JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.

Abstract

العديد من الاضطرابات المرتبطة الدماغ لديهم موت الخلايا العصبية المعنية في الفيزيولوجيا المرضية الخاصة بهم. تحسن في نماذج المختبر لدراسة آثار اعصاب أو عصبية المخدرات ومسارات المصب المعنية من شأنه أن يساعد التبصر في الآليات الجزيئية من العصبية / السمية العصبية ويحتمل تسهيل تطوير الأدوية. ومع ذلك، العديد من المقايسات الموجودة في المختبر سمية لها القيود الرئيسية - الأكثر تقييم السمية العصبية والعصبية عند نقطة زمنية واحدة، وعدم السماح لمراقبة بالطبع الوقت وحركية التأثير. وعلاوة على ذلك، فإن الفرصة لجمع المعلومات عن مسارات الإشارات المشاركة في المصب العصبية في الوقت الحقيقي وتكون ذات أهمية كبيرة. في البروتوكول الحالي وصفنا استخدام الوقت الحقيقي القائم على مقاومة الخلايا محلل لتحديد آثار اعصاب السيروتونين 2A (5-HT 2A) منبهات مستقبلات في خط الخلية العصبية تحت خالية من التسمية والوقت الحقيقي كونديتالأيونات باستخدام قياسات مقاومة. وعلاوة على ذلك، علينا أن نبرهن على مثبطات مسارات الرسول الثانية يمكن أن تستخدم لتحديد جزيئات المصب المشاركة في تأثير اعصاب. وصفنا أيضا فائدة هذه التقنية لتحديد ما إذا كان لها تأثير على تكاثر الخلايا يساهم في التأثير الملحوظ اعصاب. النظام يستخدم لوحات الإلكترونيات الدقيقة الخاصة المشار إليها باسم E-التي تحتوي على لوحات بالتناوب صفائف مسرى مكروي الذهب على السطح السفلي من الآبار، بمثابة أجهزة استشعار الخلية. يتم تعديل قراءات مقاومة من قبل عدد من الخلايا الملتصقة، بقاء الخلية، مورفولوجيا، والتصاق. مشتق معلمة أبعاد يسمى مؤشر الخلية من قياسات المعاوقة الكهربائية ويستخدم لتمثيل الوضع الخلية. عموما، في الوقت الحقيقي القائم على مقاومة الخلايا محلل يسمح في الوقت الحقيقي، وتقييم خالية من التسمية من العصبية والعصبية، وتقييم الثاني تورط مسارات رسول، والمساهمة في المزيدتقييم مفصل والإنتاجية العالية من المركبات اعصاب المحتملة في المختبر، لاختيار المرشحين العلاجي.

Introduction

موت الخلايا العصبية يلعب دورا حاسما في الفيزيولوجيا المرضية من العديد من الاضطرابات المرتبطة الدماغ 1. توافر موثوقة وعالية الإنتاجية في فحوصات المختبر سمية أمر بالغ الأهمية للحصول على فهم أفضل للآليات العصبية وللمساعدة في اختيار جزيئات اعصاب كمرشحين العلاجية في تطوير العقاقير 2. ومع ذلك، هناك العديد من القيود على استخدامها على نطاق واسع في المختبر العصبية assays.They تقييم السمية العصبية / العصبية في وقت واحد نقطة عدم السماح للقرار الحركي. غالبا ما تستخدم التسمية أو التحقيق التي يمكن أن تتداخل مع مسارات الإشارات والحد دراسات إضافية في نفس سكان الخلية، وغالبا ما تكون كثيفة العمالة، وفي كثير من الحالات لا توفر البصيرة الميكانيكية. في هذه الدراسة نحن لشرح فائدة في الوقت الحقيقي القائم على مقاومة الخلايا محلل لتحديد السمية العصبية والعصبية في خط الخلية العصبية في الوقت الحقيقي وتحت خالية من التسميةالظروف وتوفير نظرة ثاقبة آليات المصب من خلال تحليل مسارات الرسول الثانية المشاركة في التنفيذ.

وقد أكدت الدراسات السابقة على صحة محلل خلية في الوقت الحقيقي لتحديد السمية الخلوية وكذلك التأثيرات على تكاثر الخلايا في خطوط الخلايا بالمقارنة مع التقنيات القياسية 3،4،5،6. على سبيل المثال، لوحظ وجود علاقة جيدة بين قراءات من معيار بقاء الخلية WST-1 فحص خلية والقيم مؤشر في عدة نقاط الوقت في ظل ظروف انتشار القاعدية وبعد سنتين نماذج مختلفة السامة في خلايا هيلا 3. في A549 وMDA-MB-231 تكاثر الخلايا وسمية الخلايا أثار مع باكليتاكسيل أنيبيب استقرار أظهرت قيم متشابهة جدا عندما تقدره قياسات مؤشر الخليوي وsulforhodamine تستخدم standardly ب (SRB) فحص 4. في خط الخلية العصبية من الخلايا العصبية قرن آمون خلد تم التحقق من صحة القياسات مؤشر HT-22 الخليوي لقدرتها رس كشف تكاثر الخلايا، الغلوتامات وسمية الخلايا cytoprotection ضد تستخدم على نطاق واسع 3- (4،5-dimethylthiazol-2-YL) 2،5-diphenyltetrazolium الميثيل (MTT) فحص 5. في نفس الدراسة ترتبط نتائج فحص MTT وقياسات مؤشر الخلية بشكل جيد أيضا في قياس انتشار الخلايا الاولية العصبية، السمسة بعد الحرمان عوامل النمو والانقاذ من السمية الخلوية من قبل عموم كاسباس المانع QVD 5. أظهرت سمية الخلايا المستحثة في خلايا NIH 3T3 بواسطة Vandetanib (نمو بطانة الأوعية الدموية ومستقبلات عامل نمو البشرة مستقبلات عامل مثبط) نتائج مماثلة قياس مع قيم مؤشر الخلية أو محايدة امتصاص أحمر فحص 6.

وقد استخدمنا في الآونة الأخيرة في الوقت الحقيقي نظام محلل خلية لتقييم آثار اعصاب من 2A السيروتونين (5-HT 2A) مستقبلات ناهض هيدروكلوريد (±) -2،5-dimethoxy-4-iodoamphetamine (دوى) في خط الخلية العصبية ( خلايا SK-N-SH) وفرزهم لمشاركة SECOالثانية مسارات رسول من خلال رصد تأثير تثبيط الكيميائي على العصبية وحظ 7. ومن المثير للاهتمام، و5-HT 2A مستقبلات لديه منبهات كل من الهلوسة وnonhallucinogenic (مثل دوى ويسوريد، على التوالي)، والتي قد بتنشيط كل مشتركة ومتميزة مسارات الرسول الثانية 8.

مزايا هذه التقنية المقدمة هي أنه يتيح لجمع المعلومات في الوقت الحقيقي على بقاء الخلية خلال أيام، لتحديد مسارات ثاني رسول المعنية، لتقييم مساهمة ممكنة من آثار انتشار إلى العصبية، وتحديد الوقت الأمثل لإجراء دراسات إضافية نقطة النهاية على نفس السكان الخلية. ويرد الرسم التخطيطي لسير العمل في البروتوكول الحالي في الشكل 1.

Protocol

1. إعداد

  1. وضع محطة محلل خلية في الوقت الحقيقي في حاضنة زراعة الأنسجة وضعت في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. تنفيذ جميع التعامل زراعة الخلايا والعلاجات الدوائية في نسيج الثقافة هود في ظل ظروف معقمة.
  2. ملاحظة: خطوط الخلايا العصبية التي تتطلب إعدادات درجة حرارة مختلفة مقارنة الظروف القياسية للثقافة، ينبغي تبعا لذلك. للخطوط الخلايا الملتصقة ضعيفة، واستخدام وكلاء طلاء لتسهيل التفاعل مع الخلايا الميكروية الذهب في قاع الآبار لللوحة E 96.
  3. إعداد الحلول 1،000X الأسهم من المركبات الدوائية لعلاج زراعة الخلايا (وكلاء اعصاب الثانية أو مثبطات مسارات الرسول في المذيب المناسب - ديمثيلكبريتيد أو الماء المعقم) وتخزينها في -20 درجة مئوية. استخدام المذيبات والمركبات في العلاجات التالية.
  4. الخلايا العصبية البشرية الثقافة SK-N-SH في DMEM / F12 المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) (انتشار المتوسطة) في قوارير زراعة الخلايا مع 175 سم 2 كثافة السطح لحوالي 75٪. الاحتفاظ برقم مرور خلية ضمن نطاق (حوالي 10 مقاطع) للتأكد من اتساق بين التجارب من حيث معدل تكاثر الخلايا وردا على سمية الخلايا. ويفضل أرقام مرور أقل.
  5. غسل طبقة ملتصقة الخلايا SK-N-SH مع برنامج تلفزيوني، ويعرض للتريبسين مع 0.05٪ محلول التربسين-EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 مئوية. الطرد المركزي الخلايا في 170 × ز لمدة 5 دقائق لإزالة التربسين. resuspend الخلايا في 10 مل انتشار المتوسطة. عد الخلايا مع الصولجان مكافحة الخلية وضبط عدد الخلايا إلى 300،000 خلية / مل عن طريق تمييع الخلايا مع انتشار المتوسطة.

2. طلي وانتشار الخلايا SK-N-SH

  1. إضافة 100 ميكرولتر انتشار المتوسطة إلى كل بئر لللوحة E 96 وتترك لمدة 30 دقيقة في نسيج الثقافة هود في RT لكي تتوازن. إدراج جيش التحرير الشعبى الصينى Eالشركة المصرية للاتصالات 96 في الوقت الحقيقي محطة محلل خلية في حاضنة CO 2 عند 37 درجة مئوية.
  2. بدء تشغيل في الوقت الحقيقي البرمجيات محلل الخلية. على الصفحة تحديد تخطيط الآبار المدرجة في التجربة والدخول في مربعات التحرير المعلومات حول نوع من الخلايا، عدد الخلايا والأسماء وتركيزات المركبات الكيميائية المستخدمة في العلاج بالخلايا.
    ملاحظة: لأغراض هذا البروتوكول ينصح لا يقل عن 4 مكررات لكل معاملة.
  3. على الصفحة تحديد جدول برنامج "خطوات" المدرجة في التجربة، من خلال تحديد عدد من الاحتلالات قياس مؤشر الخليوي والفترة الفاصلة بين الاحتلالات لكل خطوة. منذ الخطوة 1 ومحددة سلفا لقياس الخلفية، حدد "إضافة خطوة" وتعيين الخطوة 2 لقياس مؤشر خلية كل 15 دقيقة لمدة 96 ساعة.
    ملاحظة: للحصول على العلاج، والتي من المتوقع مع تأثيرات حركية سريعة، تعيين الاحتلالات على فترات أقصر.
  4. انقر فوق ابدأ لبدء الخطوة مسبقا تلقائيا 1وقياس مقاومة خلفية وسائل الإعلام. يتم طرح هذه القيمة تلقائيا من قبل البرنامج في كل نقطة البيانات مرة واحدة تضاف الخلايا إلى الآبار.
  5. استخدام معدة مسبقا في الخطوة 1.5) تعليق خلية من 300،000 خلية / مل في انتشار المتوسطة. 30،000 خلية / جيدا لسمية خلية / الدراسات العصبية و 15،000 خلية / جيدا للدراسات تكاثر الخلايا. إخراج E-بلايت وإضافة 100 تعليق خلية ميكرولتر لكل بئر لسمية خلية دراسات / العصبية وإضافة 50 ميكرولتر التعليق الخلية و 50 ميكرولتر انتشار المتوسطة لكل بئر للدراسات تكاثر الخلايا. عدد الخلايا مطلي لكل بئر يحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل خط الخلية تجريبيا.
  6. دوامة بلطف لوحة E-96 لحتى الطلاء من الخلايا. مغادرة-E 96 لوحة لمدة 30 دقيقة في نسيج الثقافة هود في RT السماح الخلايا بالتساوي تستقر في قاع الآبار.
  7. إدراج لوحة E 96 في الوقت الحقيقي محطة محلل الخلية وتبدأ الخطوة 2 على جدول صالعمر. مراقبة القيم مؤشر الخلية في كافة مراحل التجربة عن طريق عرض منحنيات خلية على الصفحة مؤامرة وبيانات مؤشر الخلية الخام على الصفحة مؤشر خلية من البرنامج.

3. مصل الحرمان

  1. 24 ساعة بعد طلاء الخلايا، وقفة التجربة، وإزالة لوحة E-96 من الوقت الحقيقي محطة محلل الخلية. تمييع مثبطات رسول الثانية من المخزونات 1،000X مع DMEM / F12 المصل خالية المتوسطة - إلى 200 × تركيز النهائي. علاج الخلايا مع 1 ميكرولتر مثبطات مسارات الرسول الثانية لفحصها لتورطهم في السمية العصبية / العصبية 30 دقيقة قبل البدء في السمية الخلوية، لمنع مسارات منها. إعادة بليت E 96 إلى المحطة واستئناف قياسات مؤشر الخلية التجريبية.
  2. بعد 30 دقيقة وقفة التجربة مرة أخرى. إزالة بعناية انتشار المتوسطة بالكامل من لوحة E-96 بئرا مع ماصة (أو متعدد القنوات ماصة)، مع الحرص على عدم تعطيل طبقة الخلايا الملتصقةبتوجيه حافة غيض ماصة لزاوية البئر. إضافة 200 ميكرولتر / جيد من المصل خالية DMEM / F12 المتوسطة (المصل الحرمان المتوسطة). ضمان التبادل السريع للخلية ثقافة المتوسط ​​للحد من الانفعالات الميكانيكية للخلايا.
  3. تمييع المركبات لفحصها لآثارها اعصاب من المخزون 1،000X مع المصل خالية DMEM / F12 المتوسطة إلى 200 × تركيز النهائي. إضافة 1 ميكرولتر المركبات لفحصها لآثارها اعصاب و1 ميكرولتر مثبطات مسارات الرسول الثانية في الآبار الفردية وفقا للخطة التجريبية.
  4. في الخلايا للدراسات الانتشار لا تتغير المتوسطة. تمييع المركبات لفحصها من المخزون 1،000X إلى 200 × التركيز النهائي في انتشار المتوسطة، وعلاج مع 1 ميكرولتر لكل بئر والاستمرار في انتشار الثقافة في المتوسط.
  5. استئناف التجربة على مواصلة قياسات مؤشر خلية كل 15 دقيقة لمدة 96 ساعة كما هو مبين سابقا.

4. البيانات وnalysis

  1. عن العصبية / تطبيع البيانات العصبية مؤشر الخلية إلى نقطة زمنية الأخيرة قبل العلاج الدوائي أو تغيير المتوسطة للحد من التفاوت بين التجارب عن طريق اختيار "مؤشر الخلية تطبيع" و "تطبيع تايم" على الصفحة مؤامرة.
  2. تسليط الضوء على الآبار على الصفحة مؤامرة لظروف تجريبية من الفائدة وانقر على "إضافة" لرسم منحنيات طبيعية مؤشر الخلية. مراقبة حركية / الأثر السمي العصبي اعصاب، أو من الرسل الثاني تثبيط وتطبيع منحنيات مؤشر الخلية بوصفها وظيفة من الزمن.
  3. مراقبة منحنيات مؤشر خلية لاختبار العلاجات المخدرات في وسط انتشار بوصفها وظيفة من الوقت لتقييم ما إذا كان لها تأثير على انتشار ويشارك في اعصاب / الأثر السمي العصبي.
  4. تصدير المعلومات التجريبية لجميع النقاط خلية وقت الفهرس من خلية الصفحة برنامج مؤشر إلى ملف Excel لبدء التقييم الإحصائي للنتائج
    ملاحظة: كخطوة أولية في التحليل الإحصائي مجموعة من تعديل برامج MATLAB أن استخدام اختبار t وولش، مع القيمة ص تآمر semilogarithmically، واستخدام محور مقلوب ضد المقياس الزمني (على النحو المنصوص عليه ملفات التعليمات البرمجية التكميلية). هذه البرامج تسمح للكشف عن القيم ص الإفراط في مدار الساعة من الوقت الحقيقي التجربة محلل الخلية بأكملها، وبالتالي المعونة اختيار النقاط الزمنية للتحليل الإحصائي أكثر تفصيلا. انظر المواد التكميلية للحصول على معلومات مفصلة عن البرامج.
  5. للتحليل الإحصائي من الاختلافات في قيم مؤشر الخلية في ظل ظروف معاملة مختلفة في نقاط زمنية محددة، حدد القيم مؤشر الخلية في نقاط زمنية منها من ملف Excel المصدرة. تحليل القيم مؤشر الخليوي لنقاط زمنية محددة مع اتجاه واحد أو اتجاهين تحليل التباين (ANOVA)، يليه اختبار آخر، خاصة باستخدام البرامج الإحصائية.

النتائج

يؤدي الحرمان من الدم إلى انخفاض في قيم مؤشر الخلية، والتي يمكن رصدها بشكل مستمر مع محلل خلية في الوقت الحقيقي

المحفزات السمية العصبية إلى الخلايا تؤدي إلى انخفاض في قيم مؤشر الخلية، والتي يمكن رصدها في الوقت الحقيقي ...

Discussion

يقدم البروتوكول الحالي فائدة محلل خلية في الوقت الحقيقي لتقييم مستمر وتحت ظروف خالية من تسمية / التأثيرات السمية العصبية اعصاب من المركبات في خطوط الخلايا العصبية وإلى التبصر في مسارات الرسول الثانية المشاركة في التنفيذ.

على ال?...

Disclosures

تم برعاية تكاليف النشر للفيديو مادة الحالية "ACEA العلوم البيولوجية".

Acknowledgements

Financial support for the experiments presented in the study was provided by the Marie Heim-Vögtlin program of the Swiss National Science Foundation.

We thank Ms. Johanna Nyffeler for developing a set of modified MATLAB programs for screening for statistically significant differences in real-time cell analyzer’s data and Dr. Yama Abassi for helpful discussion.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
xCELLigence  RTCA SP system bundleACEA BiosciencesNo: 00380601030Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit
E-plate 96ACEA BiosciencesNo: 05232368001For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station
SK-N-SH cellsATCC (in partnership with LGC Standards)HTB-11Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest
DMEM/F12 Sigma-AldrichD8437Cell culture medium
Fetal bovine serumLife Technologies16140-063Supplements proliferation, but not serum deprivation medium
Tissue culture flask T175Sarstedt83.1812.302For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96
0.05% Trypsin-EDTALife Technologies25300-054For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks
Scepter 2.0 cell counterMerck MilliporePHCC20060Automated cell counter
Phosphate-buffered salineLife Technologies10010-015For washing the cells
(±)-DOI hydrochlorideSigma-AldrichD1015-HT2A agonist for cell culture treatment
LY-294002 hydrochlorideSigma-AldrichL9908PI3-K inhibitor for cell culture treatment 
Lisuride maleateTocris Bioscience4052Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD4540For dissolving LY-294002 and lisuride maleate

References

  1. Cavallucci, V., D'Amelio, M. Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases. Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).
  2. Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. Focus on Neurological Diseases. , (2007).
  3. Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability. Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).
  4. Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
  5. Diemert, S., et al. Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).
  6. Kustermann, S., et al. A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects. Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).
  7. Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. 5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).
  8. González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
  9. Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells. J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).
  10. Galante, D., et al. Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).
  11. Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD. Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

90

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved