Bir Nöronal Hücre Line Neurotoxicity ve nöro ilgilendim Moleküler Pathways Delineate bir aracı olarak Real-Time Empedans tabanlı Cell Analyzer

Özet

Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.

Özet

Birçok beyin ile ilgili bozukluklar kendi patofizyolojisinde rol nöronal hücre ölümünü var. Uyuşturucu ve nöro / nörotoksisitenin moleküler mekanizmaları anlamak ve potansiyel ilaç gelişimini kolaylaştırabilir yardımcı olacağını çıkıyor aşağı yollar nöroprotektif veya nörotoksik etkilerini incelemek için in vitro modellerinde geliştirilmiş. Ancak, birçok mevcut in vitro toksisite deneyleri büyük sınırlamaları var - çoğu değil zaman ders ve etkisi kinetiğini gözlemlemek için izin, tek bir zaman noktasında nörotoksisiteyi ve nöro değerlendirmek. Ayrıca, gerçek zamanlı olarak nöro katılan aşağı sinyal yollar hakkında bilgi toplamak için fırsat büyük önem olurdu. Mevcut protokolde, etiket içermeyen ve gerçek zamanlı iklimlendirme altında, nöronal hücre hattında serotonin 2A _(5-HT2A) reseptör agonistlerinin nöro-koruyucu etkisini araştırmak üzere bir reel-zamanlı empedans tabanlı hücre analiz kullanılmasını tarif ederempedans ölçümleri kullanarak iyonları. Ayrıca, ikinci haberci yollarının inhibitörleri nöro-koruyucu etkisinin dahil alt molekülleri tanımlamak için kullanılabileceğini göstermektedir. Ayrıca hücre proliferasyonu üzerinde bir etkiye sahip bir gözlenen nöro-koruyucu etkisine katkıda olup olmadığını belirlemek için bu tekniğin programı açıklanmaktadır. Sistem, kuyuların alt yüzeyi üzerinde altın mikro-elektrot diziler alternatif hücre sensör olarak işlev gören ihtiva e-Plakalar olarak adlandırılır özel mikroelektronik plakalar kullanır. Empedans okuma yapışık hücreler, hücre canlılığı, morfolojisi ve yapışma sayısına göre modifiye edilir. Hücre Endeksi olarak adlandırılan bir boyutsuz parametre elektrik empedans ölçümleri elde edilir ve hücre durumunu temsil etmek için kullanılır. Genel olarak, gerçek zamanlı empedans tabanlı hücre analiz fazla katkı, gerçek zamanlı, nöro-korumanın ve nörotoksisite etiketsiz değerlendirmesi, haberci ve ikinci yollar katılımının değerlendirilmesine izin verirtedavi ilaçlarını seçilmesi için in vitro nöro-koruyucu potansiyel bileşiklerin ayrıntılı ve yüksek verim değerlendirmesi.

Giriş

Nöronal hücre ölümü, birçok ^beyin-1 ile ilişkili bozuklukların patofizyolojisinde önemli bir rol oynar. In vitro toksisite deneyleri güvenilir ve yüksek verimlilik kullanılabilirliği nörotoksisitenin mekanizmaları daha iyi anlamanıza ve ilaç geliştirme ² terapötik aday olarak nöro molekülleri seçmenize yardımcı için çok önemlidir. Bununla birlikte, en yaygın olarak kinetik çözülmesine izin veren tek bir zaman noktasında nörotoksisite / değerlendirmek için nöro-nitro nörotoksisite assays.They olarak kullanılan bir çok sınırlamalar mevcuttur; çoğu zaman sinyal yollarına müdahale ve aynı hücre popülasyonunda ek çalışmalar sınırlamak ve genellikle bir iş gücünü gerektirir ve pek çok durumda mekanik bir bilgi sağlar yok olabilir veya bir etiket sonda kullanma. Bu çalışmada gerçek zamanlı ve altında, nöronal hücre hattında nöro-toksisiteyi ve nöro-belirlemek için, gerçek zamanlı bir empedans tabanlı hücre analiz yararlılığını göstermek etiketsizkoşulları etkilenmesinde rol ikinci haberci yollara analizi yoluyla aşağı mekanizmaları içgörü sağlamak ve.

Önceki çalışmalar, standart teknikler ile karşılaştırıldığında, ^3,4,5,6 sitotoksisite gibi hücre hatları, hücre çoğalması üzerindeki etkisini belirlemek için, gerçek zamanlı hücre analiz geçerliliğini teyit etmiştir. Örneğin, bir iyi bir korelasyon bazal koşullar altında çoğalması ve HeLa hücrelerinde ^3, iki farklı toksik paradigmaların ardından çeşitli zaman noktalarında standart hücre canlılığı, WST-1 deneyinin okumalar ve hücre endeksi değerleri arasında gözlenmiştir. Celi Endeksi ölçümleri ile ve standart olarak kullanılan sülforodamin B (SRB) ⁴ deney sırasında mikrotübül dengeleyici paklitaksel ile tahrik A549 ve MDA-MB-231 hücreleri çoğalması ve sitotoksisitesinde çok benzer sonuçlar göstermiştir. Ölümsüzleştirilmiş hipokampal nöronlarının nöronal hücre hattı HT-22 Hücre indeksi ölçümlerinin yetenekleri t doğrulanmıştıro yaygın olarak kullanılan 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl) karşı, hücre proliferasyonunu, glutamat sitotoksisitesinin ve sitoproteksiyonunu 2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) deneyi ⁵ algılar. Aynı çalışmada MTT deneyi sonuçları ve Hücre Endeksi ölçümleri de pan-kaspaz inhibitörü Qvd ⁵ ile büyüme faktörleri yoksunluk ve sitotoksisite kurtarılması sonrasında nöronal progenitör hücrelerin çoğalması, sitotoksitesi ölçme pozitif ilişkilidir. Vandetanib (vasküler endotel büyüme faktörü reseptör ve epidermal büyüme faktörü reseptörü inhibitörü) ile NIH 3T3 hücrelerinde olduğu sitotoksisitesi, hücre endeksi değerleri ya da nötr kırmızı alım deneyi ⁶ ölçülen benzer sonuçlar göstermiştir.

Son zamanlarda, serotonin 2A nöro-koruyucu etkisini değerlendirmek için gerçek zaman hücre analiz sistemi kullanılmaktadır _(5-HT2A) alıcı agonisti (±) -2,5-dimetoksi-4-iodoamphetamine hidroklorür, nöronal bir hücre hattında (DOI) ( SK-N-SH hücreleri) ve Seco katılımı açısından tarandıgözlenen ^nöro-7 kimyasal inhibisyon etkinin izlenmesi sayesinde nci mesaj yolakları. İlginç bir şekilde, _5-HT2A reseptör yaygın ve farklı bir ikinci haberci yolları ⁸ hem de aktive edebilmektedir (Doi ve lisurid, sırasıyla gibi) ve halüsinojen nonhallucinogenic hem agonistler hem de vardır.

Sunulan tekniğin avantajları, gün içerisinde hücre sağkalım üzerine gerçek zamanlı bilgi toplamak için nörokoruma çoğalması etkilerin olası katkısını değerlendirmek için, ve optimal zamanı seçmek için, ikinci-haberci yollar dahil belirginleştiren için izin vardır Aynı hücre popülasyonu üzerinde ek uç nokta çalışmaları için. Mevcut protokolde iş akışının şematik bir diyagramı Şekil 1'de sunulmuştur.

Protokol

1. Hazırlık

1. 37 ° C'de ve% 5 _CO2 ile ayarlanmış bir doku kültürü inkübatörü içinde, gerçek zamanlı hücre analiz cihazının istasyonu yerleştirin. , Steril koşullar altında, bir doku kültürü kaputu tüm hücre kültürü işleme ve farmakolojik tedaviler yürütmek.
2. Not: kültür standart koşullar ile karşılaştırıldığında farklı bir sıcaklık ayarı gerektiren Nöronal hücre çizgileri, buna göre ayarlanmalıdır. Zayıf, yapışan hücre hatları için, E-Levha 96 kuyu altındaki altın mikroelektrotla hücre etkileşimi kolaylaştırmak için kaplama maddeleri kullanılır.
3. (Uygun bir çözücü içinde nöro-koruyucu maddeler ya da ikinci haberci yollar inhibitörleri - dimetilsülfoksit ya da steril su) 1,000X hazır hücre kültürü tedavisi için farmakolojik bileşimlerin çözelti hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın. Aşağıdaki tedavilerinde araç olarak çözücü kullanın.
4. DMEM / F1 Kültürü insan nöroblastoma SK-N-SH hücreleri2 ortamının, yaklaşık% 75 bir yoğunluğa 175 ^cm2 yüzey ile hücre kültürü şişeleri içinde% 10 fetal sığır serumu (FBS) (çoğalma ortamı) ile takviye edilmiştir. Hücre çoğalması ve sitotoksisite tepki hızı açısından deney arasında tutarlılık tespit etmek için (yaklaşık 10 geçitlerin) aralığında bir hücre kanalı sayısı tutun. Alt geçit numaraları tercih edilir.
5. PBS ile yapışık SK-N-SH hücre tabakasını yıkayın ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca% 0.05 tripsin-EDTA ile tripsinize edin çözeltisi. Santrifüj, 5 dakika boyunca 170 x g 'de, hücreler tripsin kaldırın. 10 ml çoğalma ortamı hücreleri tekrar süspansiyon. Scepter hücre sayacı ile hücrelerin sayısı ve çoğalma ortamı ile hücrelerin sulandırarak 300,000 hücre / ml hücre sayısını ayarlayın.

2. Kaplama ve SK-N-SH hücrelerinin çoğalma

1. E-96 Levha her çukuruna 100 ul çoğalma ortamı ilave edin ve oda sıcaklığında dengelenmeye doku kültürü kaputu 30 dakika boyunca bırakın. E-Pla takın37 ° C'de _CO2 inkübatöründe gerçek zamanlı hücre analiz istasyonunda 96 te.
2. Gerçek zamanlı hücre analiz yazılımını başlatın. Düzeni sayfa kuyular deneye dahil seçin ve düzenleme kutularını hücre tipi, hücre sayısı, isimleri ve hücre tedavisinde kullanılan kimyasal bileşiklerin konsantrasyonları hakkında bilgi girin.
   NOT: Bu protokolün amaçları için en az 4 replika her tedavi için tavsiye edilir.
3. Program yazılım sayfada deneyde, Hücre İndeksi ve her adım için yapılan taramalar arasındaki aralığı ölçüm silme sayısını seçerek dahil "Adımlar" belirler. Adım 1 arka plan ölçümü için önceden belirlenmiş olduğundan, hücre indeksi 96 saat boyunca her 15 dakikada ölçmek ve set Adım 2 "bir adım ekleyin" seçeneğini seçin.
   NOT: tedaviler için, hangi Hızlı kinetik ile etkiler, beklenen daha kısa aralıklarla süpürür ayarlayın.
4. Otomatik olarak önceden belirlenmiş Adım başlatmak için Başlat '1ve ortamın arka empedansı ölçmek. Hücreler, oyuklara ilave edilir sonra bu değeri otomatik olarak her bir veri noktasında yazılım tarafından çıkartılır.
5. Çoğalma ortamı içinde 300,000 hücre / ml 'lik, daha önce 1.5 adım hazırlandı) hücre süspansiyonu kullanmaktadır. / Oyuk hücre toksisitesi / nöro çalışmalar ve iyi hücre çoğalması çalışmaları için 15,000 hücre / için 30,000 hücre. E-Plate çıkarın ve hücre toksisitesi / nöro çalışmaları için göz başına 100 ul hücre süspansiyonu ekleyin ve hücre çoğalma çalışmaları için oyuk başına 50 ul hücre süspansiyonu, 50 ul çoğalması orta ekleyin. Gözenek başına plakalanan hücre sayısı deneysel olarak her bir hücre hattı için optimize edilmesi gerekmektedir.
6. Yavaşça hücrelerin bile kaplanması için E-Plate 96 döndürün. Hücreler kuyuların alt eşit yerleşmek izin vermek için oda sıcaklığında doku kültürü kaputu 30 dakika için E-Plate 96 bırakın.
7. Gerçek zamanlı hücre analiz istasyonu E-Plate 96 takın ve zamanlama p Adım 2 başlayacakyaş. Plot sayfa ve yazılımın Hücre İndeks sayfasına ham Hücre Endeksi verilerine hücre eğrileri görüntüleyerek deney boyunca Hücre Endeksi değerleri izleyin.

3. Serum Yoksunluk

1. 24 saat hücreleri kaplama sonra, deney duraklatmak ve gerçek zamanlı hücre analiz istasyonuna E-Plakasını 96 kaldırın. DMEM / F12, serum-içermeyen ortam ile 1,000X stoktan ikinci haberci inhibitörleri seyreltin - 200 x son konsantrasyon. Ilgili yolları inhibe etmek için, ikinci haberci yollarının 1 ul önleyicileri 30 dakika geçmeden önce sitotoksisite nörotoksisite / nöro katılımları için test edilecek olan hücrelerin tedavi edin. Istasyonuna E-Plate 96 İade ve deneysel Hücre Endeksi ölçümleri devam.
2. 30 dakika sonra tekrar denemenizi durdurabilirsiniz. Dikkatle yapışık hücre tabakasını bozmak için özen bir pipet (veya çok-kanallı pipet) ile e-Plate tam olarak 96 kuyu çoğalması orta kaldırmakKuyunun köşesine pipet kenarını yönlendirerek. 200 ul / serum içermeyen DMEM / F12 ortamında (serum yoksunluğu ortamı) oyuk ilave edin. Hücrelerin mekanik ajitasyon en aza indirmek için, hücre kültür ortamı hızlı bir değişiminin sağlanması.
3. Seyreltik bileşikleri nihai konsantrasyon x 200 olacağı şekilde, serum içermeyen DMEM / F12 ortamı ile 1,000X stoktan bunların nöroprotektif etkileri için test edilecek. 1 ul ekle bileşikleri bunların nöroprotektif etkileri, deneysel planına uygun olarak, tek tek oyuklara ikinci haberci yollarının 1 ul inhibitörleri için test edilecek.
4. Çoğalma çalışmaları için hücreler ortam içinde değişmez. Oyuk başına 1 ul ile tedavi etmek ve çoğalma ortamı içinde kültüre devam çoğalma ortamı içinde nihai konsantrasyon x 200 1,000X stoktan, test edilecek bileşikler seyreltin.
5. Önceden ayarlanmış olarak 96 saat boyunca Hücre Endeksi ölçümleri ile her 15 dk devam deney sürdürün.

4. Veri AANALİZ

1. Nörotoksisite için / nöroproteksiyon veri Plot sayfada "Saat normalleştirmek" "normalize Hücre Göstergesi" seçerek deneyler arasındaki farklılıkları azaltmak ve farmakolojik tedavi veya orta değişiminden önce son kez noktaya Hücre Endeksi normalleştirmek.
2. Ilgi deney koşulları için Plot sayfasında kuyuları vurgulayın ve normalize Hücre Endeksi eğrileri çizmek için "Ekle" butonuna tıklayınız. Ya da zamanın bir fonksiyonu olarak normalize Celi Endeksi eğrileri gibi ikinci habercileri inhibisyon nörotoksik / nöro-koruyucu etkinin kinetiğinin dikkate alınmalıdır.
3. Çoğalması üzerinde bir etkisi nöro-koruyucu / nörotoksik etkisi olarak yer alıp almadığını değerlendirmek için, zamanın bir fonksiyonu olarak çoğalma ortamı içinde, test edilen ilaç tedavileri için Hücre Endeksi eğriler dikkat edin.
4. Sonuçların istatistiksel olarak değerlendirilmesi başlatmak için bir Excel dosyası içine Hücre Endeksi yazılım sayfadaki tüm Cep Endeksi zaman noktaları için deneysel bilgi İhracat
   Not: İstatistiksel analizde bir ilk adım p-değeri ile, Welch'in t-testi kullanmak modifiye MATLAB programları bir dizi semilogarithmically çizilen gibi, (ek kod dosyaları olarak verilmiştir) zaman ölçeğinde karşı ters ekseni kullanmaktadır. Bu programlar, bütün gerçek zamanlı bir analiz hücre deney süresi boyunca-p-değerleri tespit edilmesini sağlar ve bu nedenle daha detaylı bir istatistiksel analiz için zaman noktalarının seçimi oldukça kolaylaşmıştır. Programları hakkında ayrıntılı bilgi için ek malzeme bakın.
5. Belirli zaman noktalarında farklı tedavi koşullarında Hücre Endeksi değerlerindeki farklılıkların istatistiksel analizi için, dışa aktarılan Excel dosyasından ilgili zaman noktalarında seçin Hücre Endeks değerleri. Istatistiksel yazılım kullanarak bir post-hoc testi varyansın tek-yönlü veya iki yönlü analizi (ANOVA) ile seçilen zaman noktaları için Hücre Endeksi değerleri analiz edin.

Sonuçlar

, Serum yoksunluğu, gerçek-zaman hücre analiz sürekli izlenebilir Celi endeksi değerlerine azalmaya yol açar

Nörotoksik uyarıcı hücrelere sunulan teknik ve spesifik nörotoksik uyaran ve testlerde kullanılan hücre türüne bağımlı olan dinamikleri ile gerçek zamanlı olarak takip edilebilir Celi endeksi değerleri bir azalmaya yol açmaktadır. Şekil 2 'de artış göstermektedir SK-N-SH hücreleri bir plato (yeşil hat) ve mahrumi...

Tartışmalar

Geçerli protokol sürekli olarak, etiket içermeyen koşullar altında, nöronal hücre hatlarında bileşiklerin nöro-koruyucu / nörotoksik etkilerini değerlendirmek için ve etkisi dahil ikinci haberici yoluna daha iyi anlamak için, gerçek zamanlı bir analiz hücre yararını sunar.

Sitotoksisite ve hücre çoğalması üzerindeki ilaçların etkilerini incelemek için gerçek zamanlı hücre analiz cihazının programı genel kabul görmüş olsa da, sadece birkaç çalışmalarda ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
xCELLigence  RTCA SP system bundle	ACEA Biosciences	No: 00380601030	Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit
E-plate 96	ACEA Biosciences	No: 05232368001	For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station
SK-N-SH cells	ATCC (in partnership with LGC Standards)	HTB-11	Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8437	Cell culture medium
Fetal bovine serum	Life Technologies	16140-063	Supplements proliferation, but not serum deprivation medium
Tissue culture flask T175	Sarstedt	83.1812.302	For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054	For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks
Scepter 2.0 cell counter	Merck Millipore	PHCC20060	Automated cell counter
Phosphate-buffered saline	Life Technologies	10010-015	For washing the cells
(±)-DOI hydrochloride	Sigma-Aldrich	D101	5-HT2A agonist for cell culture treatment
LY-294002 hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9908	PI3-K inhibitor for cell culture treatment
Lisuride maleate	Tocris Bioscience	4052	Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540	For dissolving LY-294002 and lisuride maleate