Echtzeit-Impedanz-basierte Zellanalyse als Werkzeug, um molekulare Signalwege in Neurotoxizität und Neuroprotektion in einem neuronalen Zelllinie; Delineate

Zusammenfassung

Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.

Zusammenfassung

Viele Gehirn-bedingten Erkrankungen haben den Zelltod in ihrer Pathophysiologie beteiligt. In-vitro-Modellen verbessert, um neuroprotektive oder neurotoxischen Wirkungen von Drogen-und nachgelagerten Wegen beteiligt würde helfen, einen Einblick in die molekularen Mechanismen der Neuroprotektion / Neurotoxizität und Wirkstoffentwicklung könnte potenziell zu erleichtern studieren. Allerdings haben viele der vorhandenen In-vitro-Toxizitätstests wesentliche Einschränkungen - die meisten Neurotoxizität und Neuroprotektion beurteilen an einem einzigen Zeitpunkt, ohne dass sich die Zeit-Verlauf und die Kinetik der Wirkung zu beobachten. Darüber hinaus würde die Möglichkeit, Informationen über nachgeschaltete Signalwege bei der Neuroprotektion in Echtzeit beteiligt sammeln von großer Bedeutung sein. In der aktuellen Protokoll beschreiben wir die Verwendung einer Echtzeit-Impedanz-basierte Zellanalyse neuroprotektive Effekte von Serotonin 2A (5-HT _{2A)-Rezeptor-Agonisten} in einer neuronalen Zelllinie unter markierungsfreie Echtzeit-Condit bestimmenIonen unter Verwendung von Impedanzmessungen. Weiterhin zeigen wir, dass Inhibitoren der Second-Messenger-Pfade können verwendet werden, um Moleküle der in der neuroprotektiven Wirkung beteiligt abzugrenzen. Wir beschreiben auch die Nützlichkeit dieser Technik zur Bestimmung, ob eine Wirkung auf die Zellproliferation trägt zu einer beobachteten neuroprotektive Wirkung. Das System nutzt spezielle mikroPlatten als E-Platten, die alternierend Gold enthalten Mikroelektrodenarrays an der Bodenfläche der Vertiefungen als Zell-Sensoren dienen bezeichnet. Die Impedanz wird durch Auslesen der Anzahl der anhaftenden Zellen, Zelllebensfähigkeit, Morphologie und Adhäsion modifiziert. Ein dimensionsloser Parameter genannt Zellenindex wird aus den elektrischen Impedanzmessungen abgeleitet und wird verwendet, um den Zellstatus repräsentieren. Insgesamt ermöglicht die Echtzeit-Impedanz-basierten Zell-Analysator für Echtzeit-, markierungsfreie Beurteilung der Neuroprotektion und Neurotoxizität, und die Bewertung der zweiten Messenger-Pfade Beteiligung, einen Beitrag zu mehrdetaillierte und hohem Durchsatz Beurteilung potenzieller neuroprotektive Verbindungen in vitro, zum Auswählen therapeutischen Kandidaten.

Einleitung

Neuronale Zelltod spielt eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie von zahlreichen Gehirn ^1-bedingten Erkrankungen. Die Verfügbarkeit von zuverlässigen und Hochdurchsatz in vitro Toxizitätstests ist entscheidend, um einen besseren Einblick in die Mechanismen der Neurotoxizität zu gewinnen und zu helfen, wählen Sie neuroprotektive Moleküle als therapeutische Kandidaten in der Medikamentenentwicklung ^2. Allerdings gibt es viele Einschränkungen am häufigsten in vitro Neurotoxizität assays.They verwendet beurteilen Neurotoxizität / Neuroprotektion zu einem einzigen Zeitpunkt Punkt nicht erlaubt kinetische Auflösung; oft Etikett oder Sonde, die mit den Signalwegen stören können und weitere Studien in der gleichen Zellpopulation zu begrenzen, und sind oft arbeitsintensiv, und in vielen Fällen nicht bieten Einblick in den Mechanismus. In der vorliegenden Studie zeigen wir, den Nutzen eines Echtzeit-Impedanz-basierte Zellanalyse zu Neurotoxizität und Neuroprotektion in einer neuronalen Zelllinie in Echtzeit und unter bestimmen markierungsfreieBedingungen und um einen Einblick in nachgeschalteten Mechanismen, durch Analyse der sekundären Botenwege in der Wirkung beteiligt ist.

