Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن هنا وصف وسيلة فعالة لعزل، وتحديد، وتنقية الخلايا الظهارية الماوس الغدة الصعترية (TECS). ويمكن استخدام بروتوكول للدراسات وظيفة الغدة الصعترية التطور الطبيعي للخلايا T، خلل الغدة الصعترية، وإعادة الخلايا التائية.

Abstract

الغدة الصعترية هي جهاز حيوي لتنمية الخلايا اللمفاوية T. خلايا انسجة الغدة الصعترية، الغدة الصعترية الخلايا الظهارية (TECS) هي الحاسمة ولا سيما في مراحل متعددة من تطوير خلايا T: التزام الخلايا T، واختيار الإيجابية والسلبية الاختيار. ومع ذلك، يبقى فهم وظيفة TECS في الغدة الصعترية غير كامل. في المقالة، ونحن نقدم طريقة لعزل مجموعات فرعية من المجلس التنفيذي الانتقالي الغدة الصعترية الماوس جديدة باستخدام مزيج من اضطراب الميكانيكية والهضم الأنزيمي. طريقة تمكن خلايا انسجة الغدة الصعترية وthymocytes أن أفرجت كفاءة من خلية خلية والاتصالات مصفوفة خارج الخلية وخلايا لتشكيل تعليق خلية واحدة. باستخدام الخلايا المعزولة، multiparameter التدفق الخلوي يمكن تطبيقها على تحديد وتوصيف TECS والخلايا الجذعية. لأن TECS هي السكان الخلية نادر في الغدة الصعترية، ونحن أيضا وصف وسيلة فعالة لإثراء وتنقية TECS بواسطة المستنفدة thymocytes، نوع من الخلايا الأكثر وفرة في الغدة الصعترية. فولوجناح التخصيب خلية فرز الوقت يمكن انخفضت حتى يمكن التقليل من تلك الخسارة من بقاء الخلية خلال تنقية TECS. تنقية الخلايا هي مناسبة لمختلف التحليلات المصب مثل الوقت الحقيقي-PCR، لطخة غربية والتنميط التعبير الجيني. سوف بروتوكول تعزيز البحوث المتعلقة بالوظيفة TEC وكذلك تطوير في المختبر إعادة الخلايا التائية.

Introduction

في تطور الخلايا T في وقت مبكر، يتم تجنيد نخاع العظام الجذعية المكونة للدم المشتقة من خلية الأسلاف متعدد القدرات لقشرة الغدة الصعترية، والخضوع الالتزام T النسب وتصبح الخلايا التائية السلائف 1. في القشرة، T خلايا CD4 و CD8 السلائف النفي المزدوج (DN) thymocytes توسيع وتفرق في غير ناضج CD4 و CD8 إيجابية المزدوج (DP) thymocytes، وتشكيل مجموعة كبيرة من الأسلاف مع T متغير بدرجة كبيرة مستقبلات الخلايا 1. فقط اختر فرعية MHC المقيدة الخلايا موانئ دبي ستصبح CD4 أو CD8 إيجابية احد (SP) thymocytes، الهجرة إلى النخاع من الغدة الصعترية، وتفرق في الخلايا T الناضجة المختصة وظيفيا، وهو الحدث الذي يشار إليه اختيار إيجابية 2- 6. في المقابل، استنساخ thymocytes لصناعة السيارات في رد الفعل السلبية والخضوع الاختيار تتم إزالة عن طريق موت الخلايا المبرمج، وتحويلها إلى خلايا T التنظيمية للتسامح الذاتي، أو تحويلها إلى الخلايا الليمفاوية داخل الظهاري لأغراض غير واضحة بعد 3،7-10.

