Analyzer celular baseado em impedância Real-Time como uma ferramenta para delinear vias moleculares envolvidas na neurotoxicidade e neuroproteção em uma linha de células neuronais

Resumo

Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.

Resumo

Muitas doenças relacionadas com o cérebro tem a morte celular neuronal envolvida na sua fisiopatologia. Melhoria em modelos in vitro para estudar os efeitos neuroprotetores ou neurotóxicos das drogas e vias a jusante envolvidos ajudaria a obter insights sobre os mecanismos moleculares de neuroproteção / neurotoxicidade e, potencialmente, poderia facilitar o desenvolvimento de drogas. No entanto, muitos ensaios in vitro de toxicidade existentes têm limitações importantes - mais avaliar a neurotoxicidade e neuroprotecção num único ponto de tempo, não permitindo observar o decurso do tempo e a cinética do efeito. Além disso, a oportunidade de coletar informações sobre as vias de sinalização a jusante envolvidos na neuroproteção em tempo real seria de grande importância. No protocolo corrente que descrevem a utilização de um analisador de células à base de impedância em tempo real para determinar os efeitos neuroprotectores da serotonina 2A (5-HT _2A) agonistas do receptor numa linha de células neuronais sob livre de marcador e em tempo real Conditíons, utilizando medidas de impedância. Além disso, demonstra-se que os inibidores das vias de segundo mensageiro podem ser utilizados para delinear as moléculas jusante envolvidos no efeito neuroprotector. Os requerentes também descrevem a utilidade desta técnica para determinar se um efeito sobre a proliferação celular, contribui para um efeito neuroprotector observada. O sistema utiliza placas de microeletrônica especiais referidas como E-placas que contêm alternando matrizes de microeletrodos de ouro na superfície inferior dos poços, que servem como sensores celulares. A leitura da impedância é modificada pelo número de células aderentes, a viabilidade celular, a morfologia e a adesão. Um parâmetro adimensional chamado Índice celular é derivada das medições de impedância eléctrica e é usado para representar o estado da célula. Em geral, o analisador de células à base de impedância em tempo real permite em tempo real, livre de marcador de avaliação de neuroprotecção e neurotoxicidade, e a avaliação do envolvimento das vias de segundo mensageiro, contribuindo para maisavaliação detalhada e de alto rendimento de potenciais compostos neuroprotetores em vitro, para a seleção de candidatos terapêuticos.

Introdução

Morte das células neuronais desempenha um papel fundamental na fisiopatologia de várias doenças relacionadas com o cérebro ^1. A disponibilidade de dados fiáveis ​​e de alto rendimento em ensaios de toxicidade in vitro é fundamental para obter uma melhor visão sobre os mecanismos de neurotoxicidade e ajudar a selecionar moléculas neuroprotetores como candidatos terapêuticas no desenvolvimento de medicamentos ^2. No entanto, existem muitas limitações para mais amplamente utilizados em assays.They neurotoxicidade in vitro avaliar a neurotoxicidade / neuroprotecção a um único ponto de tempo, não permitindo resolução cinética; costumam usar etiqueta ou sonda que pode interferir com as vias de sinalização e limitar estudos adicionais na mesma população de células, e muitas vezes são de trabalho intensivo, e em muitos casos não fornecem uma visão mecanicista. No presente estudo demonstram a utilidade de um analisador de células à base de impedância em tempo real para determinar a neurotoxicidade e neuroprotecção em uma linha de células neuronais em tempo real e sob livre de marcadorcondições e fornecer informações sobre os mecanismos a jusante, através da análise das vias de segundos mensageiros envolvidos no efeito.

Estudos anteriores confirmaram a validade do analisador de células em tempo real para determinar a citotoxicidade, bem como os efeitos sobre a proliferação de células nas linhas de células em comparação com as técnicas convencionais ^3,4,5,6. Por exemplo, observou-se uma boa correlação entre as leituras do ensaio padrão de viabilidade celular WST-1 e valores de índice de células em vários pontos de tempo, sob condições de proliferação basal e após dois paradigmas diferentes tóxicos em células HeLa ^3. Em A549 e MDA-MB-231 células de proliferação e de citotoxicidade provocada com o paclitaxel microtúbulos estabilizador mostrou valores muito semelhantes, quando avaliada através de medições de índice celular e utilizado de forma padrão a sulforodamina B (SRB) ^4. Na linha de célula neuronal de neurônios do hipocampo imortalizados HT-22 Celulares medições do Índice foram validados por sua capacidade to detectar a proliferação de células, a citotoxicidade do glutamato e citoprotecção contra a amplamente utilizado 3 (4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5-difenil-brometo (MTT) ^5. No mesmo estudo os resultados do ensaio de MTT e medições de índice celular também se correlacionou bem na medição neuronal proliferação de células progenitoras, citotoxicidade após privação de fatores de crescimento e resgate de citotoxicidade pelo pan-caspase inibidor QVD ^5. A citotoxicidade induzida em células NIH 3T3 por Vandetanib (crescimento endotelial vascular receptor do factor inibidor e do receptor do factor de crescimento epidérmico), mostrou resultados semelhantes medidos com os valores de índice celular ou ensaio de incorporação de vermelho neutro ^6.

Usámos recentemente o sistema analisador de células em tempo real para avaliar os efeitos neuroprotectores da serotonina 2A (5-HT _2A) agonista do receptor de cloridrato de (±) -2,5-dimetoxi-4-iodoamphetamine (DOI), em uma linha de células neuronais ( células SK-N-SH) e selecionados para o envolvimento de secoª vias Messenger através monitorar o efeito da sua inibição química sobre a neuroproteção observada ^7. Curiosamente, o receptor 5-HT _2A tem agonistas tanto alucinógenas e nonhallucinogenic (como o DOI e lisuride, respectivamente), o que pode ativar ambas as segundas vias comuns de mensagem e distintas ^8.

As vantagens da técnica apresentada é que ela permite a coleta de informações em tempo real sobre a sobrevivência das células no decorrer do dia, para delinear as vias de segundo mensageiro envolvido, para avaliar a possível contribuição de efeitos de proliferação de neuroproteção, e para selecionar um tempo ideal para estudos adicionais de ponto final sobre a mesma população de células. Um diagrama esquemático do fluxo no protocolo actual é apresentado na Figura 1.

Protocolo

1 Preparação

1. Coloque a estação do analisador de células em tempo real num incubador de cultura de tecido fixado a 37 ° C e com 5% de CO _2. Realizar toda a manipulação de cultura de células e tratamentos farmacológicos em um capuz de cultura de tecidos em condições de esterilidade.
2. NOTA: Neuronal linhas celulares que requerem ajustes de temperatura diferentes em relação às condições normais de cultura, deve ser ajustada em conformidade. Para as linhas de células fracamente aderentes, utilizar agentes de revestimento para facilitar a interacção das células com os microeléctrodos de ouro no fundo dos poços da placa de E-96.
3. Preparar soluções 1000X ações dos compostos farmacológicos para o tratamento de cultura de células (agentes neuroprotetores ou inibidores vias de segundo mensageiro no solvente apropriado - dimetilsulfóxido ou água estéril) e armazená-los a -20 ° C. Use o solvente como veículo nos seguintes tratamentos.
4. Cultura de células de neuroblastoma humano SK-N-SH em DMEM / F12 suplementado com 10% soro fetal bovino (FBS) (meio de proliferação) em frascos de cultura de células com 175 cm ^2, a densidade de superfície de cerca de 75%. Manter passagem número de células dentro de uma gama de (cerca de 10 passagens) para verificar a coerência entre as experiências em termos de taxa de proliferação celular e resposta a citotoxicidade. São preferidos os números de passagem inferior.
5. Lava-se a camada de células SK-N-SH aderente com PBS, e trypsinize com solução de tripsina-EDTA a 0,05% durante 5 min a 37 ° C. Centrifugar as células a 170 x g durante 5 minutos para remover a tripsina. Ressuspender as células em 10 ml de meio de proliferação. Contar as células com o contador de células Scepter e ajustar o número de células de 300.000 células / ml, diluindo as células com meio de proliferação.

2. Galvanização e proliferação de SK-N-SH Células

1. Adicionar meio de proliferação de 100 ul a cada poço da placa de E-96 e deixá-lo por 30 minutos na capa de cultura de tecidos à temperatura ambiente para equilibrar. Insira o E-Plate 96 em tempo real a estação analisador de células na incubadora de CO ₂ a 37 ° C.
2. Inicie o software em tempo real analisador de células. Na página de layout, selecione os poços incluídos no experimento e entrar nas caixas de edição a informação sobre o tipo de celular, número de células, nomes e concentrações de compostos químicos utilizados para o tratamento de células.
   NOTA: Para efeitos do presente protocolo, pelo menos, 4 repetições são recomendados para cada tratamento.
3. Na página de software Programação determinar "Passos" incluídos no experimento, selecionando o número de varreduras de medição Índice de celular eo intervalo entre as varreduras para cada etapa. Desde Passo 1 é pré-determinado para a medida de fundo, selecione "Adicionar uma etapa" e defina o Passo 2 para medir o Índice de celular a cada 15 minutos durante 96 horas.
   NOTA: Para os tratamentos, no qual são esperados efeitos com cinética rápida, definir varreduras em intervalos mais curtos.
4. Clique em Iniciar para iniciar a etapa pré-determinado automaticamente ume medir a impedância dos meios de fundo. Este valor é automaticamente subtraídos pelo programa em cada ponto de dados uma vez que as células são adicionadas aos poços.
5. Utilizar a suspensão de células previamente preparada no passo 1.5) de 300.000 células / ml em meio de proliferação. 30.000 células / poço de toxicidade celular / estudos de neuroproteção e 15.000 células / poço para estudos de proliferação celular. Retire o E-Plate e adicionar 100 mL de suspensão de células por poço para os estudos de toxicidade celular / neuroproteção e adicionar suspensão de células de 50 mL e meio de proliferação 50 ul por poço para os estudos de proliferação celular. O número de células plaqueadas por cavidade tem de ser optimizada para cada linha celular empiricamente.
6. Agite suavemente o E-Plate 96, mesmo para metalização das células. Deixar a placa de E-96 durante 30 minutos na capa de cultura de tecidos à temperatura ambiente para permitir que as células assentar uniformemente ao fundo dos poços.
7. Insira o E-Plate 96 no tempo real da estação analisador de células e começar Passo 2 no Cronograma pidade. Monitorar valores do Índice de celular em todo o experimento, exibindo as curvas de celulares na página Plot e os dados do Índice de celular matérias sobre o celular Index página do software.

3. Serum Privação

1. 24 h após o plaqueamento das células, uma pausa na experiência, e remover a placa de E-96 a partir da estação em tempo real analisador de células. Dilui-se inibidores de segundo mensageiro de estoques 1000X com meio livre de soro / DMEM F12 - 200 × a concentração final. Tratar as células com 1 ul inibidores das vias de segundo mensageiro a ser testado para o seu envolvimento na neurotoxicidade / neuroprotecção 30 min antes de se iniciar a citotoxicidade, para inibir as respectivas vias. Retorne o E-Plate 96 para a estação e retomar as medições do Índice célula experimental.
2. Depois de uma pausa de 30 minutos novamente a experiência. Remova cuidadosamente meio de proliferação plenamente do E-placa de 96 poços com uma pipeta (ou multi-canal pipeta), tomando cuidado para não romper a camada de células aderentesdirigindo a extremidade da ponta da pipeta para o canto do poço. Adicione 200 ^ l / poço de DMEM isento de soro / meio F12 (meio privação de soro). Assegurar a troca rápida de meio de cultura de células, para minimizar a agitação mecânica das células.
3. Dilui-se os compostos a ser testados quanto aos seus efeitos neuroprotectores de 1000X estoque com meio DMEM / F12 isento de soro de 200 × a concentração final. Adicionar 1 ul compostos a ser testados quanto aos seus efeitos neuroprotectores e 1 ul inibidores das vias de segundo mensageiro em poços individuais de acordo com o plano experimental.
4. Em células para estudos de proliferação não mudam médio. Dilui-se os compostos a ensaiar a partir de estoque 1000X de 200 × a concentração final no meio de proliferação, trata-se com 1 ul por poço e continuar a cultura no meio de proliferação.
5. Retomar a experiência para continuar com celulares medições índice a cada 15 minutos durante 96 horas como definido anteriormente.

4 Dados Análise

1. Para neurotoxicidade / dados de neuroproteção normalizar Índice celular para o último ponto de tempo antes do tratamento farmacológico ou mudança de meio para reduzir a variação entre os experimentos, selecionando "Índice celular normalizado" e "normalizar Time" na página Plot.
2. Destaque os poços na página Plot para as condições experimentais de interesse e clique em "Adicionar" para traçar as curvas de índice de celular normalizados. Observar a cinética do efeito neurotóxico / neuroprotectora, ou de inibição segundo mensageiros como curvas normalizadas Índice celular como uma função do tempo.
3. Observar as curvas Índice celular para os tratamentos com fármacos testados em meio de proliferação, como uma função do tempo para avaliar se um efeito sobre a proliferação está envolvido no efeito neuroprotector / neurotóxico.
4. Exportar a informação experimental para todos os pontos celular tempo Índice da página em software celular índice em um arquivo do Excel para iniciar a avaliação estatística dos resultados
   NOTA: Como passo inicial na análise estatística de um conjunto de programas modificados MATLAB que usam o teste t de Welch, com o valor de p plotados semilogarithmically, utilizar eixo invertido contra a escala de tempo (fornecido como arquivos de código complementar). Estes programas permitem a detecção de valores de p ao longo do tempo de toda uma experiência em tempo real analisador de células e, assim, ajudar a seleção de pontos de tempo para a análise estatística mais detalhada. Veja o material suplementar para obter informações detalhadas sobre os programas.
5. Para a análise estatística das diferenças de valores do Índice de celulares em diferentes condições de tratamento em momentos específicos, selecione valores do Índice de celular em respectivos tempos de arquivo exportado Excel. Analisar os valores do Índice de celular para os pontos de tempo seleccionados com unidirecional ou bidirecional análise de variância (ANOVA) seguida do teste post-hoc usando o software estatístico.

Resultados

Privação de soro leva à diminuição nos valores de índice de células, que podem ser monitorados continuamente com o analisador de células em tempo real

Neurotóxicos estímulos para as células de levar a uma redução nos valores do índice de células, o que pode ser monitorado em tempo real com a técnica apresentada e a dinâmica dos quais é dependente do estímulo neurotóxico específico e do tipo de célula estudada. Figura 2 mostra o au...

Discussão

O protocolo atual apresenta a utilidade de um analisador de células em tempo real para avaliar de forma contínua e em condições livres de etiqueta os efeitos neuroprotetores / neurotóxicos de compostos em linhas de células neuronais e para obter insights sobre as segundas vias mensageiros envolvidos no efeito.

Embora a utilidade do analisador de células em tempo real para estudar a toxicidade e efeitos das drogas sobre a proliferação celular é geralmente reconhecido, poucos estudos...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
xCELLigence  RTCA SP system bundle	ACEA Biosciences	No: 00380601030	Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit
E-plate 96	ACEA Biosciences	No: 05232368001	For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station
SK-N-SH cells	ATCC (in partnership with LGC Standards)	HTB-11	Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8437	Cell culture medium
Fetal bovine serum	Life Technologies	16140-063	Supplements proliferation, but not serum deprivation medium
Tissue culture flask T175	Sarstedt	83.1812.302	For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054	For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks
Scepter 2.0 cell counter	Merck Millipore	PHCC20060	Automated cell counter
Phosphate-buffered saline	Life Technologies	10010-015	For washing the cells
(±)-DOI hydrochloride	Sigma-Aldrich	D101	5-HT2A agonist for cell culture treatment
LY-294002 hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9908	PI3-K inhibitor for cell culture treatment
Lisuride maleate	Tocris Bioscience	4052	Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540	For dissolving LY-294002 and lisuride maleate