Frühere Studien haben die Wirksamkeit der Echtzeit-Zellanalyse bestätigt Zytotoxizität sowie Effekte auf die Zellproliferation in Zelllinien im Vergleich zu Standardtechniken ^3,4,5,6 bestimmen. Zum Beispiel wurde eine gute Korrelation zwischen den Ablesungen der Standardzelle Lebensfähigkeit WST-1-Assay und Zellindexwerte zu verschiedenen Zeitpunkten unter basalen Bedingungen und Proliferation nach zwei verschiedenen toxischen Paradigmen in HeLa-Zellen ³ beobachtet. A549 und MDA-MB-231-Zellen-Proliferation und Zytotoxizität der Mikrotubuli-Stabilisator Paclitaxel provoziert zeigten sehr ähnliche Werte, wenn sie von Zellenindex-Messungen bewertet und zur standard Sulforhodamin B (SRB) Test ^4. In der neuronalen Zelllinie verewigt Neuronen im Hippocampus wurden HT-22 Zellindex-Messungen für ihre Fähigkeit t validierto detect Zellproliferation, Glutamat-Cytotoxizität und Zellschutz gegen die verbreiteten 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazoliumbromid-(MTT)-Assay ^5. In der gleichen Studie die MTT-Test Ergebnisse und Zellindex-Messungen auch gut in der Messung der neuronalen Vorläuferzellen Proliferation, Zytotoxizität nach Wachstumsfaktoren Not und Rettung der Zytotoxizität von der Pan-Caspase-Inhibitor QVD ⁵ korreliert. Zytotoxizität in NIH 3T3-Zellen durch Vandetanib (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor-Rezeptor und den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Inhibitor) induziert zeigte mit Zellenindex-Werte oder Neutralrot-Aufnahmetest gemessen ⁶ ähnliche Ergebnisse.

Wir haben vor kurzem verwendet das Echtzeit-Zellanalysesystems neuroprotektiven Wirkungen des Serotonin-2A beurteilen (5-HT _{2A)-Rezeptor-Agonisten} (±) -2,5-Dimethoxy-4-iodoamphetamine Hydrochlorid (DOI) in einer neuronalen Zelllinie ( SK-N-SH-Zellen) und für die Einbeziehung seco gescreentnd messenger Wege durch Überwachen der Wirkung der chemischen Hemmung der beobachteten Neuroprotektion ^7. Interessanterweise hat der 5-HT _2A-Rezeptor sowohl halluzinogene und nonhallucinogenic Agonisten (wie DOI und Lisurid, beziehungsweise), die sowohl gemeinsame als auch unterschiedliche Second-Messenger-Signalwege aktivieren kann ^8.

Die Vorteile der vorgestellten Technik sind, dass sie es ermöglicht, Informationen in Echtzeit auf das Überleben der Zellen im Laufe der Tage zu sammeln, zu beschreiben zweiten Botenwegen beteiligt, um den möglichen Beitrag der Proliferation Effekte auf die Neuroprotektion zu bewerten und eine optimale Zeit wählen für zusätzliche Endpunktstudien auf der gleichen Zellpopulation. Eine schematische Darstellung des Arbeitsablaufs in der Protokoll ist in 1 dargestellt.

Protokoll

1. Vorbereitung

1. Zeigen Station des Echtzeit-Zellanalysegeräts in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO _2. Führen Sie alle Zellkultur Handhabung und pharmakologische Behandlungen in einer Gewebekultur Haube unter sterilen Bedingungen.
2. HINWEIS: Neuronale Zelllinien im Vergleich zu Standardbedingungen für die Kultur, die unterschiedliche Temperatureinstellungen, sollte entsprechend angepasst werden. Für schwach adhärenten Zelllinien verwenden Überzugsmittel, um die Wechselwirkung von Zellen mit der Goldmikroelektroden in den Boden der Vertiefungen der E-Platte 96 zu erleichtern.
3. Bereiten 1,000X Stammlösungen der pharmakologischen Verbindungen für die Zellkultur-Behandlung (neuroprotektive Mittel oder Second-Messenger-Wege-Inhibitoren in dem entsprechenden Lösungsmittel - Dimethylsulfoxid oder sterilem Wasser) und im Kühlschrank bei -20 ° C. Verwenden Sie in den folgenden Behandlungen das Lösungsmittel als Fahrzeug.
4. Kultur menschlicher Neuroblastomzellen SK-N-SH-Zellen in DMEM / F12-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Proliferationsmedium) in Zellkulturflaschen, ergänzt mit 175 cm ² Oberfläche, um die Dichte von ca. 75%. Halten Zellpassage Zahl in einem Bereich (von etwa 10 Passagen), um die Konsistenz zwischen den Experimenten in Bezug auf Zellproliferationsrate und das Ansprechen auf die Zytotoxizität zu bestimmen. Niedergang Nummern werden bevorzugt.
5. Mit PBS waschen Die adhärenten SK-N-SH-Zellschicht und trypsinize mit 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung für 5 min bei 37 ° C. Zentrifugation der Zellen bei 170 × g für 5 min auf Trypsin zu entfernen. Resuspendieren der Zellen in 10 ml Medium Proliferation. Zählen Sie die Zellen mit Scepter Zellzähler und stellen Sie die Zellzahl auf 300.000 Zellen / ml durch Verdünnung Zellen mit Proliferationsmedium.

2. Überzug und die Proliferation von SK-N-SH-Zellen

1. 100 l Proliferationsmedium in jede Vertiefung der E-Plate 96 und lassen Sie es für 30 Minuten in der Gewebekultur Haube bei RT ins Gleichgewicht. Legen Sie die E-PlaTE 96 in der Echtzeit-Zellanalysestation in dem CO _2-Inkubator bei 37 ° C aufweist.
2. Starten des Echtzeit-Zellanalysesoftware. Auf der Seite Layout auswählen die Brunnen im Experiment enthalten und geben Sie in die Eingabefelder die Informationen über Zelltyp, Zellzahl, Namen und Konzentrationen von chemischen Verbindungen für die Zellbehandlung eingesetzt.
   HINWEIS: Für die Zwecke dieses Protokolls mindestens 4 Wiederholungsversuche für jede Behandlung empfohlen.
3. Auf dem Spielplan Software Seite bestimmen "Steps" enthalten in dem Experiment, indem Sie die Anzahl der Durchläufe Messzelle Index und das Intervall zwischen den Durchläufen für jeden Schritt. Seit Schritt 1 ist für die Hintergrundmessung vorgegeben, wählen Sie "einen Schritt" und stellen Sie Schritt 2, um die Zelle Index alle 15 min für 96 Stunden messen.
   HINWEIS: Für Behandlungen, in denen Effekte mit schnellen Kinetik zu erwarten sind, eingestellt Sweeps in kürzeren Abständen.
4. Klicken Sie auf Start, um die automatisch vorgegebenen Schritt einzuleiten 1und messen Sie den Hintergrund Impedanz der Medien. Dieser Wert wird automatisch durch die Software an jedem Datenpunkt abgezogen, sobald die Zellen in die Vertiefungen gegeben.
5. Verwenden Sie den zuvor in Schritt 1.5) hergestellten Zellsuspension von 300.000 Zellen / ml in Proliferationsmedium. 30.000 Zellen / Well für die Zelltoxizität / Neuroprotektion Studien und 15.000 Zellen / Well für die Zellproliferation Studien. Nehmen Sie die E-Plate und 100 l Zellsuspension pro Well für die Zelltoxizität / Neuroprotektion Studien und 50 ul Zellsuspension und 50 ul Proliferationsmedium pro Vertiefung für die Zellproliferation Studien. Die Anzahl der Zellen pro Vertiefung plattiert muss für jede Zelllinie empirisch optimiert werden.
6. Vorsichtig schwenken, die E-Plate 96 für noch Plattierung der Zellen. Verlassen Sie die E-Plate 96 für 30 min in der Gewebekultur Haube bei RT, damit sich die Zellen absetzen gleichmäßig auf den Boden der Vertiefungen.
7. Legen Sie die E-Platte 96 in der Echtzeit-Zellanalysestation und starten Sie Schritt 2 auf dem Spielplan S.Alter. Überwachungszelle Indexwerte während des Experiments, indem Sie die Zelle Kurven auf der Profilseite und der Ausgangszell Index-Daten auf dem Handy Index Seite der Software.

3. Serumentzug

1. 24 Stunden nach dem Ausstreichen der Zellen, Pause das Experiment, und entfernen Sie die E-Plate 96 von der Echtzeit-Zellanalysestation. Verdünnen second messenger-Inhibitoren aus 1,000X Aktien mit DMEM / F12 Serum-freien Medium - bis 200 × Endkonzentration. Gönnen Zellen mit 1 ul Inhibitoren der zweiten Botenwege, um für ihre Beteiligung an der Neurotoxizität / Neuroprotektion 30 min vor Beginn der Zytotoxizität getestet werden, um die jeweiligen Signalwege hemmen. Bringen Sie die E-Plate 96 bis zum Bahnhof und wieder experimentelle Zellindex-Messungen.
2. Nach 30 Minuten Pause, das Experiment wieder. Proliferationsmedium sorgfältig vollständig zu entfernen aus der E-Plate 96 Brunnen mit einer Pipette (oder Multi-Kanal-Pipette), kümmert sich nicht um die adhärenten Zellschicht störenindem der Rand der Pipettenspitze an der Ecke des Bohrloches. Nach Zugabe von 200 ul / Vertiefung serumfreies DMEM / F12-Medium (Medium Serumentzug). Sicherzustellen, schnellen Austausch von Zellkulturmedium zur mechanischen Bewegung der Zellen zu minimieren.
3. Verdünnen Verbindungen auf ihre neuroprotektive Wirkung von 1,000X Lager mit Serum-freiem DMEM / F12-Medium und 200 × Endkonzentration getestet werden. 1 ul Verbindungen auf ihre neuroprotektive Wirkung und 1 ul Inhibitoren der Second-Messenger-Pfade in den einzelnen Vertiefungen nach dem Versuchsplan getestet werden.
4. In Zellen, die für die Proliferation Studien Medium nicht zu ändern. Verdünnen Verbindungen von 1,000X Lager auf 200 × Endkonzentration in Proliferationsmedium getestet werden, behandeln mit 1 ul pro Well und weiter zu Kultur in Proliferationsmedium.
5. Wieder aufnehmen, das Experiment mit Zellindex-Messungen alle 15 min für 96 Stunden weiter wie vorher eingestellt wurde.

4. Daten Analyse

1. Für Neurotoxizität / Neuroprotektion Daten normalisieren Zell Index bis zum letzten Zeitpunkt vor pharmakologische Behandlung oder mittlere Veränderung der Variation zwischen den Experimenten durch Auswahl von "normalisierten Zell Index" auf der Profilseite zu reduzieren und "normalisieren Zeit".
2. Markieren Sie die Brunnen auf dem Grundstück Seite für den Versuchsbedingungen von Interesse und klicken Sie auf "Hinzufügen", um die normierten Zell Index-Kurven zeichnen. Beobachten der Kinetik der neurotoxischen / neuroprotektive Wirkung oder der zweiten Boten-Hemmung als normierte Zellenindex-Kurven als eine Funktion der Zeit.
3. Beachten Sie die Zellenindex-Kurven für die getesteten medikamentöse Behandlungen in Proliferationsmedium als Funktion der Zeit zu beurteilen, ob ein Effekt auf die Proliferation in der neuroprotektive / neurotoxische Wirkung beteiligt.
4. Exportieren Sie die Informationen für alle experimentellen Zell Index Zeitpunkten aus der Zelle Index Software Seite in eine Excel-Datei, um die statistische Auswertung der Ergebnisse zu initiieren
   Hinweis: Als ein erster Schritt in der statistischen Analyse eine Reihe von MATLAB-Programme geändert, dass die Welch-t-Test zu verwenden, mit dem p-Wert aufgetragen halblogarithmisch, nutzen umgekehrte Achse gegen die Zeitskala (als Zusatzcode-Dateien zur Verfügung gestellt). Diese Programme erlauben, den p-Werte über den Zeitverlauf eines gesamten Echtzeit-Zellanalyseexperiment und somit helfen die Auswahl der Zeitpunkte für weitere detaillierte statistische Analyse. Siehe die Zusatzmaterial für die detaillierte Informationen zu den Programmen.
5. Für die statistische Analyse der Unterschiede in der Zellindexwerte unter verschiedenen Behandlungsbedingungen zu bestimmten Zeitpunkten, markieren Sie die Zelle Indexwerte an den jeweiligen Zeitpunkten aus der exportierten Excel-Datei. Analysieren Sie die Handy-Index-Werte für die ausgewählten Zeitpunkten mit One-Way-oder Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von einer post-hoc-Test unter Verwendung statistischer Software.

Ergebnisse

Serumentzug führt zu einer Zellenindex-Werte, die ständig mit dem Echtzeit-Zellanalysegerät überwacht werden kann, zu verringern

Neuro Stimuli zu den Zellen zu einer Abnahme in der Zell-Index-Werte, die in Echtzeit mit den vorgestellte Technik und die Dynamik der abhängig ist von der spezifischen neuro Stimulus und dem Zelltyp sucht überwacht werden können. Abbildung 2 zeigt die Zunahme der Zell Index bei SK-N-SH-Zellen in Proliferationsmedium b...

Diskussion

Das aktuelle Protokoll stellt den Nutzen eines Echtzeit-Zellanalyse kontinuierlich und unter Label-freien Bedingungen bewerten die neuroprotektive / neurotoxischen Wirkungen von Verbindungen in neuronalen Zelllinien und einen Einblick in die Second-Messenger-Signalwege in der Wirkung beteiligt zu gewinnen.

Obwohl Dienstprogramm des Echtzeit-Zellanalysegerät zur Zytotoxizität und Wirkungen von Arzneimitteln auf die Zellproliferation zu untersuchen ist allgemein bekannt, haben nur wenige Stu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
xCELLigence  RTCA SP system bundle	ACEA Biosciences	No: 00380601030	Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit
E-plate 96	ACEA Biosciences	No: 05232368001	For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station
SK-N-SH cells	ATCC (in partnership with LGC Standards)	HTB-11	Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8437	Cell culture medium
Fetal bovine serum	Life Technologies	16140-063	Supplements proliferation, but not serum deprivation medium
Tissue culture flask T175	Sarstedt	83.1812.302	For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054	For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks
Scepter 2.0 cell counter	Merck Millipore	PHCC20060	Automated cell counter
Phosphate-buffered saline	Life Technologies	10010-015	For washing the cells
(±)-DOI hydrochloride	Sigma-Aldrich	D101	5-HT2A agonist for cell culture treatment
LY-294002 hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9908	PI3-K inhibitor for cell culture treatment
Lisuride maleate	Tocris Bioscience	4052	Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540	For dissolving LY-294002 and lisuride maleate