في الغدة الصعترية، خلايا انسجة الغدة الصعترية تشكل المكروية فريدة توفير إشارات لهذه مصائر مختلف T تطوير خلية 5،11،12. وتتكون خلايا انسجة الغدة الصعترية من الخلايا الظهارية الغدة الصعترية (TECS) - بما في ذلك TECS القشرية (cTECs) وTECS النخاع (mTECs)، والخلايا الجذعية، الضامة، الخلايا الليفية، الخلايا البطانية، pericytes المستمدة قمة العصبية والخلايا الوسيطة الأخرى 13-15. من بين هؤلاء، TECS حاسمة في مراحل مختلفة من تطوير خلايا T 1،2،16،17. ومع ذلك، عدم وجود وسيلة قوية لعزل TECS أعاق فهم شامل لمهامهم 16. على وجه الخصوص، cTECs، والتي تشكل شبكة ثلاثية الأبعاد المحيطة بها الأسلاف في القشرة، ضرورية لاختيار إيجابية 13،18،19 لأسباب غير واضحة حتى الان. قدمت دراسات سابقة أدلة إلى عدم التجانس ودور TECS، وتعتمد في الغالب على الأدوات الشكلية والنسيجية 13 . مؤخرا تم تناول أدوار فريدة من مجموعات فرعية من قبل المجلس التنفيذي الانتقالي النهج الوراثية في نماذج الماوس 12،20. وهناك طريقة قوية وقابلة للتكرار لعزل TECS أمر أساسي لتحقيق توصيف غير متحيز من مجموعات فرعية TEC، التقييم الكمي والنوعي للوظائف TEC، وتوضيح آليات دعم cTECs كيفية اختيار إيجابية.

نظرا لندرة TECS في الغدة الصعترية والتفاعلات ضيقة أنها تشكل في الجهاز سليمة، وقد تم عزل TECS تحديا. ويستند بروتوكول الموصوفة هنا على الاكتشافات السابقة، الكواشف المتاحة حاليا، والتقنيات، ومعرفة هيكل وتكوين انسجة الغدة الصعترية. منذ ما يقرب من عقدين من الزمن، تم الإبلاغ عن عدة إجراءات لتفصيل أنسجة الغدة الصعترية 21-27، والتي كانت تستخدم أنزيمات مختلفة أثناء عملية الهضم، بما في ذلك التربسين، كولاجيناز وDispase. الرمادي وآخرون. مقارنة تلك الانزيمات في precedure من 28 عاما، وذكرت تحسن المنهجياتالتطوير التنظيمي مع الهضم متعددة الخطوات من الكوكتيلات انزيم 29 التي أصبحت تستخدم على نطاق واسع 20،30. ومع ذلك، هذا الأسلوب ينطوي على الوقت اللازم لإعداد طويل وخطوات عملية الهضم المعقدة والنتائج في أعداد الخلايا ونسب TECS متغير نهائي حتى في نفس الفوج الفئران 29،30. قبل عدة سنوات، Liberase انزيم الصف البحوث، والتي تحتوي على تنقية عالية كولاجيناز والتي البروتيني محايد لاستخدامها في أنسجة الغدة الصعترية التفكك 30. هنا، نحن تصف القائمة على بروتوكول الهضم Liberase، مع إجراءات الفصل الميكانيكي الأمثل، ويمكن أن ينتج عددا كبيرا من TECS قابلة للحياة من الأنسجة الماوس الغدة الصعترية. .

لإثراء خلايا انسجة فصلها، استخدمت الدراسات السابقة إما التدرجات كثافة المغناطيسي أو حبة فصل 21،29. ومع ذلك، كل الطرق تؤدي شديدة فقدت السكان معين من خلايا انسجة الغدة الصعترية، وخاصة سكان cTECs 29. القضاء السامة للخلايا والتقنيات بالغسل 31،32 وقد استخدمت على نطاق واسع للنضوب أو فصل الخلايا الليمفاوية في مجال المناعية 12،31. بعد المقارنة بين هذه التقنيات، أنشأنا بروتوكول بالغسل الحالي للتخصيب TECS. الشرط طيف أثناء إجراء تخصيب يؤدي إلى موت الخلايا أقل وغير متحيزة وزيادة الانتعاش TEC.

تعليق خلية الغدة الصعترية معزولة وصفها في القسم 3 يمكن تطبيقها مباشرة في التدفق تحليل cytometric لتحديد وتوصيف فرعية TEC والخلايا الجذعية. يصف القسم 4 طريقة بسيطة ومفيدة لتحديد مجموعات فرعية المجلس التنفيذي الانتقالي باستخدام تدفق عداد الكريات multiparameter. يمكن للتجارب التي تسعى للحصول على cTECs تنقيته أو mTECs، والإثراء TEC وخلية فرز الإجراءات يمكن العثور عليها في القسم 5 و 6.

Protocol

في هذه الدراسة، والكبار - استخدمت (6 8 أسابيع) أنثى C57BL / 6 الفئران. تم شراء الفئران من المعهد الوطني للسرطان والحفاظ عليها في ظل ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض. وافقت جامعة جنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي مينيسوتا (IACUC) جميع التجارب على الحيوانات.

1. إعداد أدوات والمخازن

  1. تحضير محلول أنزيم (RPMI1640 المتوسطة مع 0.05٪ [ث / ت] من Liberase TH و 100 U / مل من الدناز I)، عازلة الألبومين الغني (1X PBS [كا 2+ / المغنيسيوم 2+ خالية] مع 0.5٪ المصل البقري الزلال و 2 ملي حمض الإيثيلنديامين Tetraacetic [EDTA])، FACS العازلة (1X PBS [كا 2+ / المغنيسيوم 2+ خالية] يحتوي على 1٪ مصل بقري جنيني [FBS] و 0.02٪ نان 3)، FACS فرز عازلة (1X PBS [كا 2+ / المغنيسيوم 2+ خالية] تحتوي على 2٪ FBS)، وRP10 المتوسطة (متوسطة RPMI-1640 توفيره مع 10٪ FBS).
  2. إعداد لوحات 10 بالغسل. تحضير 40 مل من محلول طلاء (0.01 ملغ / مل Gالشوفان مكافحة فأر مفتش في 0.1 M NaHCO 3 العازلة)، وإضافة 4 مل من محلول طلاء في كل 100 × 15 مم لوحة، دوامة واحتضان عند 4 درجات CO / N. تخلصي حل الأجسام المضادة وشطف لوحة باستخدام 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X لمدة 2 مرات، دوامة بقوة بين يشطف. تخزين مستعدة لوحات في 4 درجة مئوية.

2. حصاد الأنسجة الغدة الصعترية

  1. الموت ببطء الماوس في غرفة CO 2. وضع الحيوان على ظهره على حصيرة تشريح، دبوس القدمين على حصيرة والرطب الفراء عن طريق الرش مع الايثانول 70٪.
  2. جعل شق خط الوسط من خلال الجلد، بدءا من فوق فتح مجرى البول مباشرة الى الفك السفلي مع مقص وتوسيع شق أسفل إلى الركبتين على كلا الجانبين. شق يشبه رأسا على عقب "Y". سحب الجلد فضفاضة مرة أخرى على الجانبين، ويعلقون عليه إلى حصيرة تشريح.
  3. ثقب الحجاب الحاجز من الخنجري، وقطع أضلاعه على كل جانب تصل إلى نحو الترقوة، ثم رفع الأضلاع معملقط ويعلقون عليه إلى حصيرة تشريح. الغدة الصعترية هي فقط تحت الأضلاع، وتبدو مثل اثنين من فصوص بيضاء رقيقة تغمر القلب (الشكل 1). النسيج الضام المحيطة بفصل الغدة الصعترية، وسحب بلطف وإزالة زوج من فصوص الغدة الصعترية مع ملقط مسنن منحنية. مكان فصوص الغدة الصعترية في لوحة 6 جيدا تحتوي على 5 مل RPMI-1640.

3. إعداد خلايا التوتة اللحمية

  1. تقليم أي الأنسجة الدهنية والضامة المحيطة ونقل فصوص الغدة الصعترية لبئر جديد للوحة 6 جيدا تحتوي على 5 مل يعد حديثا حل الانزيم. جعل شقوق صغيرة في الفص الصعترية مع مقص غرامة، واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  2. ماصة بلطف هضم الغدة الصعترية تصل الأنسجة وهبوطا 2 - 3 مرات باستخدام 5 مل ماصة للتفكك الأنسجة. جمع جزء طاف في أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل الباردة العازلة الزلال الغنية لتحييد الانزيمات. الحفاظ على أنبوب جمع على الجليد. إضافة 2.5مل من محلول الإنزيم إلى الأنسجة المتبقية واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  3. أداء الانفعالات الميكانيكية لطيف مع حقنة 3 مل و 18 إبرة G لتفريق المجاميع. تجمع طاف في أنبوب جمع. إضافة 2.5 مل حل انزيم إلى الأنسجة المتبقية واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. تكرار الإثارة الميكانيكية لطيف مع حقنة 3 مل و 25 إبرة G، واحتضان لوحة إضافي من 5 - 10 دقيقة.
  5. بعد الهضم الكامل، بركة طاف في أنبوب جمع. الطرد المركزي أنبوب جمع في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 8 دقائق لجمع الخلايا. نضح السائل وتعليق الخلايا مكعبات في 10 مل الألبومين الغنية العازلة وتصفية العينة 100 مم من خلال شبكة. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. ثم نفذ تحليل تدفق cytometic (القسم 4) أو TECS تخصيب (القسم 5).

