Выделение, идентификация, и очистка мышиного тимуса эпителиальных клеток

Резюме

Здесь мы опишем эффективный метод изоляции, идентификации и очистки мыши тимуса эпителиальных клеток (ТИК). Протокол может быть использован для изучения функции тимуса для нормального развития Т-клеток тимуса, дисфункции и восстановления Т-клеток.

Аннотация

Тимус является жизненно важным органом для развития Т-лимфоцитов. Из тимуса стромальных клеток, тимуса эпителиальные клетки (ТИК) имеют особенно важное значение в нескольких этапах развития Т-клеток: Обязательство Т-клеток, положительно отбора и отрицательного отбора. Тем не менее, функция ТИК в тимусе остается полностью поняты. В статье, мы предлагаем способ, чтобы изолировать TEC подмножества из свежего тимуса мыши, используя комбинацию механического разрушения и ферментативного расщепления. Метод позволяет тимуса стромальных клеток и тимоцитов, чтобы быть эффективно выпущен из клетка-клетка и матричных соединений клеток с внеклеточным и образуют единую-клеточной суспензии. Использование изолированных клеток, цитометрии потока многопараметрических могут быть применены к идентификации и характеризации ТИК и дендритных клеток. Потому что ТИК являются редким клеточная популяция в тимусе, мы также описать эффективный способ обогатить и очистить ТИК истощая тимоцитов, самый распространенный тип клеток в тимусе. ФоллоКрыло обогащение, сортировки клеток время может быть уменьшено, так что потери жизнеспособности клеток может быть сведено к минимуму во время очистки ТЭМ. Очищенные клетки пригодны для различных последующих анализов, как Real Time-ПЦР, Вестерн-блоттинга и экспрессии генов профилирования. Протокол будет способствовать исследование функции TEC и, а также развитие в пробирке Т-клеток восстановления.

Введение

В начале развития Т-клеток, костного мозга гемопоэтических стволовых клеток, полученных предшественники мультипотентные рекрутируются в коре тимуса, пройти приверженность T линии и стать Т-клеток предшественников ^1. В коре, Т-клеток-предшественников CD4 и CD8 Double Negative (DN) тимоциты расширить и дифференцировать в незрелых CD4 и CD8 двойной положительный (DP) тимоцитов, образуя большой пул предшественников с сильно варьирует Т клеточных рецепторов ^1. Только выберите MHC-ограничено подмножество DP клеток станет CD4 или CD8 сингл положительные (SP) тимоциты, мигрируют в костный мозг тимуса, и дифференцируются в функционально компетентных зрелых Т-клеток, мероприятие, известное, как позитивной селекции ^{2- 6.} В отличие от этого, клоны аутореактивных тимоцитов пройти негативный отбор и удаляются с помощью апоптоза, преобразуется в регуляторных Т-клеток для аутотолерантности, или направлены в внутриэпителиальных лимфоцитов в целях, которые еще ​​не ясно, ^3,7-10.

В тимусе, тимуса стромальных клеток образуют уникальный микросреду, обеспечивающую сигналы для этих различных судеб развития клеток Т ^5,11,12. Стромальные клетки тимуса состоят из эпителиальных клеток тимуса (ТИК) - в том числе коры головного мозга (ТЭМ) и cTECs сердцевинных ТЭМ (mTECs), дендритные клетки, макрофаги, фибробласты, эндотелиальные клетки нервного гребня, полученных перицитов и других мезенхимальных клеток ^13-15. Среди них, ТИК имеют решающее значение на разных этапах T развития клеток ^1,2,16,17. Тем не менее, отсутствие надежной образом, чтобы изолировать ТИК препятствует полное понимание своих функций ^16. В частности, cTECs, которые образуют трехмерную сетку, окружающую клетки-предшественники в коре головного мозга, имеют важное значение для позитивной селекции ^13,18,19 по причинам, которые еще ​​не ясна. Более ранние исследования условии поможет понять, неоднородности и роли ТИК, в основном опираясь на морфологических и гистологических инструментов ¹³ . Недавно уникальные роли ТИК подмножеств обратились генетических подходов в мышиных моделях ^12,20. Надежным и воспроизводимым способом изолировать ТИК является основополагающим для достижения объективную характеристику ТИК подмножеств, количественной и качественной оценки функций избирательных комиссий, и разъяснение механизмов, как cTECs поддерживает положительный выбор.

В связи с редкостью ТИК в тимусе и плотных взаимодействий они образуют в неповрежденной органа, изоляция ТИК был сложным. Протокол, описанный здесь, основаны на предыдущих открытий, имеющихся в настоящее время реагентов, методов и знания о структуре тимуса и стромы состава. Почти два десятилетия назад, было зарегистрировано несколько процедур разбить тимуса ткани ^21-27, на которых были использованы различные ферменты в процессе пищеварения, в том числе трипсина, коллагеназы и диспаза. Серый и др. сравнил эти ферменты в их precedure ^28, и сообщали об улучшении метамфетаминод с многошаговое переваривания ферментов коктейлей ^29, которые стали широко использоваться ^20,30. Тем не менее, этот метод включает в себя много времени на подготовку и сложные шаги пищеварения и приводит к переменной окончательное количество и долю ТИК клеток даже в том же мышиного когорты ^29,30. Несколько лет назад, Liberase исследования сорт фермент, содержащий высокоочищенный коллагеназы и нейтральной протеазы начал использоваться в ткани вилочковой железы диссоциации ^30. Здесь мы описываем Liberase пищеварение основе протокола, с оптимизированными процедурами механического разделения, который дает большое количество жизнеспособных ТИК от мыши тимуса тканей. .

Для обогащения диссоциированных стромальных клеток, предыдущие исследования использовались либо градиентов плотности или магнитной сепарации борта ^21,29. Тем не менее, оба метода приводят к тяжелым потеряли некоторых популяций тимуса стромальных клеток, в частности населения cTECs ^29. Цитотоксическая устранение и панорамирования методы 31,32 были широко использованы для истощения или разделения лимфоцитов в иммунологической области ^12,31. После сравнения этих методов, мы установили текущий протокол панорамирования для обогащения ТИК. Нежное состояние во время процедуры обогащения ведет к меньшему гибели клеток и беспристрастным и повышение уровня возмещения TEC.

Выделенный подвеска тимус клеток описано в разделе 3 могут быть непосредственно применены течь анализ цитометрический для идентификации и характеризации ТИК подмножеств и дендритных клеток. Раздел 4 описывает простой и удобный способ определения TEC подмножества, используя многопараметрическое проточного цитометра. Для экспериментов, которые стремятся получить очищенные cTECs или mTECs, обогащение TEC и сортировки клеток процедуры можно найти в разделе 5 и 6.

протокол

В этом исследовании, взрослых - были использованы (6 8 недель) женщины C57Bl / 6 мышей. Мыши были приобретены у Национального института рака и поддерживается при определенных патогенов условиях. Университет Миннесоты институционального комитета уходу и использованию животных (IACUC) утвердил все экспериментов на животных.

1 Подготовка инструментов и буферов

1. Готовят раствор фермента (RPMI1640 среды с 0,05% [вес / объем] из Liberase TH и 100 ед / мл ДНКазы I), альбумина, богатых буфера (1X PBS [Ca2 ⁺ / Mg ^{2 +} -бесплатный] с 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты [ЭДТА]), FACS буфера (1X PBS, [Ca2 ⁺ / Mg2 ⁺ -бесплатный], содержащий 1% фетальной бычьей сыворотки [ФБС] и 0,02% NaN _3), FACS буфера сортировки (1X PBS, [Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} -бесплатный], содержащий 2% FBS) и RP10 среды (RPMI-1640 поставляется с 10% FBS).
2. Подготовьте 10 панорамирования пластины. Готовят раствор для покрытия 40 мл (0,01 мг / мл Gовса анти-IgG крысы в 0,1 М NaHCO ₃ буфера), и добавить 4 мл раствора для нанесения покрытия в каждом 100 х 15 мм пластины, вихря и инкубируют при 4 ° CO / N. Выливают раствор антитела и промыть пластины с использованием 5 мл 1х PBS в течение 2 раза, вихревой энергично между полосканий. Хранить готовые пластины на 4 ° С.

2 Урожай ткани вилочковой железы

1. Усыпить мышь в CO ₂ камеры. Положите животное на спину на рассечение коврик, придавить ноги на коврик и влажный мех путем распыления с 70% этанола.
2. Сделайте срединный разрез через кожу, начиная сверху отверстие мочеиспускательного канала прямо до нижней челюсти с помощью ножниц и продлить разрез вниз до колен с обеих сторон. Разрез выглядит как перевернутая "Y". Потяните дряблая кожа назад по бокам, и вывод его на рассечение мат.
3. Прокол диафрагму от мечевидного, вырезать ребра с каждой стороны примерно до ключицы, затем поднимите ребра сщипцы и вывод его на рассечение мат. Тимус только под ребра, и выглядит как два тонких белых лепестков вышележащих сердце (рисунок 1). Отключите соединительной ткани, окружающей тимус, осторожно потяните и снимите пару тимуса долях с изогнутыми зубчатыми щипцами. Место тимуса доли в 6-луночного планшета, содержащего 5 мл RPMI-1640.

3 Получение тимуса стромальных клеток

1. Обрезать любой окружающей жира и соединительной ткани и передавать тимуса долей на новую лунку 6-луночного планшета, содержащего 5 мл свежего энзимного раствора подготовки. Сделать небольшие разрезы в тимусе лепестков с тонких ножниц, и инкубируют планшет при 37 ° С в течение 20 мин.
2. Аккуратно пипетки переваривания ткани вилочковой железы вверх и вниз 2 - 3 раза, используя 5 мл пипетки для ткани диссоциации. Собирают фракцию супернатанта в 50 мл пробирку, содержащую 10 мл холодного богатого альбумина буфер для нейтрализации ферментов. Держите пробирку на льду. Добавить 2,5мл раствора фермента к оставшейся ткани и инкубируют планшет при 37 ° С в течение 15 мин.
3. Выполнение нежный механическое перемешивание с помощью шприца 3 мл и 18 G иглу, чтобы разбить агрегаты. Бассейн супернатант в пробирку. Добавить 2,5 мл раствора фермента к оставшейся ткани и инкубируют планшет при 37 ° С в течение 15 мин.
4. Повторите нежный механическое перемешивание с помощью шприца 3 мл и 25 G иглы, и инкубировать пластины дополнительные 5 - 10 мин.
5. После полного переваривания, бассейн супернатант в пробирку. Центрифуга коллекция трубка на 400 мкг, 4 ° С в течение 8 мин до сбора клеток. Аспирируйте жидкости и приостановить осажденные клетки в 10 мл альбумина богатых буфера и фильтруют через образец 100 мм меш. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Затем выполните потока cytometic анализ (раздел 4) или ТИК обогащение (раздел 5).

4 Идентификация ТИК цитометрическим

1. Подготовка клеток в конечной концентрации 4 × 10 ⁶ клеток на 100 мкл в FACS буфере для окрашивания в 96 и круглым дном тестовой пластины и удерживать пластину на льду. Добавить 20 мкл раствора блок-Fc (анти-CD16 / CD32 антитело при 10 мкг / мл в FACS буфере) к клеткам и инкубировали клетки в течение 10 мин на льду. Вращайте пластину при 400 мкг, 4 ° С в течение 3 мин. Откажитесь жидкости из скважин, щелкая пластины лицом вниз в раковину.
2. Приостановить осажденные клетки в 100 мкл коктейля антител (анти-CD45, -EpCAM, -MHC класса II, и -Ly51 антитела, и UEA-1 лектин помечены различными флуорохромами на рекомендованные производителем или проверенные оптимальные концентрации каждого антитела в FACS буфере ), и инкубируют клетки на льду в течение 20 мин в темноте. Для компенсации, окрасить 1 х 10 ⁶ клеток с каждой отдельной флуорохромом.
3. Добавить 100 мкл FACS буфера в каждую лунку и спин пластину при 400 мкг, 4 ° С в течение 3 мин. Повторите мыть Шаг первыйВремя, а затем ресуспендируют клетки в 100 мкл FACS буфера. Перенесите клетки к 12 х 15 мм с круглым дном FACS трубки, заполненной 300 мкл FACS буфера. Приобретать образцы на проточном цитометре и анализировать данные с помощью программного обеспечения FACS анализа. TEC стратегия стробирования показано на рисунке 2.

5 Обогащение ТИК по Панорамирование

1. Спином вниз клетки тимуса (полученного в разделе 3) при 400 мкг, 4 ° С в течение 5 мин. Аспирируйте жидкости и приостановить осажденные клетки в FACS буфере сортировки при концентрации 2 х 10 ⁸ клеток на мл в 15 мл или 50 мл коническую пробирку. Добавить анти-CD90.2-антителом (клон 30-H12) (или анти-CD45) в конечной концентрации 2,5 мкг / мл клеточной суспензии и инкубируют клетки осторожно на вращающемся смесителе при температуре 4 ° С в течение 30 мин. После инкубации промыть с 5 - 10-кратным объемом RP10 среды и центрифугировать пробирку при 400 мкг, 4 ° С в течение 5 мин.
2. Аспирируйте жидкости и ресуспендирования клеток осаждали вRP10 среде при концентрации 1 × 10 ⁷ на мл. Добавить суспензии 5 мл клеток в каждой покрытой пластине (панорамирования, полученного в стадии 1,3), вихря, и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Вихревой энергично; передавать супернатантов в коническую пробирку. Промыть пластины в два раза, используя RP10 среды и объединить супернатантами в пробирку.
3. Центрифуга пробирку при 400 мкг, 4 ° С в течение 5 мин. Аспирируйте жидкости и ресуспендируйте осажденные клетки в 5 мл RP10 среды. Добавить клеточной суспензии на новый панорамирования пластины, вихревой и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре. Собирают клетки промыть пластины и объединить их в конической трубе. После того, как ТЭМ обогащены, спин вниз клетки при 400 мкг, 4 ° С в течение 5 мин и приостановить клеток в 5 мл FACS буфера сортировки.

6 Очистка ТИК по сортировки клеток

1. Количество клеток с использованием гемоцитометра и подготовить суспензии клеток в концентрации 4 х 10 ⁷ клеток в FACS буфере сортировки. Добавить антитела дезcribed в разделе 4.4 в раствор клеток и инкубируют клетки осторожно на вращающемся смесителе при температуре 4 ° С в течение 30 мин. После окрашивания, мыть и приостановить клеток до концентрации 10 × 10 ⁶ клеток на мл FACS буфера сортировки.
2. Сортировать TEC подмножества через 100 мкМ сопло с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток. Сортировка клеток собирают в 30% (объем / объем) FBS в RPMI-1640). После сортировки клеток делается, центрифуги клетки при 400 мкг, 4 ° С в течение 5 мин и подготовки к последующей анализа.

Результаты

Используя этот протокол, тимус орган был удален из взрослой мыши (раздел 2) и вилочковой суспензии клеток получали, как описано в разделе 3 получены суспензии клеток состояла из тимоцитов, кроветворных стромальных клеток и некроветворных стромальных клеток. CD45 представляет собой гемоп?...

Обсуждение

В протоколе, критические шаги являются подготовка тимуса стромальных клеток (раздел 3) и обогащение ТИК (раздел 4). Настоятельно рекомендуется, что свежий фермент раствор готовят каждый раз и ткань обрабатывают как можно скорее. Для объединенной Thymi, оптимизируя объем раствора фермента ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse EpCAM	eBioscience	XX-5791-YY*	Clone G8.8
Anti-mouse MHC II	eBioscience	XX-5321-YY*	Clone M5/114.15.2
Anti-mouse Ly51	eBioscience	XX-5891-YY*	Clone 6C3
UEA-1	Vector Laboratory	FL-1061
Flow cytometer	BD Biosciences	LSRFortessa
Flow cell sorter	BD Biosciences	FACSAria
FACS tubes	BD Biosciences	352052
Flow cytometry analysis software	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7/9
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.