용한 기술이다. 우리 연구소는 약물 치료 ⁷ 가능한 화학적 예방법 처리 및 바이오 마커를 서술의 희망 BE 세포 라인에 따라 임상 적으로 사용 가능한 약물의 효과를 평가하는 경우에 사용하는, 불후의 BE 세포 라인으로 이러한 방법을 적용하고있다. 마찬가지로, EAC에서 이러한 기술의 응용 프로그램이 있고 그리고 불후의 식도 세포 라인은 EAC 진행 ^8-10 일 수에 관한 중요한 연구 결과를 서술하고있다. 표적으로 한 치료로 치료 세포의 분석은 세포 구조와 단백질 지방화의 변화 특성을 허용, 가치가 있다면, 우리는 찾을 수 있습니다. 여기, 우리는 우리의 방법을 제시 IF C로되어 영원 세포의약물 치료를 haracterize.

프로토콜

1. 셀 라인의 유지 보수

1. 불후의 성격 효소 (TERT) 단백질 ¹¹ 반대로 인간 텔로 머라 아제의 안정적인 형질 전환에 의해 고급 이형성 (CP-B, CP-C, CP-D) 및 화생이 있으면서 (CP-A) 세포주합니다.
2. 유지 세포 소 뇌하수체 추출물 (BPE), 표피 성장 인자 (EGF), 5 % 태아 소 혈청 (FBS), 비 필수 아미노산 (NEAA), 페니실린 - 스트렙토 마이신-네오 마이신 (PSN)로 보충 각질 미디어 라인 및 표준 BE 조직 배양 조건 (37 ° C에서 5 % CO _2, 98 % 습도).

2. 셀 도금하고있다

1. 12 - 웰 플레이트 / 커버 슬립의 제조. 유리 페트리 접시와 오토 클레이브에 18mm 커버 슬립을 놓습니다. 전송 진공관에 부착 멸균 유리 피펫을 사용하여 12 - 웰 조직 배양 접시에 18mm 유리 커버 슬립을 멸균. 멸균 PBS 및 미디어 커버 슬립을 씻으십시오.
2. 를 Trypsinize 및 불후의 BE 세포를 계산합니다. 세포 USI를 계산자동 셀 카운터 또는 혈구를 겨. 20,000-40,000 세포 / ml의 농도로 배양 배지에서 세포를 희석.
3. 각이 잘 20,000-40,000 세포 / 웰의 총 세포 수에 대한 커버 슬립을 포함에 세포를 1 ㎖를 놓습니다.
4. 부드럽게 세포가 커버 슬립에 부착하도록 우물의 바닥에 커버 슬립을 밀어 멸균 피펫 팁을 사용합니다.

BE 세포의 3. 약물 치료

1. 원하는 농도로 따뜻한 (37 ℃) 매체 선택 약을 희석 반복 튜브를 반전 또는 와류 믹서를 사용하여 잘 섞는다. 경험적으로 결정 약물 농도. 커버 슬립에 대한 세포의 부착을 허용하는 BE 세포의 초기 시딩 다음 치료 24 시간을 시작합니다
2. 비교 및 제어를 위해, 배양 배지에 희석 0.1 % 차량 (디메틸 설폭 사이드 [DMSO] 또는 대리인이 화합물을 용해하는 데 사용)과 함께 세포의 추가 커버 슬립을 취급합니다. 약을 확인하고 Ve에 대한 실험실 펜 라벨 판차 량은 샘플을 처리. 37 ° C, 5 % CO _2, 98 %의 습도로 설정 세포 배양 인큐베이터에 세포를 넣고 원하는 시점에 품어.

4. 면역 형광 염색법

1. 정착
   1. 약물 치료의 원하는 배양 시간에 따라, 미디어를 대기음 실온 (RT, 25 ° C)에서 1X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)으로 신속하게 커버 슬립을 씻는다.
   2. PBS를 대기음도 각각 4 % PFA [4 % PFA / PBS를 함유하는 PBS 1 ㎖를 추가하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
   3. 4 % PFA / PBS를 대기음 RT에서 PBS와 coverslips는 3 배, 5 분마다 씻어. 원하는 경우 4 ° C에서 PBS/0.1의 % PFA에 일 주일간 매장의 coverslips.
2. Permeabilization / 차단
   항체가 세포 내 표적 액세스 할 수 있도록 고정 PFA 세포를 투과. 세포는 단백질 표면의 경우, 1X의 PBS/0.5의 %의 BSA 용액에 첨가 사포닌하지 않고 이후의 모든 단계를 수행합니다.
   1. 실온에서 10 분 동안 PBS에 희석하는 50 mM NH ₄ 망할 CIA와 함께 배양하여 배경을 줄이고 5 분 동안 한 번 RT PBS로 세척.
   2. 0.1 % 사포닌 및 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 PBS의 100-300 μL에 30 분 동안 BE 세포를 배양한다. , 필터 살균 10 %의 주식에서 사포닌을 희석 물을 준비하고 4 ℃에서 저장
   참고 :이 0.5 % BSA의 첨가에 의한 커버 슬립을 차단하여 세포 단백질에 대한 항체의 비특이적 결합 방지 할 수 있습니다. 또한, 항체의 비특이적 결합을 줄이기 위해 5 %로 희석 염소 혈청과 BSA를 대체합니다.
3. 인간의 상공 회의소의 준비
   1. 젖은 종이 타월 챔버의 바닥을 적층하여 사각형 생물 검정 접시를 준비하고 위에 파라 필름의 층을 배치합니다.
   2. 부드럽게 겸자 및 주사기 바늘을 이용하여 파라 필름 상으로 향하도록 커버 슬립, 세포를 옮긴다.
   3. 커버 슬립을 식별 할 수있는 실험실 펜으로 파라 필름을 표시합니다.
4. 일차 항체 배양
   1. 0.5 % BSA 및 0.1 % 사포닌을 모두 함유하는 PBS에 일차 항체를 희석.
   2. 부드럽게 실험실 조직을 사용하여 차단 솔루션을 몰아 내고 차 항체 용액 100 μl를 추가합니다. 4 ℃에서 하룻밤 BE 세포의 일차 항체를 품어
5. 차 항체 보육
   1. 슬라이드는 RT에서 5 분마다 PBS/0.5 %의 BSA/0.1 %의 사포닌으로 3 배 씻으십시오.
   2. 차 항체는 일차 항체가 발생되었을 때의 종을 인식 PBS/0.5 %의 BSA/0.1 %의 사포닌에 형광 태그로 복합 이차 항체를 희석.
   3. 각 coverslip에 희석 항체의 100 μl를 추가합니다. 실온에서 2 시간 동안 차 항체를 품어.
6. 세척 및 Coverslips는 실장
   1. PBS/0.5 %의 BSA/0.1 %의 사포닌에 coverslips는 3 배, 5 분마다 씻으십시오. 세척 버퍼를 제거하고 커버 슬립에 PBS의 100 ~ 300 μl를 추가합니다.
      참고 : 더블 안티 들어몸의 얼룩, 반복 토론에 나와있는 정보에 따라 원하는 추가 기본 및 보조 항체 4.4-4.5 단계를 반복합니다.
   2. 집게를 사용하여 부드럽게 커버 슬립을 들어 올려 실험실 조직이나 종이 타월을 사용하여 PBS를 얼룩.
   3. 유리 현미경 슬라이드에 세포 아래로, 커버 슬립에 4를 포함하는 적절한 안티 페이드 설치 미디어 '-1,6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI)의 15 μl를 추가하고, 커버 슬립을 반전.
   4. 슬라이드 폴더에 슬라이드를 삽입하고 하드 설정 반대로 페이드 매체는 치료 할 수 있도록 RT에서 하룻밤 직사 빛에서 배양, 제조 업체의 지침에 따라. 반대로 페이드 매체가 설정되면, 슬라이드는 현미경 가시화 될 때까지 C ° 4 °의 C 또는 -20 하나에 저장할 수 있습니다.

Coverslips는 5. 현미경 시각화

염색 된 세포는 공 초점 현미경 또는 하나를 통해 이미지화 할 수있는 경우 가능한 수직 microscop전자. 공 초점 현미경은 불연속 깊이에 고해상도 이미지를 제공하지만, 직립 현미경 빠르고 유용한 이미지를 생산할 수있다. 간결하게, 영상의 방법은 표준 현미경을 제시하여 셀 BE 스테인드. 일반적으로 이미지 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC) 또는 유사한 형광 물질 (즉, 녹색 형광 단백질)로, 텍사스 레드와 DAPI,이 형광 물질을 구별 할 수있는 필터를 사용하여 현미경이 필요합니다. 호환 형광을 결정하는 프로토콜을 시작하기 전에 현미경을 확인합니다.

1. 표준 IF 현미경 영상
   1. -20 ° C ~ 4 ° C에서 저장 슬라이드 / 커버 슬립을 제거하고 실내 온도를 따뜻하게 할 수 있습니다. 현미경 및 수은 아크 램프의 전원을 켭니다.
   2. 커버 슬립이 현미경 무대에 목표를 향과 현미경 슬라이드를 놓습니다. 오일 침지 목적의 사용을 위해, 커버 슬립 상에 침지 기름 방울을 추가한다.
   3. DAPI 필터를 선택하고 셔터를 엽니 다.
   4. 이미지가 나타날 때까지 접안 렌즈를 통해보고하는 동안 목표를 초점을 맞 춥니 다. 모든 셀 DAPI로 염색되므로, 핵은 쉽게 관찰되어야한다.
   5. 각각의 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 수집한다.

결과

개시된 방법의 애플리케이션으로부터 얻어진 결과의 일례는도 1a-D에 도시되어있다. CP-D와 CP-C BE 세포와 커버 슬립은 Src에 가족 억제제 SKI-606, 또는 차량 (DMSO)의 1 μM로 24 시간 동안 처리하여 단백질, β 신호있는 adherens 접합 Wnt에 대해 위의 절차를 사용하여 염색 - 카테닌. 세포 핵의 라벨이 DAPI (파란색)로 표시하여 수행하는 동안 β-catenin의 시각화는, 녹색 형광체에 결합 된 항 토끼 IgG...

토론

우리는이 세포에 따라 타겟 요법의 생리적 효과를 해명으로 BE 세포의 IF를 적용하는 방법을 설명했다. 우리는 BE 세포 향한 이러한 절차의 사용을 설명하는 동안, 우리는이 방법 또한 다른 세포 유형 ^13,17,18의 다양한 적용 할 수있는 것으로 나타났습니다. 또한, 이러한 절차는 특정 대상에 대한 염색을 최적화하는 여러 가지 방법으로 변경할 수 있습니다.

우리는 적절?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CP-A (Metaplastic Cell Line)	ATCC	CRL-4027
CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line)	ATCC	CRL-4028
CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line)	ATCC	CRL-4029
CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line)	ATCC	CRL-4030
Keratinocyte-SFM (1x), Liquid	Life Technologies	17005-042
0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red	Life Technologies	25200056
Fetal Bovine Serum, Qualified, HI	Life Technologies	10438026
PSN antibiotic mixture	Life Technologies	15640
PBS - Phosphate-Buffered Saline	Life Technologies	10010049
Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P36931
Circular Glass Coverslip 18 mm	Fisher Scientific	15-183-86
β-catenin Primary Antibody (Rabbit)	Cell Signaling	9562S
Alexa Fluor 488 (Goat Anti-Rabbit)	Life Technologies	A11008
10 cm TC treated PS dish, sterile	USA Scientific	CC7682-3394
12-well TC treated PS plate, sterile	USA Scientific	5666-5180
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Bovine Serum Albumin - Fraction V	Sigma-Aldrich	85040C
SKI-606 (Bosutinib)	Selleck Chemicals	S1014
Square Bioassay Dish	Thermo Scientific	240835
Parafilm	VWR	82024-546
Disposable Pasteur Pipettes, Flint Glass	VWR	14672-380
Nexcelom Mini Cell Counter	Nexcelom
Cellometer Counting Chambers	Nexcelom	CHT4-SD100-014
Zeiss Apotome microscope	Zeiss