4. تحديد TECS بواسطة التدفق الخلوي

  1. إعداد الخلايا لتركيز النهائي من 4 × 10 6 خلايا في 100 ميكرولتر في المخزن FACS لتلطيخ في 96 ذهابا وأسفل جيدا لوحة الاختبار والحفاظ على لوحة على الجليد. إضافة 20 ميكرولتر التيسير حل كتلة (مكافحة CD16 / CD32 الأجسام المضادة في 10 ميكروغرام / مل في المخزن FACS) إلى الخلايا واحتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة على الجليد. تدور لوحة في 400 x ج، 4 ° C لمدة 3 دقائق. تجاهل السائل من الآبار بواسطة عبها لوحة جهه لأسفل في الحوض.
  2. تعليق الخلايا مكعبات في 100 ميكرولتر كوكتيل الأجسام المضادة (مكافحة CD45، -EpCAM، -MHC الدرجة الثانية، و-Ly51 الأجسام المضادة، وكتين UEA-1 المسمى مع fluorochromes مختلفة في الشركة المصنعة أوصى أو اختبار تركيزات المثلى من كل الأجسام المضادة في المخزن FACS )، واحتضان الخلايا على الجليد لمدة 20 دقيقة في الظلام. للتعويض، وصمة عار 1 × 10 6 خلايا تألقي مع كل فرد.
  3. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة FACS إلى كل بئر وتدور لوحة في 400 x ج، 4 ° C لمدة 3 دقائق. كرر الخطوة غسل واحدالوقت، وresuspend ثم الخلايا في 100 ميكرولتر FACS العازلة. نقل الخلايا إلى 12 × 15 مم الجولة القاع أنبوب FACS مليئة 300 ميكرولتر FACS العازلة. الحصول على العينات على تدفق عداد الكريات وتحليل البيانات باستخدام برامج التحليل FACS. يظهر استراتيجية النابضة المجلس التنفيذي الانتقالي في الشكل 2.

5. إثراء TECS بواسطة بالغسل

  1. تدور باستمرار خلايا الغدة الصعترية (المعد في القسم 3) في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح السائل وتعليق الخلايا مكعبات في FACS عازلة فرز بتركيز 2 × 10 8 خلايا لكل مل في 15 مل أو 50 مل أنبوب مخروطي. إضافة الأضداد المضادة للCD90.2 (استنساخ 30-H12) (أو مكافحة CD45) في تركيز النهائي من 2.5 ميكروغرام / مل من تعليق خلية واحتضان خلايا بلطف على خلاط الدورية في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، ويغسل مع 5 - حجم 10X من RP10 المتوسط ​​وأنبوب الطرد المركزي في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. نضح السائل وresuspend الخلايا مكعبات فيRP10 المتوسطة بتركيز 1 × 10 7 لكل مل. إضافة 5 مل تعليق خلية إلى كل لوحة المغلفة بالغسل (المعد في الخطوة 1.3)، دوامة واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. دوامة بقوة. نقل supernatants في أنبوب مخروطي. شطف لوحة مرتين باستخدام RP10 المتوسطة وتجميع supernatants في أنبوب جمع.
  3. أجهزة الطرد المركزي أنبوب جمع في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح السائل وresuspend الخلايا مكعبات في 5 مل RP10 المتوسطة. إضافة تعليق الخلية إلى لوحة بالغسل جديدة، دوامة واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. جمع الخلايا شطف لوحة وبركة لهم في أنبوب مخروطي. مرة واحدة يتم إثراء TECS، وتدور أسفل الخلايا في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتعليق الخلايا في 5 مل FACS فرز العازلة.

