Analyzer הנייד מבוססת עכבה בזמן אמת ככלי להתוות מסלולים מולקולריים מעורבים ברעילות העצבית וneuroprotection בקו תאים עצבי

Summary

Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.

Abstract

יש להם הפרעות הקשורות למוח רבים מוות של תאים עצביים המעורב בפתופיזיולוגיה שלהם. השתפר בדגמי מבחנה ללמוד השפעות נוירו או רעילות של תרופות ומסלולים במורד הזרם המעורבים יעזרו לקבל תובנות לגבי המנגנונים המולקולריים של neuroprotection / רעילות עצבית ועלולים להקל על פיתוח תרופה. עם זאת, יש לי מבחני קיימים רבים במבחנה רעילות מגבלות עיקריות - רוב להעריך רעילות עצבית וneuroprotection בנקודת זמן אחת, לא מאפשר לראות בזמן הקורס וקינטיקה של ההשפעה. יתר על כן, את ההזדמנות כדי לאסוף מידע על מסלולי איתות במורד הזרם מעורבים בneuroprotection בזמן אמת תהיה בעל חשיבות רבה. בפרוטוקול הנוכחי אנו מתארים את השימוש של מנתח תא עכבה מבוססת בזמן אמת כדי לקבוע את ההשפעות להחדיר 2A סרוטונין _(2A 5-HT) אגוניסטים קולט בשורת תאים עצביים תחת קונדיט התווית חופשית וזמן אמתיונים באמצעות מדידות עכבה. יתר על כן, אנו מראים כי מעכבים של מסלולי שליח שני יכולים לשמש כדי להתוות מולקולות במורד הזרם מעורבות בהשפעת ההגנה העצבית. אנו גם מתארים את השירות של טכניקה זו כדי לקבוע אם השפעה על שגשוג תאים תורמת לאפקט הגנה עצבי שנצפה. המערכת מנצלת צלחות המיקרואלקטרוניקה מיוחדות המכונים E-צלחות שמכילים לסירוגין מערכי microelectrode זהב על המשטח התחתון של הבארות, המשמשים כחיישני תא. קריאת העכבה היא שונה על ידי מספר התאים חסיד, כדאיות תא, מורפולוגיה, וההידבקות. פרמטר ממדים הנקרא Cell המדד נגזר ממדידות העכבה חשמליות ומשמש כדי לייצג את מצב התא. בסך הכל, מנתח תא העכבה מבוססת בזמן אמת מאפשר בזמן אמת, הערכה ללא תווית של neuroprotection ורעילות עצבי, וההערכה של מעורבות מסלולי שליח שנייה, שתרם ליותרהערכה מפורטת ותפוקה גבוהה של תרכובות הגנה עצביות פוטנציאליות במבחנה, לבחירת מועמדים טיפוליים.

Introduction

מוות של תאים עצביים ממלא תפקיד קריטי בהפתופיזיולוגיה של הפרעות הקשורות למוח רבים ^1. הזמינות של תפוקה גבוהה אמינה ובמבחני רעילות מבחנה היא קריטית כדי לקבל תובנות טובות יותר את המנגנונים של רעילות עצבית וכדי לעזור לבחור מולקולות הגנה עצביות כמועמדים טיפוליים בפיתוח תרופות ^2. עם זאת, יש מגבלות רבות לשימוש נרחב ביותר בassays.They רעילות העצבית המבחנה להעריך רעילות עצבית / neuroprotection בנקודת זמן אחת שאינו מאפשר רזולוציה קינטית; לעתים קרובות להשתמש בתווית או בדיקה שיכולה להפריע למסלולי האיתות ולהגביל מחקרים נוספים באותה אוכלוסיית תא, ולעתים קרובות הן עתיר עבודה, ובמקרים רבים לא מספק תובנה מכניסטית. במחקר הנוכחי אנו להדגים את התועלת של מנתח תא עכבה מבוססת בזמן אמת כדי לקבוע רעילות עצבית וneuroprotection בשורת תאים עצבי בזמן אמת ותחת ללא תוויתתנאים ולספק תובנות לגבי מנגנונים במורד הזרם באמצעות ניתוח של מסלולי שליח שני המעורבים בהשפעה.

מחקרים קודמים אישרו את תוקפו של מנתח התא בזמן אמת כדי לקבוע רעיל, כמו גם השפעות על שגשוג תאים בשורות תאים בהשוואה ^ל3,4,5,6 טכניקות סטנדרטי. לדוגמא, מתאם טוב נצפה בין קריאות של assay כדאיות תא WST-1 הסטנדרטי וערכי אינדקס סלולריים במספר נקודות זמן בתנאי התפשטות בסיסיים ולאחר שתי פרדיגמות רעילות שונות בתאי הלה ^3. בA549 והתפשטות תאי MDA-MB-231 ורעיל עורר עם פקליטקסל מייצב microtubule הראה ערכים דומים מאוד כאשר הוערך על ידי מדידות מדד התא וsulforhodamine B משמש standardly (SRB) assay ^4. בשורת התאים העצבית של הנוירונים בהיפוקמפוס הנציחו מדידות מדד HT-22 ניידים אומתו לt היכולת שלהםo לזהות התפשטות תאים, cytotoxicity גלוטמט וcytoprotection נגד 3 (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) בשימוש נרחב assay 2,5-diphenyltetrazolium-רומיד (MTT) ^5. באותו המחקר תוצאות assay MTT ומדידות מדד התא גם בקורלציה גם במדידת התפשטות עצבית ותאים, רעיל אחרי קיפוח גורמי גדילה והצלה של cytotoxicity ידי QVD המעכב פאן-caspase ^5. Cytotoxicity המושרה בתאי NIH 3T3 ידי Vandetanib (הקולטן לגורם צמיחה של אנדותל כלי דם ומעכבי הקולטן לגורם הגדילה באפידרמיס) הראה תוצאות דומות נמדדו בערכי מדד תא או assay ספיגה אדומה הניטרלי ^6.

יש לנו בשימוש לאחרונה מערכת מנתח תא בזמן אמת כדי להעריך השפעות להחדיר 2A סרוטונין אגוניסט הקולטן _(2A 5-HT) hydrochloride (±) -2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine (DOI) בשורת תאים עצביים ( תאי SK-N-SH) והוקרנו למעורבות של הערוץnd מסלולי שליח באמצעות ניטור ההשפעה של העיכוב הכימי שלהם על neuroprotection נצפה ^7. מעניין, יש קולטן _2A 5-HT אגוניסטים שתי הזיה וnonhallucinogenic (כמו DOI וlisuride, בהתאמה), שעשוי להפעיל את שניהם מסלולי שליח שני נפוצים ומובחנים ^8.

היתרונות של הטכניקה שהוצגה הם שהיא מאפשרת לאסוף מידע בזמן אמת על הישרדות תא שבמהלך ימים, כדי להתוות מסלולים שני שליח מעורב, על מנת להעריך את תרומתה האפשרית של תופעות התפשטות לneuroprotection, וכדי לבחור זמן אופטימלי ללימודי נקודת סיום נוספים על אותה אוכלוסיית התאים. תרשים סכמטי של זרימת העבודה בפרוטוקול הנוכחי מוצג באיור 1.

Protocol

.1 הכנה

1. הנח התחנה של מנתח התא בזמן אמת בתרבית רקמת חממה נקבעה על 37 מעלות צלזיוס ועם 5% CO _2. לבצע את כל הטיפול בתרבית התאים וטיפולים תרופתיים במכסת מנוע בתרבית רקמה בתנאים סטריליים.
2. הערה: שורות תאים עצבית הדורשות הגדרות טמפרטורה שונות בהשוואה לתנאים סטנדרטיים לתרבות, צריכים להיות בהתאם. לשורות תאים בחולשה חסיד, להשתמש סוכני ציפוי כדי להקל על האינטראקציה של תאים עם microelectrodes הזהב בחלקו התחתון של הבארות של E-פלייט 96.
3. הכן את פתרונות 1,000X המניה של התרכובות תרופתי לטיפול בתרבית תאים (סוכני הגנה עצביים או מעכבי מסלולי שליח שני בממס המתאים - dimethylsulfoxide או מים סטריליים) ולאחסן אותם ב-20 מעלות צלזיוס. השתמש בממס כרכב בטיפולים הבאים.
4. תאי נוירובלסטומה האנושית תרבות SK-N-SH בDMEM / F12 בינוניים בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) (בינוני התפשטות) בצלוחיות תרבית תאים עם 175 ² סנטימטר משטח לצפיפות של כ -75%. לשמור על מספר מעבר תא בטווח (של כ 10 מעברים) כדי לוודא התאמה בין ניסויים במונחים של שיעור התפשטות תאים ותגובה לרעיל. מספרי מעבר נמוכים יותר עדיפים.
5. שטוף את שכבת תאי SK-N-SH חסיד עם PBS, וtrypsinize עם 0.05% פתרון טריפסין-EDTA במשך 5 דקות ב37 ג. צנטריפוגה התאים ב170 גרם × למשך 5 דקות כדי להסיר טריפסין. Resuspend התאים בינוני התפשטות 10 מ"ל. ספירת התאים עם דלפק תא שרביט השלטון ולהתאים מספר סלולארי ל300,000 תאים / מ"ל ​​על ידי דילול תאים עם מדיום הפצת נשק גרעיני.

2 ציפוי והתפשטות של תאי SK-N-SH

1. הוסף בינוני התפשטות 100 μl היטב בכל E-פלייט 96 ולהשאיר אותה למשך 30 דקות במכסת המנוע בתרבית הרקמה בRT לאזן. הכנס את E-Plate 96 בתחנת מנתח תא בזמן אמת בחממת CO ₂ על 37 מעלות צלזיוס.
2. הפעל את תוכנת מנתח תא בזמן אמת. בדף הפריסה בחר בבארות ייכללו בניסוי ולהיכנס בתיבות עריכת המידע על סוג התא, מספר תאים, שמות וריכוזים של תרכובות כימיות המשמשות לטיפול בתאים.
   הערה: למטרות פרוטוקול זה לפחות 4 חזרות מומלצות לכל טיפול.
3. בדף תוכנת לוח זמנים לקבוע "מדרגות" שנכללו בניסוי, על ידי בחירת מספר מטאטא מדידה נייד אינדקס והמרווח בין ניגוב לניגוב לכל שלב. מאז שלב 1 נקבע מראש למדידת רקע, בחר באפשרות "הוסף צעד" ושלב להגדיר 2 כדי למדוד את מדד התא כל 15 דקות ל96 שעה.
   הערה: לקבלת טיפולים, שבו אפקטים עם קינטיקה מהירה צפויים, להגדיר סריקות במרווחים קצרים יותר.
4. לחץ על התחל כדי להתחיל בשלב שנקבע מראש באופן אוטומטי 1ולמדוד את עכבת הרקע של התקשורת. ערך זה הוא מפחית באופן אוטומטי על ידי התוכנה בכל נקודת נתונים פעם אחת את התאים נוספים לבארות.
5. השתמש ההשעיה התא שהוכן קודם לכן בשלב 1.5) של 300,000 תאים / מ"ל ​​במדיום הפצה. 30,000 תאים / היטב לתא רעילות / לימודי neuroprotection ו15,000 תאים / היטב עבור מחקרי התפשטות תאים. קח את E-הצלחת ולהוסיף 100 השעיה תא μl בכל טוב לרעילות תא מחקרי neuroprotection / ולהוסיף השעיה תא 50 μl ובינוני התפשטות 50 μl בכל טוב ללימודי התפשטות תאים. מספר התאים מצופים בכל טוב צריך להיות מותאם עבור כל שורת תאים באופן אמפירי.
6. מערבולת בעדינות את E-פלייט 96 אפילו ציפוי של התאים. השאר את E-פלייט 96 ל30 דקות במכסת המנוע בתרבית הרקמה בRT כדי לאפשר את התאים להתיישב באופן שווה לתחתית הבארות.
7. הכנס את E-פלייט 96 בתחנת מנתח תא בזמן אמת ולהתחיל שלב 2 בעמ 'לוח זמניםגיל. צג ערכי אינדקס תא לאורך כל הניסוי על ידי הצגת עקומות התא בדף המגרש ונתוני מדד תא גלם בתא עמוד ראשי של התוכנה.

.3 סרום מניעת

1. 24 שעות לאחר ציפוי התאים, להשהות את הניסוי, ולהסיר את E-פלייט 96 מתחנת מנתח תא בזמן אמת. לדלל מעכבי שליח שני ממניות 1,000X עם מדיום סרום ללא / F12 DMEM - 200 × הריכוז הסופי. פנק את התאים עם 1 מעכבי μl של מסלולי שליח שני להיבדק על מעורבותם ברעילות העצבית / neuroprotection 30 דקות לפני ביצוע רעיל, כדי לעכב את המסלולים בהתאמה. חזור E-פלייט 96 לתחנה ולחדש את מדידות אינדקס סלולארי ניסיוניות.
2. לאחר 30 דקות להשהות את הניסוי שוב. מוציאים בזהירות בינונית התפשטות מלאה מE-פלייט 96 בארות עם טפטפת (או רב ערוצי פיפטה), נזהר שלא לשבש את שכבת תאים חסידעל ידי הפניית הקצה של קצה פיפטה לפינה של הבאר. הוסף 200 μl / גם של הסרום ללא DMEM / בינוני F12 (בינוני קיפוח בסרום). להבטיח חילופי מהירים של מדיום תרבות תא כדי למזער תסיסה מכאנית של התאים.
3. לדלל תרכובות להיבדק להשפעות נוירו ממניית 1,000X עם מדיום DMEM / F12 סרום ללא 200 × הריכוז הסופי. הוספת תרכובות μl 1 להיבדק להשפעות נוירו ו1 מעכבי μl של מסלולי שליח שני בבארות בודדות על פי התכנית הניסיונית.
4. בתאים ללימודי התרבות אינו משנה בינוני. לדלל תרכובות להיבדק ממניות 1,000X 200 × הריכוז הסופי במדיום הפצה, טיפול עם μl 1 לכל טוב ואמשיך תרבות במדיום הפצת נשק גרעיני.
5. קורות חיים הניסוי להמשיך במדידות מדד תא כל 15 דקות ל96 שעות כפי שנקבע בעבר.

.4 נתוניםnalysis

1. לרעילות עצבית / נתונים neuroprotection לנרמל סלולארי אינדקס לנקודת הזמן האחרון לפני טיפול תרופתי או שינוי בינוני כדי להפחית את השונות בין ניסויים על ידי בחירה "Cell אינדקס מנורמל" ו "לנרמל זמן" בדף מגרש.
2. סמן את הבארות בדף מגרש לתנאי הניסוי של עניין ולחץ על "הוסף" כדי להתוות עקומות מדד תא מנורמלות. שים לב לקינטיקה של ההשפעה הרעילה למערכת העצבים / הגנה העצבית, או של עיכוב שליחים שני כמו עקומות מדד תא מנורמלות כפונקציה של זמן.
3. שים לב לעקומות מדד תא לטיפולים תרופתיים נבדקו במדיום התרבות כפונקציה של זמן כדי להעריך אם השפעה על התפשטות מעורבת בהשפעת נוירו / העצבים.
4. לייצא את המידע הניסיוני עבור כל נקודות Cell זמן אינדקס מתא דף תוכנת האינדקס לקובץ Excel ליזום הערכה סטטיסטית של התוצאות
   הערה: כצעד ראשון בניתוח הסטטיסטי קבוצה של תוכניות MATLAB שונה המשתמשות במבחן t של וולש, עם p-value זמם semilogarithmically, לנצל ציר הפוך נגד ציר הזמן (בתנאי כקבצי קוד נוספים). תוכניות אלה מאפשרות זיהוי של p-ערכים מעל הזמן במהלך ניסוי מנתח תא בזמן אמת כולה, ובכך לסייע לבחירת נקודות זמן לניתוח סטטיסטי מפורט יותר. ראה חומר נוסף למידע מפורט על התוכניות.
5. לניתוח סטטיסטי של הבדלים בערכי אינדקס סלולריים בתנאי טיפול שונים בנקודות זמן ספציפיות, ערכי מדד תא בחרו בנקודות זמן המתאימות מקובץ Excel מיוצא. נתח את ערכי האינדקס הסלולרי לנקודתי הזמן שנבחרו עם הניתוח בכיוון אחד או דו כיוונית של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן שלאחר הוק באמצעות תוכנה סטטיסטית.

תוצאות

קיפוח סרום גורם להפחתה בערכי מדד תא, אשר יכול להיות במעקב רציף עם מנתח התא בזמן אמת

גירויים עצביים לתאים להוביל לירידה בערכי מדד תא, אשר יכול להיות במעקב בזמן אמת עם הטכניקה שהוצגה ואת הדינמיקה שבם היא תלוי בגירוי העצ?...

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מציג את התועלת של מנתח תא בזמן אמת כדי להעריך באופן רציף ובתנאים ללא תווית השפעות נוירו / הרעילות של תרכובות בשורות תאים עצביות וכדי לקבל תובנה מסלולי השליח השני המעורבים בהשפעה.

למרות שהשירות של מנתח התא בזמן אמ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
xCELLigence  RTCA SP system bundle	ACEA Biosciences	No: 00380601030	Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit
E-plate 96	ACEA Biosciences	No: 05232368001	For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station
SK-N-SH cells	ATCC (in partnership with LGC Standards)	HTB-11	Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8437	Cell culture medium
Fetal bovine serum	Life Technologies	16140-063	Supplements proliferation, but not serum deprivation medium
Tissue culture flask T175	Sarstedt	83.1812.302	For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054	For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks
Scepter 2.0 cell counter	Merck Millipore	PHCC20060	Automated cell counter
Phosphate-buffered saline	Life Technologies	10010-015	For washing the cells
(±)-DOI hydrochloride	Sigma-Aldrich	D101	5-HT2A agonist for cell culture treatment
LY-294002 hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9908	PI3-K inhibitor for cell culture treatment
Lisuride maleate	Tocris Bioscience	4052	Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540	For dissolving LY-294002 and lisuride maleate