6. تنقية TECS بواسطة الفرز الخلية

  1. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وإعداد تعليق الخلية بتركيز 4 × 10 7 الخلايا في عازلة FACS الفرز. إضافة الأجسام المضادة ديcribed في القسم 4.4 إلى حل الخلية واحتضان خلايا بلطف على خلاط الدورية في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد تلطيخ، وغسل وتعليق الخلايا إلى تركيز 10 × 10 6 خلايا لكل مل من FACS العازلة الفرز.
  2. ترتيب مجموعات فرعية المجلس التنفيذي الانتقالي من خلال فوهة 100 ميكرومتر باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز. يتم جمع الخلايا مرتبة في 30٪ (V / V) FBS في RPMI-1640). مرة واحدة يتم فرز الخلايا، والخلايا الطرد المركزي في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والتحضير لتحليل المصب.

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول، تمت إزالة جهاز الغدة الصعترية من الماوس الكبار (القسم 2) وتعليق خلية الغدة الصعترية تم إعداده على النحو المبين في القسم 3. تألف تعليق الخلية التي تم الحصول عليها من thymocytes، وخلايا انسجة المكونة للدم والمشتقة من خلايا انسجة غير المكونة للدم. يتم...

Discussion

في البروتوكول، الخطوات الحاسمة هي إعداد خلايا انسجة الغدة الصعترية (القسم 3) وإثراء TECS (القسم 4). ويوصى بشدة أن يتم تحضير محلول أنزيم جديد في كل مرة ويتم التعامل مع الأنسجة في أقرب وقت ممكن. لالتوتة المجمعة، وتحسين حجم محلول أنزيم مطلوب تبعا لعدد من التوتة. إذا تم ترك أي ...

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 AI088209 (إلى KAH). كما نشكر جامعة مينيسوتا التدفق الخلوي الموارد.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-mouse EpCAMeBioscienceXX-5791-YY*Clone G8.8
Anti-mouse MHC IIeBioscienceXX-5321-YY*Clone M5/114.15.2
Anti-mouse Ly51eBioscienceXX-5891-YY*Clone 6C3
UEA-1Vector LaboratoryFL-1061
Flow cytometerBD Biosciences LSRFortessa
Flow cell sorterBD Biosciences FACSAria
FACS tubesBD Biosciences352052
Flow cytometry analysis softwareTreeStar - FlowjoFlowJo v7/9
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

References

  1. Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
  2. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
  3. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).
  4. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
  5. Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8. T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).
  6. Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes. Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).
  7. Benoist, C., Mathis, D. Treg cells, life history, and diversity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).
  8. Pobezinsky, L. A., et al. Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection. Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).
  9. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).
  10. Xing, Y., Hogquist, K. A. T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).
  11. Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).
  12. Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).
  13. Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).
  14. Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development. Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).
  15. Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).
  16. Griffith, A. V., et al. Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation. Immunit. 31, 999-1009 (2009).
  17. Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).
  18. Hogquist, K. A., Xing, Y. Why CD8+ T cells need diversity when growing up. Immunit. 32, 5-6 (2010).
  19. Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc. J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).
  20. Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316, 1349-1353 (2007).
  21. Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection. Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).
  22. Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells. Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).
  23. Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).
  24. Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells. Nat. Med. 6, 56-61 (2000).
  25. Shortman, K., Vremec, D., D'Amico, A., Battye, F., Boyd, R. Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes. Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).
  26. Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen. J. Immunol. 158, 693-706 (1997).
  27. Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110. J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).
  28. Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).
  29. Gray, D. H., et al. Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells. J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).
  30. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).
  31. Kanof, M. E. Purification of T cell subpopulations. Curr. Protoc. Immunol. 7 (Unit 7.3), (2001).
  32. Mage, M. G. Fractionation of T cells and B cells using panning techniques. Curr. Protoc. Immunol. 3 (Unit 3.5), (1991).
  33. Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization. The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).
  34. Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells. J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).
  35. Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).
  36. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).
  37. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

90 T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved